РОЗРОБКА ТЕСТ-СИСТЕМИ НА ОСНОВІ ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ АНТИТІЛ ПРОТИ ВІРУСУ СКАЗУ У СИРОВАТЦІ КРОВІ ТВАРИН

Краткое содержание

Роботу виконано на базі кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології НАУ. Окремі дослідження проведено у Центральній державній лабораторії ветеринарної медицини Міністерства АП України та в науково-дослідному інституті епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського Міністерства охорони здоров’я України.

У роботі були використані клітинні культури НГУК-1 та ВНК -21/17, вірус сказу (штами “Щелково-51 К”, ”Внуково-32”, “CVS” та “Овечий” ВДНКІ), а також тварини: 38 кролів породи шиншила масою тіла 1,5-2,0 кг віком 5-8 міс.; 3 000 білих нелінійних мишей масою тіла 9,0-12,0 г та дві вівці масою тіла 50 кг віком 8 міс.

Для отримання культурального рабічного антигену використовували вакцинний штам ”Щелково-51 К” вірусу сказу, який культивували у клітинних культурах ВНК-21/17 та НГУК-1 у ролерних умовах. Клітинну культуру із сформованим моношаром клітин заражали вірусом сказу (0,1-0,01 ЛД₅₀/ клітину) та інкубували у ролерних умовах (1–2 об/хв). Титр вірусу визначали на 3-, 4- та 6-у добу культивування, заражаючи білих мишей різними розведеннями вірусовмісної суспензії. Отриманий матеріал заморожували та зберігали при –40 ^оС.

Вірус інактивували за допомогою гідроксиламіну (Sigma), додаючи його до вірусовмісної суспензії у концентрації 0,01 % та витримуючи в умовах кімнатної температури (18–20 ^оС) протягом 24 годин. Концентрування вірусовмісного рабічного матеріалу (культуральні рідини, що містили штами “Щелково-51К” і штами ”Внуково-32” та суспензія мозку, що містила штам “Щелково-51К”) з інфекційним титром вірусу сказу не нижче 10^6,0 ЛД₅₀/0,03см³ здійснювали за допомогою поліетиленіміну. Вірусовмісний матеріал тричі заморожували-розморожували з наступним центрифугуванням при 3000 об/хв – 15 хв (400 g). Осад відкидали. До надосадової рідини додавали 50 %-й розчин поліетиленеміну з таким розрахунком, щоб кінцева концентрація його становила 0,005 %. Рідину ретельно перемішували та залишали на 2 доби при +4⁰С. На наступному етапі вірусовмісний матеріал центрифугували при 4000 об/хв протягом 30 хв. Надосадову рідину відкидали. Осад суспензували у 9 % розчині NaCl. В нашій роботі матеріал концентрували у 50 разів.

Концентрований матеріал піддавали колонковій хроматографії на DEAE-toypearl. Елюцію проводили в лінійному градієнті натрію хлориду 0 - 0,4 М. 1 см³ концентрованого матеріалу суспендували у 1 см³ буфера 20мМ Tris, 1мМ ЕДТА, рН 7,5 і вносили у колонку. Елюат збирали пофракційно. Оптичну щільність отриманих фракцій визначали за допомогою спектрофотометра марки СФ-26 у діапазоні хвиль світла довжиною 300 – 240 нм. Відбирали фракції, які мали максимум поглинання при 280 нм та мінімум при 250 нм. Фракції, які містили найбільше специфічного рабічного антигену, піддавали електрофорезу в 12%-му поліакриламідному гелі та перевіряли у ІФА.

Часткове очищення антигену вірусу сказу, отриманного з концентрованої антирабічної вакцини, проводили за допомогою колонкової хроматографії на DEAE - toypearl за тією ж методикою, яка була використана під час отримання інших рабічних антигенів.

Для отримання антирабічної сироватки від кролів-донорів у якості антигенів застосовували концентровану антирабічну культуральну очищену інактивовану вакцину з штаму "Внуково-32" (КоКАВ) виробництва Інституту поліомієліту та вірусних енцефалітів (Москва), з індексом імуногенності > 2,5 МО та штам вірусу сказу “CVS” у вигляді 10%-ї суспензії мозку мишей з титром 10^4,625 ЛД₅₀ /0,03 см³.

Як ад’ювант використовували мінеральне масло ISA-25 фірми “SEPPIC” (Франція). Гіперімунізацію кролів здійснювали у порівняльному аспекті за відомими та розробленими нами схемами із застосуванням ад’юванту. Кролів імунізували за такими схемами:

1 –дворазове введення КоКАВ на 1- та 21- добу у дозі 2 см³  внутрішньом'язово  у ділянці стегна;

2 – п’ятиразове введення КоКАВ на 1-, 3-, 7-, 14- та 30-у добу у дозі 1 см³ внутрішньом'язово у ділянці стегна;

3 –чотириразове введення КоКАВ на 1-, 7-, 15- та 30-у добу у дозі 0,1 см³   внутрішньошкірно у 5 точок в області живота;

4 – чотириразове введення КоКАВ на 1-, 7-, 15-, 30-у добу у дозі 0,1 см³   

внутрішньошкірно у п’ясневі та плюсневі м’якуші лапок та живіт.

5 – введення 0,5 см³  10%-ї суспензії “CVS” внутрішньом'язово у ділянці стегна на 1-у добу; на 3-, 6-у добу - по 0,5 см³    та на 10-, 17-у добу - по 1,5 см³ суспензії підшкірно у ділянці живота; на 50-й день внутрішньом'язово 2,5 см³ у ділянці стегна

6 – дворазове введення КоКАВ на 1- та 21-у добу у дозі 1 см³ з ад’ювантом ISA-25 (1:4), внутрішньом'язово у ділянці стегна;

7 – п’ятиразове введення КоКАВ на 1-, 3-, 7-, 14- та 30-у добу у дозі 1 см³ з додаванням ад’юванту ISA-25 (1:4) на 1- та 14-у добу,  внутрішньом'язово у ділянці стегна.

Проби крові відбирали на 45-у добу після завершення імунізації та визначали титр і активність отриманих антирабічних сироваток у МО.

Для кон’югації використовували рекомбінантний білок А Staphylococcus aureus, отриманий з генноінженерно зміненого штаму E. сoli- суперпродуценту білка, який помічали пероксидазою хрону (RZ =2,9 – 3,0).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

         Результати порівняльного вивчення інтенсивності репродукції вірусу сказу (штам “Щелково-51 К”) на клітинних культурах НГУК-1 та ВНК-21/17. Зважаючи на ряд недоліків імуносорбентів, отриманих з мозкових вірусовмісних матеріалів, ми зосередились на розробці методики їх отримання на основі культуральних рабічних антигенів. Як клітинні культури були використані КК НГУК-1 та ВНК -21/17. На першому етапі названі культури клітин були адаптовані до доступних живильних середовищ. Оптимальним живильним середовищем для КК НГУК-1 виявилось комбіноване середовище: гідролізат лактоальбуміну з додаванням 10 % середовища 199 та 10 % сироватки крові великої рогатої худоби (ВРХ), 50 мкг/см³ гентаміціну сульфату (рН 7,2–7,4), а також середовище DMEM з 10% сироватки великої рогатої худоби та додаванням аналогічної кількості антибіотику при 37 ^оС. Клітинна культура ВНК 21/17 характеризувалася стабільним ростом, стійкістю до змін рН.