ЭТИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ УСЛОВНО-ПАТОГЕННОЙ МИКРОФЛОРЫ, УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ПРОФИЛАКТИКИ И ТЕРАПИИ ЭНДОМЕТРИТОВ

Краткое содержание

Робота виконувалась у період 2001–2005 рр. у лабораторії вивчення хвороб молодняка ННЦ «ІЕКВМ» та в господарствах Харківської, Житомирської і Полтавської областей. З метою вивчення показників, що характеризують рівень природної резистентності, від корів із різним фізіологічним та клінічним статусом відбирали кров, а також слиз із статевих органів.

Усього від корів відібрано 105 проб крові для біохімічного дослідження, з піхви – 165 проб вмістимого піхви для бактеріологічного дослідження. Піддані імунізації «Вакциною субодиничною інактивованою для профілактики післяпологових ендометритів у корів» 197 корів та від них досліджено проби сироватки крові на наявність антитіл до антигенів мікроорганізмів, що входять до складу препарату. Досліджено 52 проби сироваток крові від імунізованих кролів та 300 проб від білих мишей. Також було виділено та досліджено біологічні властивості 384 культур мікроорганізмів.

Для проведення експериментальних досліджень використано таких лабораторних і сільськогосподарських тварин: безпородні білі миші масою 18–20 г – 2790 голів, кролі-донори – 52 голови, тільні корови – 197 голів, хворі на гострі ендометрити корови – 100 голів, хворі на хронічні ендометрити корови – 74 голови.

Патогенні властивості виділених культур ешерихій, стафілококів, стрептококів та протеїв визначали шляхом постановки біологічної проби на білих мишах. Для цього добовою бульйонною культурою, в об’ємі 0,5 см³, заражали білих мишей (n=840) внутрішньочеревно. Гемолітичні властивості культур мікроорганізмів визначали за наявністю гемолізу еритроцитів на кров’яному агарі.

Токсигенність виділених культур визначали постановкою біологічної проби на білих мишах (n=621) згідно з «Методическими рекомендациями по получению, очистке энтеротоксинов эшерихий и изготовлению антитоксических сывороток» (Харьков, 1995 г.).

Розрахунок показників вірулентності (LD₅₀ та LD₁₀₀) мікроорганізмів після внутрішньочеревного введення здійснювали за допомогою Microsoft Excel, підпрограми Accute LD₅₀ Calc, реалізованої на VBA (Visual Basic for Application), яка базується на методі найменших квадратів пробіт-аналізу.

Імуногенність корпускулярних та субодиничних антигенів визначали в моделі активного захисту мишей (n=300) після дворазової імунізації відповідними препаратами.

Чутливість виділених бактерій до антибактеринів визначали згідно з інструкцією по застосуванню дисків для визначення чутливості до антибіотиків (від 8.07.1986 р.).

Вивчення клінічних і біохімічних показників крові проводили за загальноприйнятими методами. Визначення вмісту гемоглобіну – гемоглобінціанідним методом, кількості лейкоцитів – шляхом підрахунку під мікроскопом у камері Горяєва, кількості еритроцитів – фотоколориметричним методом, вмісту загального білка – рефрактометрично, бактерицидну активність сироватки крові – за методикою Н. І. Максимюка і Л. Я. Телішевської (1995), активність лізоциму – турбідиметричним методом за Перрі у модифікації Х. Я. Гранта із співавт. (1978), перекисну резистентність еритроцитів (ПРЕ) – за методом F.  Jager (1968). Визначення циркулюючих імунних комплексів проводили за методом Ю. А. Гриневича (1962), вмісту серомукоїдів у сироватці крові – за Веймером і Мошиним (1962), виявлення специфічних антитіл проводили за допомогою реакції аглютинації.

Статистичну обробку результатів досліджень проводили з визначенням критеріїв вірогідності за Стьюдентом.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Вивчення розповсюдження різних форм акушерсько-гінекологічних захворювань корів у господарствах Харківської області. Результати аналізу даних клініко-гінекологічних обстежень неплідних тварин показали, що в 317 корів (77,3 %) були функціональні порушення статевих органів, і лише 3 тварини (0,7 %) були віднесені до групи так званого «виробничого браку». Симптоматична неплідність у корів, що обумовлена гострими і хронічними запальними процесами статевих органів, зареєстрована у 90 тварин (22 %).

Серед тварин із функціональними порушеннями, гіпофункція яєчників була виявлена у 194 корів (61,2 %), персистентні жовті тіла – у 100 (31,5 %) і ановуляторні статеві цикли – у 23 корів (7,3 %). У тварин із симптоматичним безпліддям захворювання матки виявлені в 68 корів (75,6 %), з них цервіцити – у 2 (2,2 %), метрити – у 28 (31,1 %), атонія матки – у 6 (6,7 %), сальпінгіти – у 32 (35,6 %). Захворювання яєчників виявлено в 22 (24,4 %) корів, з них оваріїти – у 11 (12,2 %) та кісти яєчників – у 11 (12,2 %).

Бактеріологічні дослідження вмістимого піхви клінічно здорових і хворих на гострі та хронічні ендометрити корів. Результати наших досліджень показали, що на початкових періодах тільності (1–3 міс.) мікробіоценоз піхви представлений шістьма видами мікроорганізмів. При цьому провідне місце відводиться Bifidobacterium sp., Lactobacillus sp. і

Escherichia coli, питома вага яких становила 21,3, 21,3 і 19,1 % культур відповідно. Питома вага інших видів мікроорганізмів коливалась від 6,3 до 17,0 %. У більш пізній термін тільності (3–6 міс.) спостерігається збільшення кількості культур Bifidobacterium sp. і Lactobacillus sp. – до 35,7 %. При цьому відмічали зниження частки інших видів мікроорганізмів. У період глибокої тільності корів (6–9 міс.) мікробіоценоз піхви майже на 91 % складається з лакто- і біфідобактерій.

Від хворих на гострі ендометрити корів (n=60) було виділено 132 культури мікроорганізмів 11 видів: E. сoli – 28 культур (21,2 %), Proteus vulgaris – 37 (28,0 %), Staphylococcus xylosus – 14 (10,6 %), Enterococcus faecalis – 10 (7,6 %), Citrobacter freundii – 8 (6,1 %), Klebsiella pneumonia – 8 (6,1 %), Enterococcus faecium – 8 (6,1 %), Enterobacter sp. – 6 (4,5 %), Candida sp. – 6 (4,5 %), Bacillus sp. – 5 (3,8 %) та Staphylococcus saprophyticus  – 2 (1,5 %).

Від корів із хронічними ендометритами (n=30) було виділено 69 культур мікроорганізмів 10 видів: E. сoli – 21 культура (30,4 %), P. vulgaris – 8 (11,6 %), S. хylosus – 10 (14,5 %), E. faecalis – 6 (8,7 %), S. agalactiae – 6 (8,7 %), C. freundii – 5 (7,2 %), Enterobacter sp. – 4 (5,8 %), S. saprophyticus – 4 (5,8 %), Staphylococcus epydermidis – 4 (5,8 %), Staphylococcus pyogenes – 1 (1,5 %).

Вивчення патогенних властивостей виділених культур мікроорганізмів. Було досліджено патогенні властивості 119 культур мікроорганізмів, виділених від корів, хворих на гострі ендометрити, та 64 культур – від корів, хворих на хронічні ендометрити. Найбільшою патогенністю відзначалась мікрофлора, яку було ізольовано від хворих на гострі ендометрити корів – 44,69±5,41 %, менша кількість культур з ознаками патогенності була ізольована від корів із хронічними ендометритами – 40,06±6,72 %.

Встановлено, що найчастіше ознаки патогенності мали культури ешерихій. При цьому патогенність культур E. coli (n=28), виділених від корів, хворих на гострі ендометрити, встановлено в 67,8 %, в ізолятів (n=21) від корів із хронічними ендометритами – у 38,1 %. Патогенність культур ешерихій, ізольованих від хворих тварин, становила в середньому 52,95±14,85 %.

Культури P. vulgaris (n=37), виділені від хворих на гострі ендометрити корів, були патогенними у 59,4 % випадків, а виділені від корів із хронічними ендометритами (n=8) – у 37,5 %. У середньому патогенні властивості мали 48,45±10,95 % ізолятів P. vulgaris.

Питома вага патогенних культур E. faecalis (n=10), виділених від корів, хворих на гострі ендометрити, дорівнювала 50,0 %, а від корів із хронічними

ендометритами (n=6) – 33,3 %. У середньому патогенні властивості мали 41,65±8,35 % ізолятів E. faecalis.

Культури S. xylosus, виділені від корів, хворих на гострі (n=14) та хронічні (n=10) ендометрити, були патогенними в 42,8 та 80,0 % випадків відповідно.

Патогенність культур мікроорганізмів різних видів (n=27), виділених від корів на 1–3 місяці тільності, досягала 33,3 %. Мікрофлора, яку виділяли від глибокотільних (8–9 міс.) тварин, не мала ознак патогенності.

Вивчення токсигенних властивостей виділених культур. Було досліджено токсигенні властивості 119 культур мікроорганізмів, виділених від корів, хворих на гострі ендометрити, та 54 культур – від корів, хворих на хронічні ендометрити. Серед хворих на гострі ендометрити корів середня кількість культур, що експресують токсини, складала 42,81±8,44 %, а серед тварин із хронічним ендометритом – 33,80±9,26 %.

Встановлено, що в усіх групах обстежених тварин найчастіше токсини виробляли культури E. coli. До того ж, серед культур (n=28), виділених від корів, хворих на гострі ендометрити, спроможність виробляти токсини встановлено в 57,1 % випадків, а серед культур (n=21), виділених від корів із хронічним ендометритом, – у 66,6 %. Питома вага токсигенних ешерихій становила в середньому 61,85±4,75 %.

Культури E. faecalis (n=10), виділені від корів, хворих на гострі ендометрити, виробляли токсини в 70,0 % випадків, а культури, виділені від корів, хворих на хронічні ендометрити (n=6), – у 50,0 %. Питома вага токсигенних культур E. faecalis становила в середньому 60,0±10 %.

Спроможність культур S. xylosus (n=14), виділених від тварин, хворих на гострі ендометрити, продукувати токсини відмічали в 57,1 % ізолятів.

Культури P. vulgaris (n=45), виділені від корів, хворих на гострі і хронічні ендометрити, токсини не виробляли.

Питома вага культур різних видів мікроорганізмів (n=27), виділених від корів на 1–3 місяці тільності та спроможних продукувати токсини, досягала 33,3 %. Усі культури E. faecalis (n=2), виділені від глибокотільних (8–9 міс.) тварин, володіли токсигенними властивостями.

Вивчення гемолітичних властивостей виділених культур. Гемолітичні властивості були досліджені у 105 культур мікроорганізмів, виділених від корів, хворих на гострі ендометрити, та у 54 культур – від корів, хворих на хронічні ендометрити. Середня кількість ізолятів з гемолітичними властивостями, виділених від корів, хворих на гострі ендометрити, становила 26,7±5,33 %, а від тварин із хронічними ендометритами – 46,5±2,67 %.

Культури E. coli (n=28), виділені від корів, хворих на гострі та хронічні ендометрити (n=21), продукували гемолізини в 46,4 та 52,4 % випадків відповідно. У середньому спроможність продукувати гемолізини мали 49,4±3,0 % культур кишкової палички.

Гемолітичну активність культур P. vulgaris, виділених із піхви корів, хворих на гострі (n=37) та хронічні (n=8) ендометрити, встановлено у 18,9 та 50,0 % культур відповідно. У середньому спроможність продукувати гемолізини мали 34,45±15,55 % культур P. vulgaris.

Спроможність культур E. faecalis, виділених від корів, хворих на гострі (n=10) та хронічні (n=6) ендометрити, продукувати гемолізини спостерігали у 40,0 та 50,0 % ізолятів відповідно. У середньому гемолітичні властивості мали 45,0±5,0 % культур E. faecalis.

Гемолітична активність культур різних видів мікроорганізмів (n=24), виділених від корів на 1–3 місяці тільності, становила від 22,2 до 28,5 %. Усі культури E. faecalis (n=2), виділені від глибокотільних (8–9 міс.) тварин, продукували гемолізини.

Вивчення чутливості мікрофлори, виділеної від корів, до антибактеринів. Усього дослідження було проведено на 82 культурах, а саме: 29 культурах E. coli, 27 – P. vulgaris, 14 – E. faecalis, 1 – E. fаесіum, 5 – S. xylosus, 2 – C. freundii, 2 – Enterobacter sp. та на 2 культурах K. pneumoniae.

Від хворих на гострі ендометрити корів досліджено 49 культур мікроорганізмів, з яких стійких до антибактеринів виявлено 25 (51,0 %), помірно-стійких – 14 (28,6 %), чутливих – 10 (20,4 %). Від корів із хронічними ендометритами досліджено 10 культур мікроорганізмів, з яких стійких до антибактеринів було 3 (30 %), помірно-стійких – 2 (20,0 %) і чутливих – 5 (50 %). В ізолятів (n=8) від тільних корів чутливість до антибактеринів встановлено у 5 (62,5 %) культур, помірну стійкість – у 2 (25 %), стійкість – у 1 (12,5 %) культури.

Виділена від корів мікрофлора (n=82) була найбільш чутливою до препарату 5-НОК (група оксихінолонів) – 58,5 %, так само як і до препаратів груп цефалоспоринів і фторхінолонів, чутливість до яких складала в середньому 57,3 та 52,0 % відповідно. Найбільшу стійкість виділені культури мікроорганізмів виявили до препаратів із групи тетрацикліну (71,5 %), пеніциліну (70,1 %) та макролідів (61,0 %), до комбінованих препаратів (50,6 %), ріфампіцину (48,7 %), поліміксину (45,1 %), сульфаніламідів (36,6 %), фторхінолонів (19,7 %), цефалоспоринів (19,0 %) та оксихінолонів (15,9 %).

Таким чином, одержані дані підтверджують етіологічну роль умовно-патогенної мікрофлори в розвитку післяпологових патологій, що й стало підставою для розробки засобів специфічної профілактики цих захворювань.

Розробка та вивчення властивостей вакцини субодиничної інактивованої для профілактики післяпологових ендометритів у корів. Базуючись на результатах вивчення токсигенності, патогенності культур, а також імуногенності токсинів, було відібрано чотири штами: E. сoli № 3, P. vulgaris № 2, S. xylosus № 6, E. faecalis № 14 в якості кандидатів для створення вакцинного препарату.

На першому етапі шляхом вакцинації кролів цільноклітинним препаратом проводили вивчення антигенних властивостей відібраних культур. У подальшому визначали імуногенність створеної вакцини та за допомогою реакції аглютинації (РА) – рівень специфічних антитіл (Ат) у вакцинованих тварин. З метою визначення доз препарату, при яких в організмі тварин максимально виробляються Ат, досліджували вакцинні препарати з різними концентраціями мікробних клітин в сантиметрі кубічному (м. к./см³) – 5,0Ч10⁹, 25,0Ч10⁹, 35,0Ч10⁹, 40,0Ч10⁹ м. к./см³, дворазово з інтервалом 14 діб. Так, рівень протиешерихіозних Ат був максимальним при введенні 25Ч10⁹ м. к./см³ вакцини і складав 4,5 lоg₂ через 14 діб після першої імунізації і 5,4 lоg₂ – після другої. Рівень Ат до антигенів (Аг) штаму P. vulgaris був максимальним при введенні 35,0Ч10⁹ м. к./см³ і складав 3,3 lоg₂ через 14 діб після першої та 4,6 lоg₂ – після другої імунізації. Рівень протистафілококових Ат був найвищим при введенні препарату в об’ємі 35,0Ч10⁹ м. к./см³. При цьому через 14 діб після першого введення рівень Ат складав 4,7 lоg₂, а після другого введення – 5,4 lоg₂. Рівень Ат до Аг E. fаecalis був максимальним при введенні вакцини в об’ємі 35,0Ч10⁹ м. к./см³ і складав через 14 діб після першої вакцинації 4,6 lоg₂ і 5,2 lоg₂ – після повторної імунізації. У контролі рівень Ат вірогідно не відрізнявся від таких до імунізації.

На наступному етапі досліджень було виготовлено два зразки імунізуючого препарату: корпускулярний, до складу якого входили інактивована бактеріальна маса вищезазначених штамів та гідроксал і субодиничний, до складу якого входили анатоксини зазначених вище штамів і гідроксал. Дворазове введення лабораторним тваринам зразків вакцини забезпечувало створення імунного стану різного рівня при контрольному зараженні їх летальними дозами збудників Е. coli № 3, P. vulgaris № 2, S. xylosus № 6, E. fаecalis №14 (табл. 1).

Отримані дані свідчать про певну перевагу імуногенних властивостей субодиничного зразка препарату (№ 2). Так, дворазова вакцинація препаратом № 2 викликала несприйнятливість тварин до зараження дозою 5LD₁₀₀ в середньому в 50 % тварин при 100 % загибелі тварин у контрольній групі. При застосуванні корпускулярного препарату (№ 1) відсоток захисту тварин складав 27,5 %, що майже вдвічі менше за ефективність субодиничного зразка вакцини.