РОЗРОБКА ЖИВИЛЬНИХ СЕРЕДОВИЩ ДЛЯ КУЛЬТИВУВАННЯ КУЛЬТУР КЛІТИН

Краткое содержание

Дослідження виконано в лабораторії культур клітин Інституту ветеринарної медицини УААН в період з 1998 по 2001 рр.

У дослідах використовували первинно – трипсинізовані  клітини нирки свині (СН),  перещеплювані культури СНЕВ (нирка ембріона свині), КТП (тестикули поросят), ВНК – 21 (нирка новонародженого хом’яка) та ПТП. Лінію ПТП вивели дослідним шляхом із тестикулів поросят-гнотобіотів, а  культури СНЕВ, КТП та ВНК–21 використовували із колекції культур клітин ІВМ УААН.

Життєздатність клітин підтримували методом регулярних пересівів на свіже ростове середовище. Для цього використовували середовище 199, ГЛА, Ігла МЕМ, 5% гемогідролізат (Білорусія) та дослідні серії гемогідролізату. До складу середовища добавляли 10% сироватки крові великої рогатої худоби.

Вихідною сировиною для приготування гідролізату були згустки крові великої рогатої худоби та підшлункові залози свиней. Для проведення гідролізу використовували також трипсин. В процесі гідролізу визначали рН (потенціометрично), вміст амінного азоту – формольним титруванням за спрощеним методом Зеренсен-Гаврилова та триптофан – методом М. А. Пешкова.

Для приготування дослідного живильного середовища за сольову основу використовували розчин Хенкса, який готували із основних концентрованих розчинів А, В, С і розчину індикатора фенолового червоного (1:1000). При виготовленні живильного середовища до сольової основи додавали основний (маточний) гемогідролізат, L – глютамін та розчин вітамінів кваліфікації “для культур клітин”. Після встановлення рН 7,2±0,2 проводили стерилізацію фільтруванням. Приготовлене середовище перевіряли на стерильність шляхом висіву на МПБ, МПА, середовища Кітт-Тароцци та Сабуро.

Для визначення здатності живильного середовища гемогідролізату та сироватки крові великої рогатої худоби забезпечувати ріст культур клітин використовували методи біологічного контролю. При цьому визначали ступінь токсичності та ростової активності при культивуванні первинних і перещеплюваних культур клітин.

В дослідженнях використовували РНК-вірус, що належить до родини Pico aviridae, роду Enterovirus і є збудником хвороби Тешена. Вірусутримуючу рідину отримували в лабораторії генетики та імунології ІВМ УААН з люб’язного дозволу доктора ветеринарних наук, академіка Романенка В. Ф. Накопичення вірусу визначали по величині титру інфекційності методом титрування для кожної культури окремо. Множинність інфікування вірусу складала 0,8 – 1 ТЦД₅₀/см³ на одну клітину. Розрахунок титру інфекційності проводили за методом Ріда і Менча.

Статистичну обробку отриманих результатів проводили згідно статистичних методів у вірусологічних дослідженнях (Честяков И. И., 1966). При цьому вираховували середні арифметичні величини, середнє квадратичне відхилення, достовірність різниці між середніми величинами (критерій значення “ Р ”).

Результати експериментальних досліджень та їх аналіз

Визначення оптимальних умов гідролізу згустків крові великої рогатої худоби. Розробляючи умови гідролізу білків крові великої рогатої худоби, основну увагу звертали на вибір відповідного методу гідролізу, підбір фермент-субстратного співвідношення, визначення ступеня розбавлення субстрату, встановлення тривалості гідролізу, дотримання певного температурного режиму та рH.

Зважаючи на недоліки кислотного та лужного методу гідролізу, нами був обраний ферментативний метод.

Для контролю процесу гідролізу проводили визначення рН, вмісту амінного азоту та наявності триптофану. Гідроліз припиняли при накопиченні амінного азоту не менше 700 мг/100см³,  зниженні рН на 0,2-0,4 одиниці та наявності триптофану. Якщо гідроліз проходив повільно, суміш лишали ще на 12-24 години в термостаті, а потім повторно проводили визначення. За нашими даними трьох вищезгаданих показників контролю процесу гідролізу достатньо, що є зручно і економічно вигідно.

На першому етапі дослідження встановлювали оптимальну концентрацію субстрату шляхом вибору співвідношення субстрат–розчин Хенкса (без фенолового червоного). Намагалися досягти такого ступеня розбавлення субстрату, при якому забезпечувалася б найбільш легка атака і перетравлення його ферментом. Було досліджено 4 варіанти розведення субстрату розчином Хенкса у співвідношеннях 1:1; 1:1,5; 1:2; 1:2,5. Розведення 1:2 є оптимальним. При цьому співвідношенні субстрату з розчином Хенкса забезпечується найбільш повне розщеплення білка (вміст амінного азоту становив 802±15 мг/100см³). Максимальне нагромадження амінного азоту спостерігалося при розведенні вихідної сировини і розчину Хенкса –1:1 і 1:1,5, але слід відмітити, що при цих співвідношеннях гідроліз був неповним, тому що в суміші залишалося багато нерозщепленого білка. Різниця вмісту амінного азоту при цих співвідношеннях в порівнянні з оптимальним була значною з високим ступенем достовірності (Р<0,001). Із збільшенням розведення зростає ступінь розщеплення білка, але подальше розведення субстрату небажано, оскільки це призводить до зниження концентрації продуктів гідролізу і збільшення загального об’єму (Р<0,001), що ускладнює технологію виробництва. 

Для визначення оптимальної кількості ферментної маси проводили гідроліз, використовуючи різну кількість ферментного препарату, приготовленого із підшлункової залози, а також різну кількість трипсину в розрахунку на 1 дм³ кров’яної маси. Оптимальний вміст амінного азоту (не менше 700 мг/100см³) отримували у тих випадках, коли кількість ферментного препарату, приготовленого із підшлункової залози, становила 35–45 %, а при використанні трипсину – 4,0–5,0 г на 1 дм³ кров’яної маси.

Слід відмітити, що з внесенням в гідролізну суміш великих кількостей ферменту збільшується показник амінного азоту (Р<0,05). Це пояснюється тим, що фермент також є білком і в процесі гідролізу інактивована частина ферменту може гідролізуватися, підвищуючи тим самим величину азотовмісних фракцій в гідролізаті.

            Згідно літературних даних (Малахов А. Г., Вишняков, С. И., 1984), відомо, що температурний оптимум для ферментів тваринного походження лежить у межах 37–50°С. До цього значення температури каталітична активність росте, причому на кожні 10°С приблизно в 2 рази підвищується швидкість перетворення субстрату. При досягненні температурного оптимуму денатурація ферментного білка різко посилюється і хоч швидкість розщеплення субстрату продовжує зростати, активність ферменту, що виражається кількістю перетравленого субстрату, знижується.

Враховуючи вищесказане, для проведення гідролізу нами була вибрана нижня межа температурного оптимуму. Одержані результати показують, що вміст амінного азоту істотно не відрізняється при зміні температури гідролізу в межах від 40 до 42°С (Р>0,2). Гідроліз можна проводити і при температурі 38°С, адже незважаючи на достовірну різницю в порівнянні з температурою 40 – 42°С (Р>0,01 і Р<0,05 при застосуванні ферментного препарату та трипсину відповідно) кількість амінного азоту є достатньою (808-860 мг/100см³) для повноцінного росту і розвитку клітин в культурі.

Для визначення тривалості гідролізу проводили дослідження вмісту амінного азоту в гідролізаті на першу, другу, третю, четверту і п’яту добу гідролізу. Результати цих досліджень показують, що процес гідролізу проходить, в основному, на 2–3-ю добу – вміст амінного азоту становив 798-854 мг/100см³. Протягом наступних двох діб величина амінного азоту мало змінювалася або залишалася сталою (Р>0,2). Збільшувати час гідролізу немає резону, оскільки створюється загроза бактеріального забруднення препарату.

Відомо, що протеолітичні ферменти трипсин і хімотрипсин, які є основою ферментного препарату, приготовленого із підшлункової залози, активні в слаболужній зоні, тому гідроліз проводили при показнику рН у межах 7,4–7,8.

Таким чином, було встановлено, що для проведення гідролізу необхідно дотримуватись таких умов: розбавлення субстрату розчином Хенкса проводити у співвідношенні 1:2; використовувати для гідролізу 35–45% ферментного препарату, приготовленого із підшлункової залози та 4,0–5,0 г трипсину на 1 дм³ кров’яної маси; проводити гідроліз 2–3 доби при температурі 38–42°C та концентрації водневих іонів 7,4–7,8.

Здатність середовищ з гемогідролізатом білків крові великої рогатої худоби забезпечувати ріст культур клітин. В процесі роботи, застосовуючи оптимальні умови гідролізу білків крові великої рогатої худоби, отримали 21 серію гідролізатів, які були вивчені за фізико – хімічними показниками (табл. 1) та випробувані в складі живильних середовищ.

З даних табл. 1 видно, що вміст амінного азоту в гідролізатах був у межах 710 – 949 мг/100см³. В середньому це склало 805±13,7 мг/100см³, що є достатнім для росту клітин. Наявність триптофану у всіх серіях гідролізатів свідчить про те, що процес гідролізу згустків крові великої рогатої худоби був завершений. Концентрація водневих іонів в процесі гідролізу знижувалася, що обумовлено накопиченням кислотних продуктів гідролізу, і становила, в середньому, 6,86±0,5. За фізичними показниками гідролізати були подібними.

Фізико – хімічні показники маточних гідролізатів не можуть бути використані для оцінки біологічних властивостей, тобто здатності забезпечувати ріст культур клітин. Це обумовило необхідність проведення спеціального дослідження по застосуванню гідролізату згустків крові великої рогатої худоби як основи живильних середовищ для культивування культур клітин. Зважаючи на те, що найбільш повну характеристику властивостей живильного середовища дає культивування на ньому перещеплюваних ліній клітин, свою роботу ми спрямували саме в даному напрямку.