РОЗРОБКА ЗАСОБІВ СПЕЦИФІЧНОЇ ПРОФІЛАКТИКИ БРУЦЕЛАОВІСНОЇ ТА ХЛАМІДІЙНОЇ ІНФЕКЦІЙ

Краткое содержание

Дисертаційна робота виконана впродовж 2000 – 2005 рр. в лабораторії вивчення хвороб рогатої худоби Національного наукового центру "Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини", а також у господарствах Полтавської і Харківської області.

Виходячи з поставленої мети та вирішення поставлених задач нами вибрано такі основні напрямки досліджень:

·                          теоретично та експериментально обґрунтувати комбіноване щеплення інактивованих вакцин проти бруцелаовісної та хламідійної інфекцій,

·                          розробити технологію виготовлення та випробувати на лабораторних тваринах і вівцях експериментальні серії інактивованої біемульсин-вакцини проти хламідійної і бруцелаовісної інфекцій.

Теоретичне обґрунтування комбінованого застосування щеплень проти хламідійної і бруцелаовісної інфекцій базується на даних літературних джерел та патентах щодо виготовлення комбінованих вакцин, широкого розповсюдження зазначених інфекцій серед вівцепоголів’я у різних країнах світу, зокрема в Україні. Для обґрунтування актуальності та практичної доцільності розробки комбінованого щеплення проти бруцелаовісної і хламідійної інфекцій нами також використано результати епізоотологічного, серологічного, бактеріологічного досліджень на хламідіоз та інфекційний епідидиміт баранів.

Для виконання поставлених завдань в роботі використано:

·                          виготовлені нами за лабораторним регламентом експериментальні серії інактивованої емульсин-вакцини проти інфекційного епідидиміту баранів (Національний науковий центр «Інститут експериментальної та клінічної ветеринарної медицини»), серії 4, 6, 6.1, 7, 7.1;

·                          інактивовану емульсин-вакцину «ЕВАК» проти інфекційного епідидиміту баранів (Всеросійський інститут експериментальної ветеринарії), серія 10;

·                          інактивовану емульсин-вакцину проти хламідійного аборту ВРХ, овець, кіз та свиней ТУ У 10.02.01.270.91 (Сумська державна біофабрика), серії 2, 4;

·                          вакцину проти хламідіозу ВРХ та ДРХ культуральну інактивовану (Північно-Кавказький зональний науково-дослідний ветеринарний інститут, ООО «БЛИЦ»), серія 4;

·                          інактивовану культуральну емульсин-вакцину проти хламідіозу тварин (Всеросійський інститут експериментальної ветеринарії, Армавірська біофабрика), серія 6;

·                          інактивовану вакцину проти хламідіозу овець з масляним ад’ютантом Phylaclam vakcina ad us.vet (inaktivelt, olayjal odjuvalt) (фірма Sanofi), серія Cy.sz: 0103f1;

ад’юванти: Montanide ISA-70 (Франція), масляний ад’ювант «ФГУ ВНИИЗЖ» (Росія, ФГУ «Федеральний центр охорони здоров’я тварин»), штами збудника бруцелаовісної інфекції: B. оvis 67/Б, B. оvis 65939, B. оvis 65 – і, штами хламідій: Chlamydophila abortus Зд 01.10, Зд 01.02, курячі ембріони 6-ти добового віку – 106 шт., лабораторні тварини: морські свинки – 248 гол., білі миші – 20 гол., вівці 41 гол.

Для виготовлення інактивованої емульсин-вакцини проти інфекційного епідидиміту баранів або інактивованої біемульсин-вакцини проти хламідійної та бруцелаовісної інфекції використано вакцинний штам B. оvis 67/Б, що депонований в ДНКІБШМ № 219, патент № 51379 А. Дослідження протективних властивостей вакцин проведено шляхом зараження вірулентними штами B. оvis 65939 – референтний, який отримано з ВДНКІ у 1973 році та штам B. оvis 65 – і епізоотичний, виділений нами в 2000 році від барана. Культурально-біохімічні властивості штамів досліджували згідно методик, рекомендованих ФАО/ВОЗ (1986) та МЕБ (2004).

Морфологічні і тинкторіальні властивості культур B. оvis вивчали під імерсійною системою мікроскопу (´ 90) у мазках, пофарбованих за методом Грама, Козловського. Стабільність штаму і характеристику однорідності колоній у популяції вивчали за допомогою стереоскопу МБС-2 на 3 – 4 - добових агарових культурах, пофарбованих за Уайт-Вільсоном 0,05% розчином кристалвіолету протягом 30 секунд в чашках Петрі. Біологічні властивості визначали за такими показникам: продукція сірководню (H₂S), ріст на твердих поживних середовищах з основним фуксином (1:50000) або тіоніном (1:50000), аглютинація з 0,2 % розчином трипофлавіну, термоаглютинація суспензії бактерій у концентрації 2 Ч 10⁹ м.к./см³ при 90 ⁰С впродовж 45 хвилин. Антигенні властивості досліджували в пластичній реакції аглютинації (РА) із S- та R- бруцельозними сироватками виробництва НВО “Ріверс” та ДП “Ветмедицина” за «Настановою по діагностиці бруцельозу тварин» К., 1998». Постановку РА на скельцях з живими культурами проводили за загально прийнятою методикою з візуальним обліком при косому освітленні знизу від освітлювача ОІ-19 або під стереоскопічним мікроскопом МБС-2 із додержанням правил особистої безпеки.

Постановку РІД проводили за методикою згідно “Настанови по застосуванню набору компонентів для серологічної діагностики інфекційного епідидиміту баранів в реакції імунодифузії”, 1996, з використанням «Набору компонентів для серологічної діагностики ІЕ баранів у реакції імунодифузії» (ТУ У 46.15.127 – 96), виробництва ДП «Ветмедицина» ІЕКВМ. РТЗК з бруцелаовісним антигеном ставили за методикою, яка викладена в “Настанові по діагностиці бруцельозу тварин” (1998) з використанням комерційного набору компонентів для серологічної діагностики інфекційного епідидиміту баранів в РТЗК (ТУ У 46.15.059 – 95), виготовленого в ДП “Ветмедицина”. Реакцію зв’язування комплементу у серологічних дослідженнях на хламідійну інфекцію ставили згідно загальноприйнятої методики, яка викладена в “Настанові по діагностиці хламідіозів сільськогосподарських тварин” (1995) з використанням комерційних наборів із ліофілізованими антигенами й контрольними сироватками, виготовленими на Херсонській біофабриці або ВНИТИБТ, Російська академія сільськогосподарських наук (2002). При постановці серологічних реакцій у своїй роботі ми застосовували сухий комплемент морської свинки і гемолітичну сироватку, виготовлену на ЗАО “Біолек”, м. Харків, та ДП “Ветмедицина”, в робочих титрах згідно попередньої титрації.

Полімеразну ланцюгову реакцію проводили разом з І.М. Ксьонзом (Інститут свинарства ім. Квасневского), ряд дослідів проведено спільно з ООО «Виролла» з використанням набору реагентів «Полімік», призначеного для діагностики хламідіозу людини.

У серологічних реакціях досліджено 5450 проб сироваток крові в 6 - 8 розведеннях з хламідійним, бруцелаовісним та бруцельозним антигенами від тварин різних статево-вікових груп (вівцематок, баранів-плідників, ремонтного молодняку) з 5 господарств. Методики проведення біологічних експериментів на морських свинках та вівцях детально викладені у відповідних розділах результатів власних досліджень.

Статистичну обробку одержаних даних проводили у комп’ютерній програмі «Stat SF», розробленій в ННЦ «ІЕКВМ».

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Клініко-епізоотологічні і серологічні дослідження на хламідійну та бруцелаовісну інфекції вівцепоголів’я ферм. Виділення та ідентифікація збудника хвороби. Проведений ретроспективний аналіз стану відтворення вівцепоголів’я в господарствах Полтавської області за період 2001 – 2005 рр. свідчить про тенденцію різкого зменшення поголів’я овець, на початок 2001 р. поголів’я овець становило 10,4 тис. гол., у 2004 р їх кількість скоротилася на 3,1 тис. гол (29,8 %). Вихід приплоду ягнят на 100 маток в 2001 р. становив 83 %, в 2004 спостерігалося зниження показника отримання приплоду до 68 %.

Нами було досліджено 1360 проб крові з двох вівцегосподарств в Полтавській області на хламідійну та бруцелаовісну інфекцію, які вирощують каракульські породи овець (сокільську та решетилівську). Середній показник отримання ягнят на 100 маток в період з 2001 по 2004 рр. становив в першому господарстві 62 – 68%, в другому 31 – 35%, відповідно. У 2001 р в господарстві № 1 серед дослідженого дорослого поголів’я виявлено позитивно реагуючих на хламідіоз 10,1 % і 9,1 %  серед молодняку віком до 1 року, в другому господарстві позитивні результати отримані у 30,5% маточного поголів¢я та 47,62% молодняку. Серологічним обстеженням 1094 гол. вівцематок та баранів-плідників в господарстві № 3 виявили в РЗК з хламідійним антигеном 204 (25 %) позитивно реагуючих вівцематок, в РТЗК з бруцелаовісним антигеном 45 гол. (4,5 %), одночасно на хламідіоз та інфекційний епідидиміт баранів позитивно реагувало 7,22%. В обстежених отарах протягом багатьох років реєструвалися випадки абортів, народження мертвих і нежиттєздатних ягнят. Проведені нами серологічні дослідження на хламідійну та бруцелаовісну інфекції в 2000 р. вівцепоголів’я (порода прекос) в двох господарства «С» та «І» Харківської області свідчать про поєднаний перебіг цих захворювань: в господарстві «С» з 641 проби від дорослого поголів’я позитивно з бруцелаовісним антигеном в РТЗК реагувало 28 гол. (4,4 %), з хламідійним антигеном в РЗК – 103 гол. (16 %) поєднаний перебіг хламідійної та бруцелаовісної інфекції виявили в 18 гол., в господарстві «І» на інфекційний епідидиміт баранів позитивно реагувало 1,4 %.

Нами виділено культуру хламідій на 6 – 7 - добових курячих ембріонах з абортплоду та лімфатичних вузлів вівцематки, що абортувала з вівцегосподарства № 3. Ізолят Зд 01.02 з абортплоду мав більш високий рівень патогенності. На першому пасажі загибель ембріонів становила 12,5 %, на другому 25,0 % та 83,3 % на третьому. На 4-му пасажі загибель КЕ становила 100 % на 5 – 9 добу після зараження. Ізолят Зд 01.10, виділений з лімфатичного вузла вівцематки, що абортувала, мав дещо нижчі показники патогенності: на першому пасажі загибель ембріонів не відбулася, далі показник загибелі зростав в другому і третьому пасажах 25,0 % та 66,6 %. В четвертому пасажі показник загибелі ембріонів знизився до 20,0%, на п’ятому пасажі загибель досягла 83,3 %. Після зараження білих мишей внутрішньоочеревенно 10 % суспензією інфікованих жовткових міхурів ізоляту Зд 01.02 загинуло 70 %, Зд. 01.10 - 50 % тварин. В мазках-відбитках з селезінки, печінки та нирки, пофарбованих за Романовським-Гімза та Здродовським, виявили внутрішньоклітинні та позаклітинні скупчення елементарних тілець хламідій. При досліджені зразків ізолятів хламідій Зд 01.02 та Зд 01.10 у полімеразній ланцюговій реакції ідентифіковано ДНК хламідій (Chlamydia spp – родинна ДНК) з використанням набору реагентів «Полімік», призначеного для діагностики хламідіозу людини. З надміхуркової залози баранчика з вівцегосподарства «І» нами виділено культуру Br. ovis 65 – і, яка мала типові морфологічні та культуральні характеристики і ідентифікована в пластинчатій реакції аглютинації з R – родо і видоспецифічними бруцелаовісними сироватками. В дослідах на 12 морських свинках після підшкірного зараження в дозах 2 Ч 10⁶ м.к./см³ - 2 Ч 10⁹ м.к./см³ індекс інфікованості становив 62 - 82,2 %.

Виготовлення і порівняльне дослідження антигенності і імуногенності інактивованих вакцин проти інфекційного епідидиміту баранів. За лабораторним регламентом нами виготовлено 5 експериментальних мікросерій інактивованої емульсин-вакцини проти інфекційного епідидиміту баранів з штаму Br. оvis 67/Б. Виготовлені серії інактивованої емульсин-вакцини були стерильними, нешкодочинними, малореактогенними. В дослідах на 54 морських свинках встановлено слабку реактогенність, на місці підшкірного введення вакцин в дозі 0,5 см³ спостерігали незначний набряк та формування гранульом. Імунна відповідь після вакцинації виявлена при дослідженні через 14 діб: після щеплення серії 4 антитіла виявили у 88,6 % тварин у титрі 6,2 ± 1,33 log_2, серії 6 у 2 морських свинок 0,66 ± 0,14 log₂, у серій 6.1, 7 та 7.1 у 100 % тварин у титрі 2,0 ± 0,36 log₂, 2,77 ± 0,34 log₂, 3,44 ± 0,41 log₂, відповідно. На 30 добу після щеплення встановлено зростання титру бруцелаовісних антитіл: 4,8 ± 1,03 log₂, 2,16 ± 0,38 log₂, 3,0 ± 0,53 log₂, 3,77 ± 0,45 log₂, відповідно. У щеплених морських свинок не виявлено антитіл на бруцельоз в пластичній реакції аглютинації з бруцельозним роз бенгал антигеном (РБП), що являється позитивною характеристикою інактивованої емульсин-вакцини проти ІЕ баранів з штаму 67/Б.

Після експериментального зараження щеплених тварин титр антитіл по групах суттєво не змінився, що свідчило про відсутність інфекційного процесу, в контрольних групах виявлено постінфекційний титр антитіл: 3,2 ± 0,69 log₂, 3,33 ± 0,59 log₂ і 1,13 ± 0,15 log₂. Бактеріологічні дослідження лімфатичних вузлів (шийних, пахових, тазового) та селезінки морських свинок через 35 діб після зараження культурою Br. ovis свідчили, що всі морські свинки, щеплені вакциною серії 4 та серій 7 і 7.1, були імунними. Вакцина серії 6 та 6.1 також забезпечила у 100 % щеплених тварин імунітет проти генералізованої експериментальної інфекції але заражаючу культуру Br. ovis виділено з регіонального лімфатичного вузла на місці введення культури у однієї морської свинки з групи. В першій контрольній групі культура заражаючого штаму Br. оvis 65939 виділена в 5 тварин (100 %), індекс інфікованості 16,7 %; в другій - культуру заражаючого штаму Br.оvis 65-і виділено у 83,3 %, індекс інфікованості 27,8 %, в третій - Br. оvis 65-і виділено у 75 % тварин, індекс інфікованості 26,7 %.

Після щеплення морських свинок зарубіжною емульсин-вакциною «ЕВАК» титр бруцелаовісних антитіл на 14 - 30 добу становив 4,67 ± 1,37 log₂. Через 35 діб щеплених та контрольних морських свинок заразили підшкірно вірулентним штамом Br. ovis 65-і в дозі 2 Ч 10⁹ м.к./см³. У групі морських свинок, щеплених вакциною «ЕВАК», бруцелаовісні антитіла встановили в титрі 1,2 ± 0,6 log₂, в контрольній групі – 3,33 ± 0,59 log₂. Бактеріологічні дослідження лімфатичних вузлів та селезінки морських свинок свідчать, що всі морські свинки, щеплені інактивованою емульсин-вакциною «ЕВАК», мали протективний імунітет. В контрольній групі культура заражаючого штаму Br. оvis 65-і виділена у 5 (83,3 %) тварин з індексом інфікованості 27,8 % (Табл. 1).

Дослідження антигенності та імуногенності інактивованих вакцин проти хламідіозу овець. Імуногенні властивості хламідійних вакцин на рівні доклінічних випробувань визначали за серологічними показниками сироватки крові щеплених лабораторних тварин (морських свинок) в реакції зв’язування комплементу. Згідно ТУ У 10.02.01.270.91, хламідійна вакцина вважається імуногенною, якщо на 30 добу після щеплення морських свинок титр хламідійних антитіл ≥ 1:16 виявлено не менше, ніж у 50 % тварин. Нами проведено дослід на 30 морських свинках з двома серіями комерційної вакцини виробництва Сумської державної біофабрики, однією серією вакцини виробництва ООО «БЛИЦ», Російська Федерація та однією серією вакцини виробництва фірми «Sanofi», Угорщина. В групах морських свинок після щеплення ембріональними емульсин-вакцинами проти хламідійного аборту Сумської державної біофабрики та фірми “Sanofi” в дозі по 0,5 см³ підшкірно на 30 добу в РЗК з хламідійним антигеном реагувало 100 % тварин в протективному титрі ³ 1:16, середній титр антитіл 5,8 ± 0,97 log₂ та 5,22 ± 0,64 log_2, відповідно. Після внутрішньошкірного введення 0,5 см³ вакцини проти хламідіозу ВРХ та ДРХ культуральної інактивованої ООО «БЛИЦ» теж реагувало 100 % тварин у протективному титрі ³ 1:16 з середнім показником 5,8 ± 1,24 log₂.