РОЗРОБКА ЛАБОРАТОРНОГО РЕГЛАМЕНТУ КУЛЬТИВУВАННЯ ВАКЦИННОГО ШТАМУ ЛК-М ВІРУСУ КЛАСИЧНОЇ ЧУМИ СВИНЕЙ

Краткое содержание

Робота виконана на базі кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології Національного аграрного університету.  Частину досліджень проведено на базі  НВП “Біо-Тест-Лабораторія ” (м. Київ), деякі з  них – в умовах  Центру з вивчення особливо небезпечних хвороб тварин УААН (м. Житомир) та  у тваринницьких господарствах (К.С.П. “Придніпровське” Обухівського району Київської області ) .

У процесі виконання роботи були використані штами вірусів, первинні й перещеплювальні клітинні культури,  різні види тварин: свині, вівці, кози.

      Штами вірусу КЧС :   штам ЛК-М – вакцинний, отриманий в умовах  НВП “Біо-Тест-Лабораторія” ( за нашою участю) методом клонування вакцинного штаму ЛК-ВНДІВІМ, адаптований до КК ТЯ (депонований у  Державному науково-контрольному інституті біотехнології і штамів мікроорганізмів, м. Київ);

-                   штам Ші – Минь, одержаний у Центрі з вивчення  особливо небезпечних хвороб тварин  (м. Житомир), вірулентний для свиней різного віку при парентеральному зараженні.

     Клітинні культури (КК):   постійні лінії клітин РК-15 та SK-6 ( одержані з банку клітинних культур НВП “Біо-Тест-Лабораторія”), адаптовані до  живильних середовищ вітчизняного виробництва: ГЛА, RPMI. Зберігаються у замороженому стані (- 196 ⁰ С);

   первиннотрипсинізована клітинна культура з тканин тестикул ягнят, отримана за загальноприйнятою методикою  та власною модифікацією ряду елементів.

   Сировиною для отримання первиннотрипсинізованої  КК ТЯ були тестикули ягнят.  В умовах господарства відбирали баранчиків віком 1 – 4 місяці й кастрували їх закритим способом. Тестикули із загальною піхвовою оболонкою  поміщали в склянку з підтримуючим середовищем RРМІ – 1640, охолодженим до 4 ⁰ С, яке містило  антибіотики - стрептоміцину сульфат 2 мг/см³ та бензил-пеніциліну 2000 ОД / см³. Матеріал транспортували в лабораторію і  відразу ж піддавали трипсинізації.

        Трипсинізацію здійснювали при різних температурних режимах (4⁰С, 20⁰С та 37⁰С). Використовували стандартний 0,25%-ний розчин трипсину.  Під час трипсинізації  у флакон із шматочками тканини почергово вносили  трипсин та живильне середовище RPMI без сироватки крові. Така модифікація забезпечувала стабільний позитивний результат під час отримання клітинної культури з тканин тестикул ( наша модифікація ).

        Після підрахунку кількості живих клітин одержували суспензію на ростовому живильному середовищі (ГЛА / RPMI 50 / 50 з 10 % сироватки крові вівці), додавали зазначене живильне середовище з таким розрахунком, щоб концентрація клітин становила  200 тис./ см³, та висівали в скляні  або пластикові матраси, ролерні флакони, 96 – лункові планшети фірми SARSTED  (залежно від  потреб). Інкубували в стаціонарних та ролерних умовах (1-2об./хв) при температурі 37⁰ С. Стан формування моношару клітин визначали візуально та  за допомогою інвертованого мікроскопа Оpton – ID – 02.

         Зараження клітинних культур  здійснювали за  загальноприйнятим методом і різноманітними модифікаціями. У першому випадку живильне середовище зливали, у кожний матрас з культурою  вносили  вірусвмісну рідину, яку розподіляли по всьому моношару  клітин. Адсорбцію  здійснювали протягом 30-45 хвилин при кімнатній температурі (18-25⁰С), після чого вносили  живильне середовище (ГЛА або Ігла на основі ФГМ-С  з 4 % сироватки вівці або ягнят, рН 7,5-7,6).

     Заражені  клітинні культури   інкубували протягом 4 - 5 діб у термостаті при температурі 37⁰С. Титр вірусу визначали за допомогою розробленого нами гістохімічного варіанту ІФА.

    У зв'язку з пошуком методу зараження клітинних культур, який забезпечував би належну врожайність вірусного штаму та був  достатньо технологічним, паралельно з описаним методом,  проводили зараження за різними  варіантами :

-                   з попереднім відмиванням моношару та без відмивання;

-                   з використанням  процедури “адсорбція” вірусу та шляхом безпосереднього внесення вірусу в ростове живильне середовище.

    Досліджували також вплив  інших елементів на врожайність вірусу: інфікуючої дози, присутності трипсину у підтримуючому середовищі,     експозиції культивування.

     Кров  від  свиней  відбирали за  методикою  У. Ерфле  з співавторами   (1987 р.).

     Постановку гістохімічного варіанту імунопероксидазного методу здійснювали в пластикових планшетах фірми SARSTED. Використовували імунопероксидазний кон'югат власного приготування. Специфічну щодо збудника КЧС сироватку отримували на свинях, пероксидазу одержували від фірми SEGMA. Кон'югацію проводили за власною методикою. Результати постановки ІФА визначали візуально.

Постановку реакції інгібіції міграції лейкоцитів здійснювали за методикою, описаною  Г. Фримелем (1987), у якості клітин-мішеней використовували лейкоцити селезінки мишей.

Перещеплювальну клітинну культуру ТЯ отримували на основі первиннотрипсинізованої клітинної культури ТЯ шляхом клонування та тривалого пасажування in vitro.

Достовірність результатів досліджень визначали шляхом статистичного опрацювання отриманих цифрових даних за програмою “Біом-3”.  

Результати власних досліджень

      Використовуючи загальновідомий принцип отримання первинно-трипсинізованих клітинних культур та запровадивши ряд власних модифікацій, нам вдалось розробити методику  отримання  первинно-трипсинізованої клітинної культури з тканин тестикул баранчиків і козлят. Клітини обох культур  мали епітеліоподібний вигляд, формували якісний моношар протягом 3-4–х діб. Останній, за оптимальних умов, залишався без видимих деструктивних явищ протягом 10-14–ти  діб.

    Шляхом клонування та опромінення (0,5 мегарад) під час тривалого пасажування клітинної культури ТЯ, була отримана постійна клітинна лінія (перещеплювальна) ТЯ. За чутливістю та здатністю  забезпечувати  належну репродукцію  вакцинного штаму ЛК-М  вірусу КЧС вона  не поступається   відповідній первиннотрипсинізованій клітинній культурі.