ІМУНОСТИМУЛЯЦІЯ КУРЧАТ ЕКСТРАКТОМ ЛІМФОЇДНИМ ПТАХІВ-РЕКОНВАЛЕСЦЕНТІВ ПРИ ЩЕПЛЕННІ ПРОТИ НЬЮКАСЛСЬКОЇ ХВОРОБИ

Краткое содержание

Представлена робота виконувалась як самостійний розділ теми ХДЗВА „Визначення деяких імунологічних показників птиць та вживання імуностимуляторів виготовленних з лімфоїдної тканини”

Робота виконувалася на кафедрі мікробіології і біотехнології та на базі кафедри анатомії і гістології Харківської державної зооветеринарної академії, в лабораторії біохімії ННЦ „Інституту експериментальної та клінічної медицини” та в інституті медичної радіології АМН України.

Для виготовлення ЕЛПР застосовували  лімфоїдні органи: тимус, бурсу Фабриціуса та селезінку.

Матеріал відбирали під час забою птиці на конвеєрі. Відібраний матеріал зберігали в морозильній камері холодильника як сировинний матеріал.

Для виготовлення ЕЛПР лімфоїдні органи були відібрані в загальній кількості від 900 забитих бройлерів.

При вивченні властивостей отриманого ЕЛПР та при визначенні його імуностимулюючої ефективності проводились експериментальні дослідження в загальній кількості на 151 курчаті.

В умовах виробництва дослідження було проведено на 500 курчатах, вакцинованих проти ньюкаслської хвороби.

Реакцію гемаглютинації (РГА) та реакцію затримки гемаглютинації (РЗГА) проводили за загальновідомими методиками. У РГА визначали титри вірусу, а в РЗГА – титри антигемаглютинінів.

Серологічні дослідження проводили при визначенні рівня поствакцинального імунітету після щеплення вірус-вакциною „Ла-Сота” проти ньюкаслської хвороби.

Визначення імуноглобулінів основних класів (А, М, G) у сироватці крові проводили за методом G. Mancini простої радіальної імунодифузії в гелі. У дослідах використовували Bactoagar typ USY (Німеччина), еталонні та моноспецифічні сироватки проти Ig птахів. Еталонні сироватки відповідали світовим стандартам.

Загальний рівень циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) та їхній фракційний склад за молекулярною масою визначали методом преципітації в розчині поліетиленгліколя з молекулярною масою 6000 Дальтон за М.Digeon et al. у модифікації Г. Фримеля (1987).

Рівень серомукоїдів визначали турбідиметричним методом за В.С. Калашниковим.

Бактерицидну активність сироватки крові визначали за оптичною густиною м’ясо-пептонного бульйону (МПБ) при рості в ньому мікробів з додаванням та без додавання досліджуваної сироватки. Для постановки реакції використовували 24-годинні бульйонні культури E. coli штаму 0111. Реакцію ставили за загально прийнятою методикою.

 Для визначення лізоцимної активності використовували ацетоновий порошок культури Micrococcus lysodeіcticus, штаму 2665.

 Імуноморфологічні дослідження проводилися на макроскопічному та мікроскопічному рівнях.

При макроскопічному дослідженні проводили огляд піддослідних тварин і внутрішніх органів. Розраховували індекси тимуса, бурси Фабриціуса та селезінки.

На мікроскопічному рівні імуноморфологічні дослідження проводили із застосуванням гістологічних досліджень та морфометричних методів.

Гістологічні дослідження проводили на кафедрі анатомії та гістології ХДЗВА та у відділі морфології Харківського науково-дослідного інституту медичної радіології.

Досліджували тимус, бурсу Фабриціуса та селезінку. У деяких випадках досліджували сліпі відростки кишківника та печінку. Відібраний матеріал фіксували 10%-им нейтральним формаліном та рідиною Карнуа. Готували парафінові зрізи, проводили загальне фарбування гематоксилін-еозином та фарбували за Браше для виявлення РНК.

Морфометричними вимірами бурси Фабриціуса у п’яти найбільш великих лімфоїдних вузликах визначали середню товщину кіркового шару шляхом підрахунку кількості рядів клітин у широкій та вузькій його частинах.

Підраховували морфо-функціональний потенціал (МФП) лімфоїдних вузликів шляхом множення довжини лімфоїдних вузликів на ширину їхнього кіркового шару з подальшим сторазовим зменшенням результату.

При імуноморфологічному дослідженні тимусу враховували розвиненість кіркового шару. Для цього обчислювали співвідношення товщини мозкової речовини з товщиною кіркового шару з обох сторін часточки по її середині. Отримували мозково-кіркове співвідношення (МКС).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХНІЙ АНАЛІЗ

Обґрунтування виготовлення ЕЛПР. В умовах широкого поширення імунодефіцитів необхідна імунологічна реабілітація із застосуванням стимуляторів імунокомпетентної системи. У медичній та ветеринарній практиці широко застосовують Т-активін, який готують з лімфоїдної тканини тимусу теляти в умовах складної заводської технології.

Нами було розроблено більш просту технологію виготовлення імуностимулятора пташиного походження не лише з тимусу, а й з бурси Фабриціуса та селезінки.

Технологічна схема виготовлення та біологічного контролю ЕЛПР. Сировину для виготовлення екстракту одержували від клінічно здорових птахів під час забою. Відбирали тимус, бурсу Фабриціуса і селезінку. Відібраний матеріал звільняли від сполучнотканинних капсул, плівок, жирових накопичень і пропускали через електром’ясорубку. Потім додатково подрібнювали гомогенізатором до повної однорідності одержаної маси, яка набувала консистенції пасти. З метою руйнування клітин для одержання більш насиченого екстракту проводили заморожування за мінусової температури (-12-15⁰ С) протягом 8-12 годин та відтавання у термостаті за температури 37⁰ С.

Гомогенат лімфоїдної тканини зважували. До нього додавали виготовлений забуферений фізіологічний розчин рН 7,4 у співвідношенні 1:9, періодично  перемішували і витримували у холодильнику 10 – 12 години за t⁰ +4⁰С. У такий спосіб проводили екстрагування лімфоїдної тканини із одержаних лімфоїдних органів. Для видалення клітинного детриту з одержаної суспензії застосовували центрифугування при 5000 об/хв упродовж 10 хв. у великих центрифужних стаканах. Після цього надосадкову рідину декантирували і використовували далі як екстракт лімфоїдної тканини.

Консервація одержаного екстракту проводилася шляхом додавання формальдегіду з кінцевою концентрацією 0,125%.

Екстракт стерилізували в два етапи. Спочатку піддавали стерилізуючій фільтрації крізь систему предфільтр „Startopor” (порозність 1,2 нм), фільтр „Sartobran” (порозність 0,2 нм), а потім опромінювали ультрафіолетом.

Після стерилізації та консервації екстракт розфасовували у флакони над полум’ям спиртівки в умовах стерильного боксу по 200, 100 або 50 см³.

Укупорені флакони закривали ковпачками з алюмінієвої фольги, закатували та етикетували. Екстракт зберігали в затемненому прохолодному місці за t⁰ +2–20⁰С. Термін придатності екстракту – 6 місяців.

Виготовлений ЕЛПР піддавали контролю на бактеріальну контамінацію шляхом висіву на поживні середовища. Вірусну контамінацію визначали на курячих ембріонах, яким вводили екстракт і перевіряли на наявність змін.

Крім того, випробовували екстракт на нешкідливість із використанням білих мишей, яким його вводили інтраперітонеально. Пірогенність оцінювали на кролях, яким ЕЛПР вводили внутрішньовенно з урахуванням результатів за показниками температури тіла тварин.

ЕЛПР досліджували на вміст загального білку за методом Біуретта, а також визначали рН та фізичні якості екстракту.

Визначення оптимальної імуностимулюючої дози ЕЛПР. Оптимальну дозу визначали в межах 0,1-1,0 см³ на курчатах двотижневого віку при ентеральному введенні.

Встановлено збільшення показників із збільшенням дозування. Мінімальні дози 0,1 та 0,3 см³ на голову викликали незначні збільшення у вмісті імуноглобулінів і збільшення індексів тимусу, селезінки і бурси Фабриціуса. Доза 0,5 см³ на голову значно відрізнялась у бік збільшення і досягала показників відповідно: рівень IgG сягав 8,03±0,036 мг/см³ (Р<0,001); IgM – 1,64±0,04 мг/см³ (Р<0,001), IgA – 0,52±0,01 мг/см³ (Р<0,001). Збільшення дози до 0,7 та 1,0 см³ на курча викликало подальше підвищення цих показників, відповідно: IgG 8,08±0,05 мг/см³ (Р<0,001) та 8,10±0,03 мг/см³ (Р<0,001); IgM 1,67±0,04 мг/см³ (Р<0,001) та 1,67±0,05 мг/см³ (Р<0,001), та IgA 0,54±0,01 мг/см³ (Р<0,001) та 0,54±0,012 мг/см³ (Р<0,001).

Величина індексів тимусу, бурси Фабриціуса та селезінки також збільшувались пропорційно до дози екстракту. Найбільшими ці показники були відмічені у курчат, які отримували максимальну дозу ЕЛПР. У четвертій та п’ятій групах показники були дещо нижчими, а різниця коливалася в межах статистичної недостовірності.

Проведеними дослідами встановлено позитивний вплив імуностимулятора ЕЛПР на продуктивність курчат. Приріст живої маси піддослідних курчат корелював зі збільшенням дози застосованого імуностимулятора.

Помітне підвищення показників відмічено зі збільшенням дози, починаючи з дози 0,5 см³.