ЕПІЗООТОЛОГІЧНИЙ МОНІТОРИНГ ТА РОЗРОБКА СЕРОЛОГІЧНОЇ ДІАГНОСТИКИ ІЄРСИНІОЗУ ТВАРИН

Краткое содержание

Роботу виконано в лабораторії вивчення хвороб рогатої худоби ННЦ „Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини” і Сумському національному аграрному університеті впродовж 1985–2005 рр. Досліджена  ієрсиніозна інфекція у великої і дрібної рогатої худоби, свиней, коней, що утримувалися в господарствах різної форми власності України, м’ясоїдні (собаки, коти), які належали власникам із міст Суми, Одеса і Київ, а також лабораторні тварини. Бактеріологічному дослідженню були піддані 272 матеріали [органи загиблих і вимушено забитих тварин, абортовані плоди, вагінальний слиз (тампони) корів з дисфункцією відтворення, глотковий слиз (тампони), сперма биків-плідників, фекалії].

Виділення ієрсиній здійснювали з використанням методу „холодового збагачення” в фосфатно-буферному розчині з рН 7,2-7,4 (Peterson J.S., Cook R., 1963). Накопичення ієрсиній здійснювали протягом 15 діб з періодичними висівами (3-4 рази) на середовище Ендо. Попередньо матеріал обробляли 0,5%-им розчином їдкого калію на 0,5%-му розчині натрію хлориду. Лужну обробку проводили в лунках полістеролових пластинок, оброблених етиловим спиртом 70є. Засів проводили штрихом з відривами петлі. Посіви інкубували при 25єС.

З метою ретроспективного вивчення розповсюдженості ієрсиніозної інфекції у сільськогосподарських і свійських тварин було досліджено 4819 сироваток крові тварин різних видів і вікових груп. Дослідження проводили за загальноприйнятою методикою в реакції аглютинації з формолантигенами, які виготовлені  нами з референтних штамів Yersinia enterocolitica сероваріантів 03, 06.30, 09. Підставою для вибору сероварів ієрсиній були повідомлення Г.С.Андрєєвої з співавторами (1985)  про циркуляцію цих сероварів  Yersinia enterocolitica на території України. Антигени виготовляли за способом, запропонованим Дунаєвим В.І. (1985).

Для дослідження сироваток крові тварин в реакції аглютинації використовували антиген в кінцевій концентрації бактерій 10⁹ м.к. в 1мл. Титр антитіл 1:200 вважали діагностичним. Реакцію аглютинації і реакцію зв’язування комплементу з єдиним бруцельозним антигеном проводили відповідно до загальноприйнятої методики (Настанова по діагностиці бруцельозу тварин, 1998 р.).

Для постановки РНГА використовували діагностикум кишково-ієрсиніозний еритроцитарний антигенний серотипів 03 і 09 виробництва підприємства по виготовленню бактерійних препаратів Санкт-Петербурзького НДІ вакцин і сироваток.

В ієрсиній вивчали: тинкторіальні властивості, визначали рухливість при 25є і 37єС, ферментацію лактози, глюкози, маніту, сорбіту, мальтози, рамнози, рафінози, арабінози, ксилоли, визначали здатність утворювати індол і сірководень, розріджувати желатину, встановлювали наявність оксидази, каталази, уреази, орнітиндекарбоксилази, фенілаланіндезамінази, здатність утворювати газ на середовищах з вуглеводами, реакцію Фогес-Проскауера при 25є і 37єС і з метиловим червоним, здатність до росту на цитратному агарі Симонса.

Належність виділених нами ізолятів ієрсиній до певного серотипу визначали за допомогою реакції аглютинації на скельцях з гіперімунними сироватками, що були отримані з лабораторії пошукових досліджень ЦНДІ епідеміології МОЗ Росії. Крім того гіперімунні сироватки були виготовлені нами з крові дослідних кроликів і баранів.

 Гематологічні дослідження проводили згідно з методиками, які викладені в книзі „Клиническая лабораторная диагностика в ветеринарии” (М.: Агропромиздат, 1985).

Методом паперових дисків визначали чутливість виділених і референтних штамів до 38 антибіотиків із групи  пеніцилінів, цефаспоринів,  аміноглікозидів, макролідів та тетрациклінів.

Зараження лабораторних тварин проводили відповідно до методик (Западнюк И.П. и соавт. „Лабораторные животные”.- К.: Вища школа, 1983).

Дозу зараження добовою культурою збудника визначали шляхом десятиразового розведення 0,1 мл культури в 10 мл ізотонічного розчину натрію хлориду з подальшим висівом 0,1 мл суспензії на чашки Петрі з МПА і підрахунком кількості колоній в 1 мл.

Сироватку молока і молозива для РА отримували шляхом додавання кристалічного натрію цитрату в кінцевій концентрації 3%. Після чого суміш витримували в холодильнику 30-40 хвилин і центрифугували при 4000 обертах впродовж 15 хвилин. Надосадову рідину досліджували  в РА в різних розведеннях.

Гістоморфологічні зміни досліджувалися в  парафінових зрізах тканин різних органів, забарвлених гематоксилін-еозином, карміном за Бестом і виготовлених за загальноприйнятою методикою (Меркулов Г.А. „Курс патогистологической техники”.- Л.: Медицина, 1969).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Серологічні дослідженння великої рогатої худоби на ієрсиніоз і хламідіоз   у проблемних щодо відтворення тварин господарствах. У лабораторії вивчення хвороб рогатої худоби ННЦ „Інститут  експериментальної і клінічної ветеринарної медицини” впродовж 1986-1990 рр. проводилися  серологічні  дослідження тварин на хламідіоз і ієрсиніоз у  комплексах України по виробництву молока, де спостерігали аборти в корів і нетелів, мертвонародження і народження нежиттєздатного молодняка. За нашою участю були проведені серологічні дослідження  з хламідійними й ієрсиніозними антигенами 7094 сироваток крові великої рогатої худоби різних вікових груп. Позитивну реакцію на хламідіоз в РЗК визначали в межах від 3,5 до 58,7%. Крім того були досліджені  сироватки 258 корів і нетелів, в яких реєстрували аборти, з 26 господарств, що надійшли з лабораторій ветеринарної медицини різних регіонів України для уточнення діагнозу на хламідіоз і бруцельоз. Хламідійні антитілі були виявлені у тварин з 20 господарств (57 голів або 22%). Також було серологічно досліджено сироватки крові 35 биків-плідників з 9 господарств і 2 племоб’єднань, 1945 сироваток від корів, нетелів і телиць парувального віку з 34 господарств, які досліджувалися в лабораторіях ветеринарної медицини в зв’язку з плановими дослідженнями на бруцельоз і давали сумнівні або різного рівня позитивні реакції. Крім того проводили дослідження сироваток крові телят хворих на бронхопневмонію, ентерити, діарею, кон’юнктивіти, запалення суглобів. Відсоток позитивно реагуючих сироваток від хворих телят склав 20,7%.

Аналіз результатів епізоотологічних даних  і проведених нами лабораторних досліджень показав, що наявність абортів серед великої рогатої худоби не була пов’язана з бруцельозом.

Отримані результати  показали: як серед корів і нетелів, які абортували, так і серед хворих телят існує значна група хворих тварин з невстановленим етіологічним фактором. У зв’язку з цим нами були проведені додаткові дослідження сироваток крові тварин, що абортували, з ієрсиніозними формолантигенами, що були виготовлені в лабораторії вивчення хвороб рогатої худоби ННЦ „ІЕКВМ”. Усього було досліджено 525 проб сироваток крові, у тому числі 449 від корів, 30 – від свиноматок і 46 – від вівцематок. При дослідженні сироваток крові корів  антитіла в титрі 1:200 виявили до серовару 03  у 10%,  до  сероварів 09 і 06.30 у  13,1 і 20,8% відповідно. У титрі 1:400 з антигеном 03 реагувало 6,6% тварин, а з антигенами сероварів 09 – 15,4% і з 06.30 – 14,0%. У титрі 1:800 з антигеном 03 реагувало 0,9% сироваток, з 09 – 3,2%, з 06.30 – 2,3%  сироваток.

Сироватки крові від свиноматок, у яких були зареєстровані аборти, реагували  в титрі 1:200 з антигеном  серовару 09 в 80% випадках, з сероваром 06.30 – у 30%, а з сероваром 03 - у 10%. В титрі 1:400 реагували 6,7% сироваток з антигеном серовару 09 і  10 % - з сероваром 06.30, а з сероваром 03 позитивних реакції у цьому титрі не виявили.

Серед досліджених сироваток крові  вівцематок позитивні реакції виявили  з антигеном сероваріанту 06.30 (в титрах 1:200 – 17,4%, 1:400 – 32,6%, 1:800 – 23,9%, 1:1600 – 4,3%), а з сероваріантом 03 реагувало 50% сироваток лише в титрі 1:400, з сероваром 09 антитіл у розведенні сироватки 1:200 не виявили.

Порівняльне вивчення імунологічних зрушень в сироватках крові в РА, РНГА, РЗК. При проведенні порівняльної оцінки щодо визначення ефективності використання РА і РНГА паралельно досліджені 294 сироватки від корів, нетелів, биків, телят, свиноматок, кнурів, кобил, лошат, овець, баранів, які отримали з 13 господарств 7 областей України. Узагальнений аналіз отриманих даних виявив, що суттєвої різниці при використанні цих двох серологічних реакцій для виявлення  ієрсиніозних антитіл не встановлено, в окремих випадках в РА виявлялися антитіла в сироватці, які в РНГА не встановлювали, що може бути пов’язане з різними строками інфікування тварин і виявленням різних за природою антитіл.

Визначення специфічності ієрсиніозних антигенів 06.30, 03 і 09 для застосування в РЗК показало, що при позитивній реакції з ієрсиніозною гомологічною гіперімунною овечою сироваткою (1:80 ++) встановлена негативна реакція з нормальною сироваткою коней і позитивна реакція в титрі 1:10 + з позитивною бруцельозною сироваткою, що може бути пов’язане з перехресними серологічними реакціями, викликаними спорідненістю бруцельозних і ієрсиніозних антигенів. Рівень серологічного відгуку при застосуванні гомологічної гіперімунної сироватки в РЗК при порівнянні з РА значно нижчий, тому остання реакція є більш чутливою і специфічною.   

Cерологічний моніторинг ієрсиніозу серед сільськогосподарських тварин. Дослідження  3460 сироваток  великої рогатої худоби, проведені  в РА з ієрсиніозними антигенами ННЦ „ІЕКВМ” , показали, що у тварин в господарствах двадцяти областей України  рівень серопозитивності коливається в межах від 0,7 до 100%. У більшості випадків позитивні реакції встановлювали одночасно з трьома сероваріантами (09, 03 і 06.30) і тільки серед досліджених проб крові великої рогатої худоби Хмельницької і Полтавської областей не виявили позитивних реакцій з ієрсиніозним антигеном  сероваріанту 03. Серопозитивність серед досліджених тварин з сероваром 09 виявили в  1,7-100%,  з антигеном серовару 03 - в 1,0 до 100%. Серопозитивність з ієрсиніозним антигеном серовару 06.30  мала широке коливання у тварин як з господарств різних областей (0,7-100%), так і в межах однієї  області.

У досліджених 492 голів свиней з господарств 5 областей, нами було виявлено антитіла в діагностичних титрах з сероваріантом 09 у 12,5-100%  тварин. З ієрсініозним антигеном  серовару 03 відсоток позитивно реагуючих  коливався  в межах  20,0 до 92,9%. При дослідженні тварин з Одеській області  позитивних реакцій з антигенами 03 і 09 не виявили, проте з антигеном 06.30 реагувало 20% тварин. При дослідженні свиней з інших областей антитіла в діагностичному титрі до серовару 06.30 виявили у 12,5-100%.

            Рівень ієрсиніозної серопозитивності серед  дослідженої 101 голови коней з трьох областей України з антигеном серовару 09 коливався в межах  6,3 до 100% тварин, рівень серопозитивності до ієрсиніозного антигену серовару 03 був не- високим, хоч у тварин  з Дніпропетровської області  сягав 17,7 – 46,2%. З антигеном серовару 06.30 реагувало  17,7-60,0% тварин.

Дослідження 435 сироваток крові овець, які надійшли з 4 областей  України і АР Крим, показало, що серопозитивність до антигену 09  коливалася від 15,1%  (Миколаївська область) до 100% (Херсонська область, АР Крим). Тварини Кіровоградської області не мали антитіл до антигену цього серовару ієрсиній.  Також не спостерігали  позитивного відгуку серед овець Херсонської області на антиген 03, проте  у тварин з інших областей  серопозитивність спостерігали на цей антиген  в межах від 53,8 до 100%  випадків. З антигеном 06.30  найвищі показники позитивних реакцій були отримані  у досліджених тварин Херсонської (100%) і Кіровоградської (65,0%) областей.

            Із двох областей України були досліджені 37 сироваток кіз. Позитивна реакція з антигеном 09 була в межах 52,6 - 83,3%. Від 26,3 до 66,7% тварин реагували з антигеном 03, а позитивні реакції з антигеном  06.30 виявили у 20,0 – 91,7%.

            Сумовані дані серологічних досліджень сироваток крові сільсько-господарських і дрібних свійських тварин на ієрсиніоз (наведені у табл.1) свідчать, що середній титр антитіл у клінічно здорових биків-плідників з ієрсиніозними антигенами 09, 03 і 06.30 був в межах 1:231+3,4 - 1:298+13,8, у клінічно здорових корів цей показник становив 1:244+ - 1:331+14,1, а у корів, що абортували, середній титр з антигеном серовару 09 сягав 1:343+12,6, із сероваром 03 – 1:299+16,0, а з антигеном серовару 06.30 - 1:200. У сироватках телиць з різних господарств України середні титри були до антигенів 09, 03, 06.30 відповідно 1:263+12,1, 1:276+12,3 і 1:235+7,8, в той час як у нетелів вони сягали 1:307+15,8, 1:318+27,1 і 1:308+50,3. У телят виявлені суттєві коливання у серологічних зрушеннях антитіл на різні антигени. Середній титр антитіл  до антигену серовару 09 сягав 1:408+84,1, до антигену 03 -1:350+18,8, а до антигену 06.30 -1:200.

При дослідженні сироватки крові  від вівцематок антитіла до антигену 09 встановлено в середньому титрі 1:250+7,9, до антиген 03 – 1:224+5,4, у той же час середній титр з антигеном 06.30 становив 1:668+21,8. Схожими були дані, отримані з сироватками вівцематок, що абортували, відповідно 1:238+4,6, 1:400 та 1:578+43,5, а у баранів середній титр з антигеном 06.30 був вищим  - 1:800.

Середні титри у кіз були суттєво вищими за титри у великої рогатої худоби і складали відповідно 1:452+53,2, 1:518+59,1 і 1:600+58,8.

Дослідження сироваток у різновікових груп коней показало, що у кобил титри антитіл  коливалися в межах 1:247+11,9 до 1:400, у жеребців і лошат вони стабільно сягали 1:200 незалежно від сероваріанту ієрсиніозного антигену.

У свиноматок позитивні реакції на різні ієрсиніозні антигени були майже однотипні (1:344+23,3; 1:355+19,1; 1:363+30,8). У поросят середні титри до антигену

09 сягали 1:333+66,7, а до антигену 03 - 1:200 і не виявили позитивних реакцій з антигеном 06.30.  У клінічно хворих тварин титри антитіл були значно вищими і сягали рівня 1:800 - 1:1600.