МОЛЕКУЛЯРНО-БІОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ШТАМІВ ВІРУСУ НЬЮКАСЛСЬКОЇ ХВОРОБИ, ВИДІЛЕНИХ В УКРАЇНІ, ТА УДОСКОНАЛЕННЯ ДІАГНОСТИКИ

Краткое содержание

Представлена робота виконувалася як самостійний розділ завдання 07 ”Розробити та впровадити комплексну систему діагностики, терапії та профілактики хвороб птиці” в 2002-2005 роках, згідно тематичних планів ІЕКВМ, затверджених Українською академією аграрних наук.

В основу роботи покладені матеріали власних досліджень, проведених у птахогосподарствах, розміщених на території України, у лабораторії вивчення хвороб птиці ІЕКВМ УААН та лабораторії молекулярної біології Всеросійського науково-дослідного інституту захисту тварин Міністерства сільського господарства Російської Федерації (ВНДІЗТ МСГРФ).

При виконанні дисертаційної роботи у серологічних реакціях (РЗГА, РНГА, ККРА та ІФА) було досліджено 1700 проб сироваток крові птиці; для ізоляції, ідентифікації, пасажування та визначення біологічних властивостей вірусів використано 850 курячих ембріонів; для біопроби, імунізації, визначення ІІЦП та ВВІП використано 320 курчат, 40 перепелят та 5 нутрій.

Визначення поширення ньюкаслської хвороби в птахогосподарствах проводили шляхом аналізу епізоотичних ситуацій з урахуванням клінічних ознак хворої птиці, даних серомоніторингу та проведення лабораторних досліджень, спрямованих на індикацію та ідентифікацію збудника захворювання.

Ступінь напруженості епізоотичного процесу визначали на основі проведеного аналізу показників захворюваності, смертності, летальності в інтенсивних показниках за методикою І.А. Бакулова та ін., 1979 р.

Епізоотологічні дослідження включали: вивчення інфекційного процесу, джерел збудника, механізму передачі та дію вірусу на організм курчат. Виявляли ступінь поширення, динаміку загибелі, епізоотологічне значення факторів передачі збудника хвороби.

Серологічні дослідження проводили в крово-крапельній реакції аглютинації (ККРА), реакції затримки гемаглютинації (РЗГА), реакції непрямої гемаглютинації (РНГА) з використанням наборів еритроцитарних діагностикумів, виготовлених в лабораторії вивчення хвороб птиці ІЕКВМ УААН, за загальноприйнятими методиками, та за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА) при застосуванні діагностичних наборів фірм «Biochek» та «IDEXX». В серологічних реакціях досліджено 1700 проб сироваток крові з виведенням середньо-геометричного титру специфічних антитіл від курей різного віку. На підставі отриманих даних проведено аналіз тенденцій динаміки серопозитивності щодо НХ в залежності від вибраної вакцини, схеми її застосування, віку курчат та спрямованості технології.

Ізоляцію збудників захворювання проводили з кісткового і головного мозку, трахеї, легенів, залозистого шлунку, селезінки, відібраних від клінічно хворої та загиблої птиці. Разом з патологоанатомічними дослідженнями трупів проводили бактеріологічні дослідження, для чого робили висіви на прості та елективні середовища: МПА, МПБ, Сабуро, Ендо та Едварда.

Виділення вірусу здійснювали на 9 та 11-добових курячих ембріонах, що отримували від благополучного щодо НХ стада, невакцинованого проти інфекційних захворювань. Суспензію з відібраних органів готували на стерильному фізіологічному розчині NaCl (ФР) (рН 7,2-7,4) в співвідношенні 1:10 з додаванням антибіотиків (2000 ОД/см³ бензилпеніциліну натрієвої солі, 200 мг/см³ стрептоміцину сульфату, 0,25 мг/см³ гентаміцину сульфату і 5000 ОД/см³ ністатину). Зараження в алантоїсну порожнину проводили за загальноприйнятою методикою (Сюрін В.М., 1991).

Індикацію гемаглютинуючої активності отриманої алантоїсної рідини проводили в реакції гемаглютинації (РГА) з 1% суспензією еритроцитів півня на ФР. Титром вірусу вважали його максимальне розведення, при якому відбувалась повна аглютинація еритроцитів, що відповідало 1 гемаглютинуючій одиниці (1 ГАО).

Ідентифікацію вірусу проводили в реакції затримки гемаглютинації (РЗГА), реакції нейтралізації (РН) на курячих ембріонах з позитивною до ВНХ сироваткою, також використовували метод біопроби на сприйнятливих до НХ біо-системах.

Реакцію нейтралізації (РН) проводили з постійним розведенням сироватки та різними дозами вірусу, феномен нейтралізації встановлювали по відсутності загибелі ембріонів, нейтралізуючу активність сироватки визначали обчисленням індексу нейтралізації за Рідом і Менчем.

Біопробу проводили на курчатах віком 40 діб (10 голів курчат для постановки біопроби одного ізоляту вірусу), які не мали специфічних антитіл до ВНХ. Курчат інфікували внутрішньом’язово, враховували зміни клінічного стану, патологоанатомічні ознаки та дані наступних лабораторних досліджень (серологічні реакції та реізоляція збудника). Термін спостереження за курчатами становив 5 діб.

Крім польових ізолятів у дослідженні використовували вакцинні штами ВНХ «Clone 30», фірми «Intervet», Голландія; «Vitapest L», фірми «Ceva», Франція; ізолят ВНХ «БЧ», одержаний від невакцинованих проти НХ індичок (Герман В.В., 1967), штами ВНХ «Київ» та «Покров», ізольовані та ідентифіковані лабораторією вивчення хвороб птиці ІЕКВМ.

Очистку та концентрацію вірусу НХ для імунізації, штам «Clone 30», проводили методом центрифугування в 20% розчині сахарози.

Індикацію та чистоту вірусу визначали методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та електронної мікроскопії. Для останнього було застосовано метод негативного контрастування вірусних частинок нейтральним 10% розчином фосфорно-вольфрамової кислоти і вольфрамовокислого натрію.

Інактивацію вірусу НХ проводили шляхом додавання у вірусовмісну рідину аміноетиленіміну (АЕЕІ) у 0,1% концентрації, з наступною інкубацією в термостаті протягом 24 годин при температурі +37^оС. Повноту інактивації контролювали титруванням на 11-добових курячих ембріонах, згідно з загальноприйнятою методикою.

Вірусоспецифічні сироватки отримували від 5 голів імунізованих нутрій віком 270-300 діб, масою 4,5-5 кг, та 10 голів курей, у віці 90-100 діб, масою 1,2-1,5 кг. Імунізацію проводили ін’єкціями очищеного концентрату вірусу НХ, внутрішньом’язово та підшкірно триразово з тижневим інтервалом у об’ємі 0,5 см³, 1,5 см³ та 2,5 см³.

Визначення індексу інтрацеребральної патогенності (ІІЦП) ізолятів вірусу НХ проводили на добових курчатах та 14-добових перепелятах, індекс внутрішньовенної патогенності (ВВІП) визначали на 6-тижневих курчатах, і середній час загибелі ембріонів (СЧЗ) – шляхом інфікування 9-добових курячих ембріонів, як рекомендовано інструкцією щодо діагностики НХ МЕБ (Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals, CHAPTER 2.1.15., Bul. O.I.E., 2004.).

Дослідження літичної дії штамів ВНХ проводили на клітинній культурі FLK-92, культурі клітин нирки вівці, яку було отримано у 1973-1974 роках Van der Maaten у США (National Animal Disease Center, Ames, Iowa). Культура FLK-92 була люб’язно надана нам науково-виробничою лабораторією ІЕКВМ УААН. Клітини культивували у живильних середовищах «Ігла» і «199» у рівних об’ємах з 10% сироватки ВРХ при температурі +37^оС, рН 7,2-7,4. Посівна концентрація складала 80-125 тис. клітин у 1 см³, у флакон вносили 100 см³ суспензії клітин. На третю добу культивування, при виповненні клітинного моношару, у флакони з культурою вносили розведену 10^-3 вірусутримуючу рідину в об’ємі 1 см³ штамів ВНХ UA/Keg/ch/03, UA/Kup/ch/03, UA/Cirk/ch/03, UA/Lug/ch/03 та «Clone 30». Після інфікування культуру інкубували протягом 5 діб при температурі +37^оС. Препарати фарбували 10% спиртовим розчином метиленового синього протягом 10 хв. та проводили мікроскопію трьох різних полів зору кожного препарату, культуральну рідину досліджували у РГА з 1% суспензією еритроцитів півня на ФР.

Зворотньо-транскриптазну полімеразну ланцюгову реакцію (ЗТ-ПЛР) та секвенування геному штамів вірусу НХ проводили в лабораторії молекулярної біології ВНДІЗТ МСГРФ за методичними вказівками, розробленими ВНДІЗТ, на основі методики по індикації геному та штамової диференціації ВНХ методом ПЛР та секвенування гену F0, 1997 р.

Нуклеотидну послідовність фрагменту F0 гену визначали методом прямого секвенування ампліфікованих фрагментів за допомогою набору “fmol DNA Sequencing System” (Promega, США). Аналіз нуклеотидних і відповідних їм амінокислотних послідовностей проводили, використовуючи пакет прикладних програм SeqProgs (Data handling for molecular epidemiology), версія 1.0 (N.J. Knowles, IFAN, Великобританія, 1996 р.).

Цифрові кількісні дані, одержані в результаті проведених досліджень, опрацьовували методом математичної статистики з обчисленням середніх арифметичних величин, ступеня достовірності показників та кореляційного аналізу (Сепетліев Д., 1968).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Моніторинг епізоотичної ситуації щодо НХ у птахогосподарствах України. Проведення аналізу даних ветеринарної статистики на ньюкаслську хворобу надало змоги відмітити, що з 1996 року в Україні не було зареєстровано спалахів захворювання на НХ, що, очевидно, пов’язано з проведенням епізоотологічного моніторингу в промислових птахогосподарствах, де було застосовано оптимальні заходи щодо профілактики захворювання на НХ відповідними службами та постійним контролем з боку Державного департаменту ветеринарної медицини України. Але, як показали дослідження, проведення таких заходів у промислових птахокомплексах та птахофабриках, не гарантувало виключення циркуляції штамів вірусу, в тому числі високовірулентних, серед невакцинованої дикої, синантропної та, особливо, сільськогосподарської птиці, що утримується на дрібних присадибних та фермерських птахогосподарствах, де не дотримуються ветеринарно-санітарні правила та вимоги щодо комплектації та утримання птиці.

Вивчення епізоотичної ситуації у птахівничих господарствах України дозволило дійти до висновку, що ньюкаслська хвороба є досить актуальною проблемою і потребує більш детального вивчення не тільки на підставі серологічного моніторингу, а й на дослідженнях по ізоляції збудників з подальшим вивченням їх властивостей. Така вимога до вивчення епізоотичної ситуації була зумовлена змінами у кількості птиці у регіонах, поширенням контингентів вакцинованої і невакцинованої проти НХ птиці.

З 2002 по 2005 роки був проведений імунологічний моніторинг щодо НХ різновікової птиці у 28 птахогосподарствах. Розшифровку імунограм проводили з урахуванням рівня діагностичного титру антитіл 3 log₂ та більше, кількості реагуючої птиці та її віку.

У птиці усіх досліджуваних господарств, з яких 22 – яєчного напрямку виробництва, та 6, що спеціалізувались на вирощуванні курчат-бройлерів, були виявлені специфічні антитіла до ВНХ. Спираючись на дані серологічного моніторингу, було встановлено, що досліджувана птиця мала груповий захист проти НХ (>80%), а у стадах птиці, що його не мали (<80%), була строкатість титрів специфічних антитіл (лише у 8% випадків), яка після вакцинації (ревакцинації) проти НХ поголів’я зникала, а птиця набувала групового захисту.

За даними аналізу, у птахогосподарствах застосовувалися різні програми вакцинопрофілактики НХ. В залежності від спеціалізації господарств, віку та імунного статусу птиці, використовували різноманітні специфічні вакцинні препарати для імунопрофілактики НХ, у більшості випадків лентогенного та асимптоматичного патотипів вірусу: інактивована емульгована вакцина «Nobilis IB+ND+EDS», жива ліофілізована вакцина «MA 5+Clone 30», жива ліофілізована вакцина «Nobilis ND Clone 30», виробництва фірми «Intervet», Голландія; інактивована емульгована вакцина «Таловак 303» проти НХ, ІБК та СЗН-76, фірма «TAD», Німеччина; жива ліофілізована вакцина проти НХ «Vitаpest L», фірма «Ceva», Франція, жива ліофілізована та інактивована масляна вакцини проти НХ, штам «Ла-Сота», ВНДІЗТ, Росія; жива ліофілізована вакцина проти НХ, штам «Ла-Сота», Сумська біофабрика, Україна.

Серологічний моніторинг птиці приватних фермерських та присадибних птахогосподарств Харківської, Луганської, Сумської та Дніпропетровської областей з невеликою кількістю птиці виявив, у більшості випадків, відсутність групового захисту проти НХ та строкатість титрів специфічних антитіл. В цих господарствах практично не застосовувалася вакцинопрофілактика НХ, а коли застосовувалася, то мала нерегулярний характер та не супроводжувалася наступним сероконтролем захисту проти НХ.

При підозрі щодо захворювання птиці на НХ було досліджено 6 неблагополучних фермерських птахогосподарств Харківської, Луганської та Сумської областей, де було здійснено ізоляцію збудників захворювання. Відмічено сезонність прояву у курей клінічних ознак ньюкаслської хвороби, що спостерігалось у зимовий період, вік захворілої птиці становив 28-180 діб, захворюваність та смертність сягали 80-100%. Захворіла птиця, у більшості випадків, не вакцинувалася проти НХ та інших інфекційних хвороб. Отримані дані епізоотологічних обстежень птахогосподарств, клінічного стану птиці, картина патологоанатомічних розтинів та ізоляція вірусів дали можливість віднести їх до вірогідних ізолятів ВНХ, яким було дано ідентифікаційні назви: UA/Bor/ch/03, UA/Poc/ch/03, UA/Kup/ch/03, UA/Lug/ch/03, UA/Cirk/ch/03 і UA/Keg/ch/03, та продовжити роботу для їх чіткої ідентифікації та вивченню властивостей.