Удосконалення системи культивування, зберігання та параметрів контролювання виробничих штамів (Pasteurella, Salmonella, Listeria)

Краткое содержание

Дослідження виконано у період з 1997 до 2007 рр. у НЦШМ ДНКІБШМ Міністерства аграрної політики України (м. Київ). Методологічною основою визначення напрямку досліджень були літературні відомості про біологічні властивості бактерій родів Pasteurella, Salmonella, Listeria — збудників інфекційних захворювань. У роботі використано: 3 виробничі штами сальмонел і 19 — пастерел, отриманих з колекції НЦШМ; 21 епізоотичний штам сальмонел, виділених від хворих та загиблих тварин різних видів у тваринницьких господарствах України; 7 штамів лістерій, отриманих з Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л. В. Громашевського АМН України, Інституту мікробіології та імунології ім. І. І. Мечникова АМН України.

Ліофілізацію проводили на апараті для ліофілізації LP-3 фірми JOAN за Р — 4,5 МПа, температури заморожування матеріалу в морозильній камері — мінус 73 °С, температури рефрижератора в LP-3 — мінус 45 °С, терміні висушування — 20–24 години. Для стабілізації бактерій в процесах ліофілізації використовували середовище Файбіча.

Морфологію культур вивчали мікроскопічними дослідженнями. Для вивчення форми і будови бактерій їх фарбували за Грамом (Антонов В. Я., 1981).

Культуральні властивості штамів визначали на рідких, напіврідких та твердих поживних середовищах: сальмонел культивували за температури 37 °С впродовж 18–24 годин, пастерел і лістерій — 24–48 годин (Антонов В. Я., 1981).

При виготовленні збагаченого середовища для культивування пастерел (середовище PL-5) до готових середовищ МПБ, Хотінгера додавали 5 % кінської сироватки, інактивованої впродовж 30 хв. за температури 45–50 °С, та 1 % глюкози. Середовища витримували 3 доби за температури 37 °С (контроль на стерильність). На вказаних середовищах пастерел культивували при 37 °С впродовж 24–48 годин (Меджидов М. М., 2003, Количев Н. М., 2006). Збагачені середовища для культивування сальмонел (SC-5) готували за такою методикою: до готових середовищ МПБ, Хотінгера додавали середовища 199 — 2 %, печінкової води — 5 %, глюкози — 1 %; стерилізували 30 хв. за 0,5 атм.

До складу середовища для накопичення біомаси лістерій № 29973 введено екстракт пекарських дріжджів (ЕПД), панкреатичний гідролізат казеїну (ПГК), літію хлорид, натрію хлорид, амонійного заліза цитрат і в якості джерела азоту — гідролізат кільки з вмістом амінного азоту 0,15–0,20 г/%. Збагачували середовище додаванням 5 % інактивованої кінської сироватки та 1 % глюкози.

Біохімічні властивості. При вивченні біохімічних властивостей культур користувались середовищами Гіса з сахарами і багатоатомними спиртами. Рівень біохімічної активності виражали в хрестах (від 1 до 4). Біохімічні властивості лістерій вивчали за допомогою тестів АРІ-Listeria (виробництва фірми «BioMerieux», Франція) згідно з настановою. Для виявлення культур, що гідролізують сечовину, використовували середовище Олькеницького. Визначення присутності індолу та протеолітичної активності бактерій проводили за загальноприйнятими методиками (Антонов В. Я., 1981, Меджидов М. М., 2003).

Антигенну структуру сальмонел вивчали за допомогою реакції аглютинації на склі з О- і Н-аглютинуючими діагностичними сальмонельозними сироватками (Черкаський Б. Л., 1990). Рівень аглютинації позначали в хрестах (від 1 до 4).

Гемолітичні властивості лістерій визначали за наявністю гемолізу на кров’яному агарі і у САМР-тесті зі штамами Staphylococcus aureus ATCC 25923 і Rodococcus equi ATCC 6939 (згідно з ISO 11290-1:2003, ISO 11290-2:2003).

Антибіотикорезистентність штамів визначали згідно «Инструкции по применению дисков для определения чувствительности к антибиотикам» (від 8.07.1986 р., МОЗ СРСР).

Вірулентність штамів вивчали на білих мишах методом титрування і визначення LD₅₀ (Антонов Б. И., 1986).

Імуногенність (ІD₅₀) мікроорганізмів визначали на моделях активного захисту — білих мишах масою 18–20 г після дворазового щеплення відповідними антигенами (Антонов Б. И., 1986).

Результати експериментальних досліджень оброблені за загальноприйнятими методами статистики (Ашмарин И. П., 1962). При цьому визначали середню арифметичну величину (М), її середньоквадратичне відхилення (у), похибку середньої арифметичної величини (m) та коефіцієнт кореляції (r). Вірогідність різниці середніх арифметичних величин між групами або в порівнянні з вихідними даними визначали за критерієм Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Вивчення біологічних властивостей штамів з колекції НЦШМ ДНКІБШМ. У роботі вивчали архівні зразки бактерій родів Salmonella i Pasteurella, ліофілізовані y 1995 та 2005 рр. Визначали властивості вказаних штамів до ліофілізації, у ліофілізованих культур та після 3‑х відновлювальних пасажів на МПБ, середовищах Хотінгера і на збагачених поживних середовищах (PL-5, SC-5).

Культурально-морфологічні властивості штамів Pasteurella multocida. Досліджували виробничі штами P. multocida, патогенні для ВРХ, ДРХ і свиней (№№ 216, 116, 217, 796, 656, 877, См, D, F, 1231) та сільськогосподарської птиці (№№ 396, 606, 2-А, 115, 1718, D-1, D-71, D-90, 1931). За морфологією досліджені культури грамнегативні, овоїдної форми, дрібні, розміром 0,5–1,0´0,5–0,8 мкм.

На МПА культури утворювали типові для виду колонії S-форми. Штами P. multocida №№ 656, 877, «СМ», 396, D-71 утворювали крупні колоній до
4–6 мм у діаметрі. У культур P. multocida №№ 216, 116, 796, F, D, 606, 2-А, 115, 1718, D-90, D-1, 1931 розмір колоній становив 0,5–3,0 мм у діаметрі. Культура P. multocida № 217 вегетувала у вигляді дрібних росинчатих колоній S-форми розміром до 0,5 мм у діаметрі.

Необхідно підкреслити, що при культивуванні на середовищах МПБ, Хотінгера штамів №№ 217, 396, 796, F, D, 1931 відмічалась затримка росту: накопичення бактеріальної маси у 24-годинних бульйонних культурах становило 500–700 млн мікр. кл., на МПА добові культури утворювали дрібні колонії S-форми діаметром 0,2–0,5 мм. Після 2–3 пасажів на вказаних середовищах у більшості штамів проявлявся феномен дисоціації (за Н. М. Количевим, 2007): культури втрачали здатність утворювати колонії на твердих середовищах, росли лише на початку штриха у вигляді слизового тяжа (О‑форма).

Для вирішення цієї проблеми дослідним шляхом, враховуючи літературні дані, нами оптимізовано склад середовища і спосіб культивування пастерел. З цією метою до стандартних середовищ МПБ, Хотінгера додавали 5 % кінської сироватки і 1 % глюкози (середовище PL-5). Крім того, у роботі зі штамами ми чергували пасажі на рідких і напіврідких середовищах (ПЖА Хотінгера, який також містив 5 % кінської сироватки і 1 % глюкози), а тверді середовища використовували для спостереження за культуральним станом штамів і виділення чистої культури після пасажів на лабораторних тваринах.