БІОЛОГІЧНІ ТА ІМУНОГЕННІ ВЛАСТИВОСТІ ЕПІЗООТИЧНИХ ШТАМІВ ВІРУСУ ІНФЕКЦІЙНОГО БРОНХІТУ КУРЕЙ

Краткое содержание

Дослідження проведені на моделі вакцинних штамів вірусу ІБК: Н‑120 (жива ліофілізована вакцина TAD ІВ vac I Н120, 5000 доз 10^6,7 EID₅₀, штам Н‑120 серотипу Массачусетс); Ма‑5 (жива ліофілізована вакцина Нобилис® ІВ Ма5, 2500 доз, 10^3,0 EID₅₀ штам Ма‑5 серотипу Массачусетс); 4/91 (жива атенуйована вакцина Нобилис® ІВ 4/91, 1000 доз, 10^3,6 EID₅₀ штам 4/91 серотипу 4/91) і епізоотичних ізолятів ЛІ, ЛІ‑1, ЛІ‑2, ЛІ‑3, ЛІ‑4, ЛІ‑5, ЛІ‑6.

Серологічний моніторинг і визначення рівня антитіл до ВІБК здійснено з використанням реакції непрямої гемаглютинації (РНГА), яку ставили мікрометодом за загальноприйнятою методикою (Панікар І. І., 1997) із застосуванням еритроцитарного діагностикуму. Досліджено 1140 зразків сироватки крові птиці. Антитіла в сироватці крові птиці до вірусу ньюкаслської хвороби виявляли за допомогою реакції затримки гемаглютинації. Кількісну оцінку результатів групових серологічних досліджень проведено за З. Лярски (1980).

Для ізоляції, індикації, визначення патогенності та інфекційності епізоотичних ізолятів ВІБК використано 310 курячих ембріонів, 222 курчата породи Арбор-Айкерс, культури первинних фібробластів курячих ембріонів, що одержували методом трипсинізації (Троценко Н.І., 2000), і перещеплюваних клітин Vero, які надійшли з Колекції клітинних культур для ветеринарної медицини та біотехнології Національного наукового центру «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини».

Вірус виділяли з патологічного матеріалу, відібраного від трупів загиблої та тушок забитої з діагностичною метою птиці, а також із зразків ембріональних тканин і органів курячих ембріонів 16‑добової інкубації. Інфікування курячих ембріонів 9–11‑добової інкубації здійснювали за аплікацією досліджуваного матеріалу на хоріоналантоїсну оболонку (ХАО) за загальноприйнятою методикою. Інфекційність ізолятів визначали за методом Ріда і Менча.

Цитологічний контроль культури клітин Vero, яку вирощували на накривних скельцях, здійснювали після фіксації сумішшю льодяної оцтової кислоти і абсолютного спирту з наступним фарбуванням гематоксиліном Карачі й еозином. За мітотичний індекс, який виражали в проміле (‰), приймали кількість клітин, які діляться, віднесених до загальної кількості клітин. Патологічні форми мітозів інфікованої культури клітин визначали за класифікацією І. А. Алова (1965).

Біопробу проводили на курчатах 13- і 3‑добового віку методом інтраназального інфікування ізолятами ЛІ‑1, ЛІ, ЛІ‑2, ЛІ‑3, ЛІ‑4, ЛІ‑5 та ЛІ‑6. Спостереження за клінічним станом курчат і серологічний контроль рівня антитіл до ВІБК у сироватці крові здійснювали впродовж 25 діб. Патологоанатомічний розтин курчат проводили через 7 і 25 діб після інфікування. Піддослідні групи курчат утримувались в окремих ізольованих приміщеннях віварію.

Циліарну активність трахеї курчат, яким вводили інтратрахеально та інтраокулярно епізоотичні ізоляти й вакцинні штами ВІБК, визначали за допомогою циліостатичного тесту (впродовж 5 діб). Загальний циліостатичний бал, за умов повного циліостазу, становив 40. Бал менше 20 свідчив про наявність захисту трахеї від даного вірусу (Мало А., 2002). Для гістологічних досліджень відбирали зразки трахеї, нирок, легень інфікованих курчат на момент максимального циліостатичного балу.

Визначення гемаглютинуючої активності ізолятів ЛІ‑1, ЛІ‑2 і штаму Н‑120 проведено за допомогою реакції гемаглютинації (РГА) за температури 4, 18–22 та 37 °С. За умов отримання негативного результату реакції до зразків вірусовміщуючого матеріалу додавали 1 %‑й розчин трипсину у співвідношенні 1:1 та інкубували 90 хвилин за температури 37°С, після чого ставили реакцію.

Терморезистентність ізолятів вивчали за чутливістю до прогрівання на водяній бані за температури 45 °С впродовж 90 хвилин (Сюрин В. Н., 1998) з визначенням залишкової інфекційності в курячих ембріонах.

Біохімічні та електронно-мікроскопічні дослідження проводили після концентрації і очищення ізолятів ультрацентрифугуванням у градієнті щільності 30 %‑ї сахарози. Для визначення білкового складу проводили горизонтальний електрофорез ізолятів і вакцинних штамів ВІБК у 2 %‑му поліакриламідному гелі за методикою A. Cцrg (1985).

Морфологічні властивості ізолятів вивчали за негативним контрастуванням з використанням електронного мікроскопу моделі ПЕМ‑125 К (AO «SELMI», м. Суми).

Аутентичність польових ізолятів вірусу ІБК визначали за допомогою ПЛР з використанням системи праймерів, що фланкують 320 п. н. ділянку S₁ гену.

Детекцію геному вірусу ньюкаслської хвороби здійснювали за допомогою праймерних систем D 1‑2, B 1‑2 та LaS 1‑2 (ФДУ ВНДІЗЗТ, м. Владимир) та базових наборів виробництва фірми «Амплісенс» (м. Москва). Ізоляцію вірусної РНК і реакцію зворотної транскрипції здійснювали за допомогою наборів «РИБО‑сорб‑50» та «РЕВЕРТА‑L» виробництва Центрального науково-дослідного інституту епідеміології (м. Москва).

Статистичну обробку результатів досліджень здійснювали з визначенням критеріїв вірогідності за Ст’юдентом. Результати обраховували за допомогою персонального комп’ютера ІВМ РС/АТ, програми «Excel XP» з програмного пакету MS Office XP.