КУЛЬТУРАЛЬНІ, МОЛЕКУЛЯРНО-БІОЛОГІЧНІ ТА АНТИГЕННІ ВЛАСТИВОСТІ ВАКЦИННИХ ШТАМІВ ERYSIPELOTHRIX RHUSIOPATHIAE

Краткое содержание

Загальна методика та основні методи досліджень. Робота виконувалась впродовж 2000–2006 рр.  у лабораторіях біотехнології бактеріальних препаратів та молекулярної біології Інституту ветеринарної медицини УААН. Дослідження протективної активності експериментальної вакцини проти бешихи свиней, виготовленої на основі антигену E. rhusiopathiae М-2 ВК, проводили в умовах  господарства АПК „Криворіжсталь” (нинішня назва – АПК ВАТ „Арселор Міттал Кривий Ріг”).

При вивченні молекулярно-біологічних  та антигенних властивостей                 E. rhusiopathiae використовували  TEMED, 2-МЕ, ЕДТА – Merck; акріламід (2Х), бісакріламід, персульфат амонію – Serva^®; Coomassie R250 та Coomassie G250, Тween-20, Тріс-HCl, oртофенілендіамін, антитіла проти імуноглобулінів свині та миші, мічені пероксидазою хрону – Sigma^®; гліцерин – Fluka^®; агарозу NA, бромистий етидій, маркери молекулярної маси білків – Pharmacia^®; маркер  "1 kb DNA ladder" – Stratagene^®; маркер “100 b(+) DNA ladder” – Fermentas^®; БСА (fr.V) – Boehringer Mannheim; Montanide ISA-25 (Seppіc^®); повний та неповний ад’юванти Фрейнда – Difco^®; знежирене молоко, мікробіологічні барвники – генціанвіолет, фуксин, розчин Люголя, метиленовий синій.

У роботі використовували штами бактерій E. rhusiopathiae 27, 149, 193, 251, 419, 1689, 1893, 1933,  ВР-2  вар. ІВМ,  М-2 ВК, К та Ш.

Вивчення нешкідливості, імуногенності та  протективних властивостей експериментальних вакцин  проводили на  1170 білих мишах масою 17±1г,                     20 мурчаках   масою 250±50 г  та  124 підсвинках  3,5–4-місячного віку.

Для культивування E. rhusiopathiae  застосовували м’ясопептонний бульйон  та  агар Хотінгера (МПБХ та МПАХ). При пошуку оптимального середовища для  культивування вакцинних штамів бактерій бешихи в порівняльному аспекті використовували середовище Фейста (СФ), виготовлене за прописом автора (Feist H. et al., 1976) та модифіковане нами середовище Фейста (СФМ) складу: 6 г глюкози, 15 г пептону (Becton Dickinson, USA), 5 г дріжджового екстракту (Difco), 0,5 г аргініну (Sigma), 0,5 cм³ олеїнової кислоти  (Merck),  0,2 г  сульфату заліза (Merck) та 0,02 г сульфату цинку (Merck) в 0,2 M натрієвому фосфатному буфері, води дистильованої до 1000 cм³ (рН середовища  7,6±0,2).

Культивування  бактерій  бешихи  у рідких живильних середовищах проводили за температури (36,7±0,3) °С протягом 18–24 годин,  на щільних –  48–72 години.

Тинкторіальні  властивості культур бактерій бешихи вивчали візуально, продивляючись пробірки у проникаючому світлі. Морфологію колоній вивчали при триразовому збільшенні за допомогою лупи. Типовість  бактерій та наявність дегенеративних форм визначали при мікроскопії мазків,  пофарбованих за Грамом.

Вивчення біохімічних (ферментативних) властивостей  штамів бактерій бешихи проводили за допомогою тест-системи  API^® Сoryne фірми BioMeriex, France.

  і виражали у колонієутворюючих одиницях (КУО).

Порівняльний аналіз нуклеотидних послідовностей ДНК штамів  бактерій бешихи, що досліджувались,  а також розрахунок олігонуклеотидних праймерів  виконували за допомогою програмного забезпечення „Vector NTI” v.8.0 (InforMax^Ò). При розрахунку специфічних олігонуклеотидних праймерів були використані послідовності ДНК бактерій бешихи, які зареєстровані в міжнародній базі даних сиквенсів генів GenBank, що є складовою міжнародного проекту Inte ational Nucleotide Sequence Database Collaboration. Як  вихідна матриця була використана повна послідовність гена білка spaA  (реєстраційний номер за міжнародним банком генів АВ019124) (Shimoji Y. et al. 1999; Shimoji Y., 2000).

 Синтез розрахованих нами праймерів був виконаний фірмою “ThermoHybaid. BioSciences” (Німеччина). 

Для вивчення молекулярно-біологічних властивостей штамів бактерій бешихи застосовували (ПЛР).

Електрофорез білків проводили з метою  аналізу протеїнового профілю бактерій бешихи із застосуванням методу  електрофорезу в 12 % та 15 % поліакріламідному гелі у денатуруючих умовах  за методикою  U. Laemmli  (1970).

Для вивчення антигенних властивостей досліджуваних бактерій бешихи різних штамів використовували імуноферментний аналіз у вигляді непрямого варіанта (Imada Y., Mori Y., Daizoh M. at al., 2003). Реакцію  проводили  на 96-лункових стриперованих пластикових планшетах (Nunc^®).

З метою підбору методу інактивування культур E. rhusiopathiae в порівняльному аспекті  добові культури бактерій спочатку інактивували додаванням 0,3 %-го  розчину формаліну (Merck^®) (Н₂СО)_n  (37 %-й водний розчин формальдегіду)  з подальшим витримуванням  при кімнатній  температурі (18–20 °С) протягом  96 годин. Формалін перед змішуванням з культурою розводили стерильним фізіологічним розчином в об’ємному  співвідношенні 1:1. В другому варіанті до культур бактерій бешихи додавали 0,1 Н розчин  натрію гідроксиду, доводячи до рН 12 та витримували при кімнатній температурі 6 годин, після чого додаванням 1Н розчину  HCl   рН інактивованої культури доводили   до 7,3±0,1.

Для підбору  ад’юванту, придатного для виготовлення інактивованих вакцин проти бешихи свиней, ми в порівняльному аспекті вивчили та дослідили: 10 %-й розчин алюмінію гідроксиду, який додавали до  добових бульйонних  культур бактерій бешихи в кількості 4 %;  суміш вазелінової олії з ланоліном у об’ємному співвідношенні 83 : 17 та суміш мінеральної олії Marcol 52 (ESSO^Ò, France) з ланоліном у співвідношенні 70 : 30, які додавали до культури в кількості 50 %; готовий ад’ювант Montanide ISA 25 (Seppic^Ò, France), який додавали до культури в об’ємі  25 %.

При виготовленні експериментальних зразків емульсин-вакцин  як водну фазу використовували добові бульйонні  культури бактерій бешихи, інактивовані 0,3 %-м формаліном.

проводили  з дотриманням  правил асептики та антисептики. Щеплення мишей  здійснювали шляхом підшкірного введення вакцин за допомогою шприца в об’ємі 0,2 см³.  Свиням вакцину вводили внутрішньом’язово в дозах, передбачених схемою досліду.

Контрольне зараження мишей проводили шляхом підшкірного введення 0,2 см³ культури E. rhusiopathiae контрольного штаму 149 з вмістом 100 LD₅₀ живих бактерій бешихи. Періодично перед зараженням визначали LD₅₀ контрольного штаму для білих мишей.

Контрольне зараження  свиней проводили шляхом внутрішньодермального  введення бактерій  E. rhusiopathiae К, розведених фізіологічним розчином,  з латеральної сторони тіла, посередині умовної лінії від лопатки до стегна в 5 місць на відстані між ними 2–3 см  в об’ємі по  0,2 см³.  Всього кожній тварині  сумарно вводили  по 3 ×10⁶  бактерій бешихи штаму К в об’ємі  1  см³.

Всіх  заражених тварин щоденно протягом 10 діб піддавали індивідуальному  клінічному огляду та дворазовій термометрії о 8 та 17 годинах. Оцінювали стан тварин, розмір та характер запалення шкіри в місцях  внутрішньодермального  зараження.

Активність нейтрофілів крові визначали  в опсоно-фагоцитарній  реакції за загальноприйнятим методом (Чумаченко В.Е. із співавт., 1990).

Протективну активність експериментальної  інактивованої емульсин-вакцини проти бешихи свиней, виготовленої на основі антигену бактерій E. rhusiopathiae штаму М-2 ВК з ад’ювантом  Montanide ISA 25,  вивчали в комісійних дослідах на свинях за розробленою нами методикою, яка була затверджена Державним департаментом ветеринарної медицини  України  (наказ № 53 від 05.05.2005  р.).

Всього було щеплено 109 підсвинків, у тому числі:

- три групи тварин  (№№ 1, 2 та 3),  відповідно, по 14, 25 та 27 голів, вакцинували дворазово з інтервалом 14 діб у дозах по 1, 2 та 3 см³,   із вмістом  по 2, 4 та 6×10⁹ бактерій бешихи  (по 4, 8 і 12 ×10⁹ м. к.);

- одну групу тварин (№ 4)  в кількості 27 голів щепили  одноразово в дозі 4 см³ (8×10⁹ м. к.).

З метою визначення  напруженості імунітету проти бешихи у вакцинованих свиней через 46 та 180 днів після останнього щеплення  від дослідних груп відбирали по 5 вакцинованих та 5 контрольних  тварин  та заражали внутрішньодермально  патогенними бактеріями збудника  бешихи  контрольного штаму К у попередньо підтитрованій  дозі.

Результати експериментальних досліджень оброблені загальноприйнятими методами статистики (Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962) з використанням комп’ютерної програми „Microsoft Excel 7.0”. При цьому визначали середню арифметичну величину (М), її середньоквадратичне відхилення (σ) та похибку середньої арифметичної (m). Вірогідність середніх величин (Р) між групами або в порівнянні з вихідними даними визначали за критерієм Ст’юдента.