МІНЛИВІСТЬ, РОДОВА І ВИДОВА АНТИГЕННІСТЬ BRUCELLA OVIS ТА СЕРОЛОГІЧНА ДІАГНОСТИКА БРУЦЕЛАОВІСНОЇ І ХЛАМІДІЙНОЇ ІНФЕКЦІЙ ПРИ ЗМІШАНОМУ ПЕРЕБІГУ

Краткое содержание

Дисертаційна робота виконана впродовж 1999–2002 років в лабораторії вивчення хвороб рогатої худоби Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН.

У двох вівцегосподарствах Харківської області: № 1 і № 2, проведено серологічний моніторинг та ретроспективний епізоотологічний аналіз благополуччя щодо ІЕ баранів і хламідіозу, з урахуванням рівня відтворення вівцепоголів’я та збереження приплоду, а також умов утримання поголів’я. Серологічні дослідження на інфекційний епідидиміт проводили в реакції імунодифузії (РІД) й реакції тривалого зв’язування комплементу (РТЗК) на інфекційний епідидиміт та в реакції зв’язування комплементу (РЗК) на хламідійну інфекцію за загально прийнятими методиками згідно з настановами по застосуванню з використанням комерційних діагностикумів, виготовлених в ДП “Ветеринарна медицина” та на Херсонській біофабриці. При постановці серологічних реакцій (РЗК і РТЗК) використовували сухий комплемент морської свинки і гемолітичну сироватку виробництва ЗАО “Біолік”, м. Харків, у робочих титрах.

В серологічних реакціях досліджено 3136 проб сироваток крові від тварин різних статево-вікових груп (вівцематок, баранів-плідників, ремонтного молодняка). На підставі отриманих даних проведено аналіз тенденції змін динаміки серопозитивності по господарствах у цілому та серед різних вікових груп баранів, а також рівня відтворення поголів’я .

Епізоотологічний аналіз спонтанного спалаху інфекційного епідидиміту баранів провели у трьох дослідних вівцегосподарствах Херсонської області: д/г “А”, “М”, “Т”. Для ідентифікації ізольованих культур використали методи запропоновані ФАО/ВОЗ (1986) та МЕБ (2000). Серологічну диференціацію культур B.ovis проводили в РА за допомогою Набору для серологічної диференціації культур бруцел, виготовленого в ІЕКВМ, ТУ У 24.4–00497087–654–2002.

Експериментальні дослідження на 20 ягнятах 5-ти місячного віку проводили в умовах експериментальної бази ІЕКВМ. Протягом 16 місяців вивчали серологічний статус тварин при змішаному перебігу латентних форм бруцелаовісної й хламідійної інфекцій у овець та вплив бактеринів B.ovis  на динаміку імунної відповіді. По закінченні досліду проведено діагностичний забій та бактеріологічні.

Статистичну обробку отриманих даних проводили за допомогою комп’ютерної програми “Stat SF”, розробленою в ІЕКВМ УААН.

Досліди по вивченню причин появи перехресних серологічних реакцій поміж антигенами збудників хламідіозу овець і інфекційного епідидиміту баранів проведено у трьох серологічних реакціях: пробірочній реакції аглютинації, реакції зв’язування комплементу та імуноферментному аналізі (ІФА). Реакцію аглютинації та реакцію зв’язування комплементу проводили за загальноприйнятими методиками. Імуноферментний аналіз проводили в Центральній державній лабораторії ветеринарної медицини, м. Київ, директор – кандидат ветеринарних наук М.С. Павленко,– за допомогою набору для визначення антигенів хламідій Chlamydia Microplate EIA, виробництва Sanofi Diagnostics Pasteur, Франція, що зареєстрований в Україні. В ІФА з моноклональними антитілами досліджували бруцелаовісні та хламідійні антигени. Реакцію проводили згідно “Інструкції щодо застосування імуноферментного набору для визначення антигенів Chlamydia trachomatis в клінічному матеріалі CHLAMYDIA MICROPLATE EIA, код 33081”, (1999).

Вивчено мінливість біологічних і антигенних властивостей культур 15 штамів B.ovis, які зберігались в музеї лабораторії вивчення хвороб рогатої худоби ІЕКВМ. Характеристику штамів визначали згідно методик, рекомендованих ФАО/ВОЗ (1986) та МЕБ (2000). Антигенні властивості досліджували в пластинчатій реакції аглютинації (РА) із бруцельозними S- та R- бруцельозними сироватками виробництва НВО “Рівес”, Росія, згідно настанови по застосуванню набору. З метою визначення морфо-тинкторіальних характеристик B.ovis для диференційної мікроскопії від хламідій 7-добові курячі ембріони заражали вакцинним штамом B.ovis 67/Б. У досліді використано 40 ембріонів. Розрахунок 50 % летальної дози проводили за методом Ріда й Менча.

Родо- та видоспецифічні антигенні властивості штамів B.ovis визначали у пластинчатій реакції аглютинації на предметних скельцях з антисироватками, одержаними в лабораторії вивчення хвороб рогатої худоби на штами B.ovis 67/Б, 76/982, 156/7807, які мали антигенну варіабельність. В роботі було використано 5 штамів B. abortus, 1 штам B. melitensis, 3 штами B. suis та 15 штамів B. ovis.

Родо- та видоспецифічні бруцелаовісні сироватки одержували проти бактеринів, виготовлених із штамів B. ovis 67/Б та 76/982. Для імунізації використано 10 клінічно здорових кролів, вагою 2–2,5 кг. Технологію виготовлення бактеринів та схеми імунізації розроблено в лабораторії вивчення хвороб рогатої худоби ІЕКВМ (автори: А.Ф. Бабкін, М.Г. Галіщев, С.В. Меліхов). Одержані сироватки перевіряли на стерильність за загально прийнятими методами, а також активність і специфічність у пластинчатій РА зі стандартними S- та R- бруцельозними антигенами комерційного виробництва (Росія), S-бруцельозним та R-бруцелаовісним антигенами власного виробництва, а також живими культурами бруцел в S-, R- та RS- формах.

Розроблено нормативну документацію та виготовлено дослідно-виробничу й виробничу серії “Набору для серологічної диференціації культур бруцел”.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Вивчення бруцелаовісної й хламідійної серопозитивності у вівцегосподарствах із низьким рівнем відтворення та при спонтанному спалаху інфекційного епідидиміту баранів. Серологічним моніторингом на бруцелаовісну та хламідійну інфекції у двох вівцегосподарствах Харківської області було визначено тенденцію серопозитивності серед отар баранів-плідників в умовах щорічного виявлення та вилучення серопозитивних на бруцелаовісну й хламідійну інфекції тварин, а також відтворення поголів’я. Особливу увагу в обох вівцегосподарствах привертав рівень виходу й збереження приплоду, який в останні роки становив у середньому 40 – 50 %. Як свідчать дані аналізу відтворення поголів’я, на початку наших досліджень вихід ягнят на 100 вівцематок становив 81 % у д/г № 1 і 52,4 % у д/г № 2. При подальших спостереженнях установлено тенденцію до зниження рівня відтворення поголів’я. Проте, в обох господарствах не реєстрували масових абортів (1–2 %). Низький вихід приплоду зумовлювали мертвонародження (10 %), загибель приплоду у перший місяць життя, а також яловість вівцематок у наслідок ендометритів, тощо.

Проведеними серологічними дослідженнями на бруцелаовісну та хламідійну інфекції встановлено, що в обох вівцегосподарствах у 1999 роках виявляли до 5,2 % тварин серопозитивних на ІЕ баранів і 19,7 % серопозитивних на хламідіоз у д/г № 1 та відповідно 4,9 і 13,2 % у д/г № 2. У 2000 році серопозитивність на обидві хвороби дещо знизилась, але у подальші роки, знову реєстрували підвищення кількості серопозитивних на ІЕ баранів тварин. У зв’язку з упровадженням у технологічну схему профілактичних заходів у 2001 році щеплення тварин проти хламідійного аборту овець, серологічні дослідження у 2001 та 2002 роках в обох господарствах, згідно з вимогами чинної настанови, не проводили.

Необхідно наголосити, що застосування для серологічної діагностики інфекційного епідидиміту баранів одночасно РІД та РТЗК додатково виявляло до 1,7 % серопозитивних тварин, тобто хворих на бруцелаовісну інфекцію. При порівняльному аналізі серопозитивності та рівня відтворення поголів’я, нами виявлено тенденцію, при якій підвищення кількості серопозитивних тварин у поточному році співпадало зі зниженням виходу ягнят в окітний сезон наступного року (рис. 1).

Проведений аналіз серопозитивності різних вікових груп серед отар баранів, свідчив про високий відсоток виявлення серопозитивних на ІЕ баранів та хламідіоз тварин у репродуктивному віці, 2 роки і старше, що вказує на високу значимість баранів у підтриманні епізоотичного процесу зазначених інфекційних хвороб.

Щорічне виявлення серопозитивних на бруцелаовісну та хламідійну інфекції тварин, низький рівень відтворення й збереженості приплоду при відсутності масових абортів дали підставу вважати, що в обох господарствах серед дорослого поголів’я, зокрема, баранів-плідників, реєструвався змішаний стаціонарний перебіг бруцелаовісної та хламідійної інфекцій. При такому перебігу зазначених хвороб культури збудників B.ovis або Chl.abortus виділити важко. У зв’язку з цим, чинні інструкції регламентують діагноз на ІЕ або хламідіоз ставити на підставі результатів серологічних досліджень та клініко-епізоотологічних даних. Бактеріологічними дослідженнями матеріалу від 15 баранів з обох вівцегосподарств, які проводились в лабораторії вивчення хвороб рогатої худоби і Харківською ОДЛВМ, культур B.ovis та Chl.abortus ізольовано не було.

У 2002 році у трьох вівцегосподарствах Херсонської області було зареєстровано спонтанний спалах ІЕ баранів, який характеризувався високим рівнем серопозитивності серед дослідженого поголів’я баранів (68-70 %). Високий рівень серопозитивності та аналіз інших епізоотологічних даних свідчив про тривалість епізоотичного процесу. Установлено порушення технологічної схеми утримання статево-вікових груп, коли всі групи овець утримувались на одній території, до групи дорослих баранів-плідників щорічно вводили молодих баранчиків у віці 1 рік. Привертає увагу і недостатній рівень відтворення поголів’я, хоча масових абортів у господарствах не реєструвалось. На тривалість епізоотичного процесу вказував також, у деякій мірі, низький процент виявлення позитивно реагуючих у РІД – 13,5 %.

Аналіз серопозитивності серед різних вікових груп баранів свідчив про високу інтенсивність інфікування вівцепоголів’я. Найвищі показники інфікування встановлено в групах баранів у віці від 2,5 до 5,5 років – 68,6 – 76,7 % (рис. 2).

Бактеріологічними дослідженнями біоматеріалу від забитих 20-ти серопозитивних баранів проведеними в Херсонській ОДЛВМ, лише від одного барана з придаткової статевої залози на МППГГА було ізольовано культуру, яку в лабораторії вивчення хвороб рогатої худоби ІЕКВМ за культурально-морфологічними та антигенними властивостями ідентифіковано і типовано, як B.ovis і занесено в реєстр штамів ІЕКВМ за № 175/1257.

Вивчення впливу інокуляції інактивованих бактеринів та живої культури Brucella ovis на динаміку серологічних зрушень при латентному перебігу змішаної бруцелаовісної й хламідійної інфекцій у ягнят. У лабораторному досліді на 20 ягнятах (11 баранчиків, 9 ярок) 5-ти місячного віку нами проведено довгострокові спостереження, протягом 19 місяців, серологічного статусу тварин щодо бруцелаовісної та хламідійної інфекцій до й після введення інактивованих бактеринів і живої культури B.ovis. На початку спостережень було виявлено три позитивно реагуючі тварини на бруцелаовісну інфекцію в РІД і п’ять на хламідійну в РЗК у титрі 1:10. Повторними дослідженнями через 10 і 23 доби було виявлено вже 5 ягнят (25 %) серопозитивних на бруцелаовісну інфекцію, а також зареєстровано підвищення титрів протихламідійних антитіл до 1:20. У чотирьох ягнят установлено одночасну серопозитивність на обидва захворювання. Зазначені дані свідчили про поступовий розвиток інфекційного й епізоотичного процесів на обидві інфекції. У віці 8 місяців тваринам було введено експериментальну інактивовану емульсин-вакцину проти ІЕ баранів. Поствакцинальна гуморальна відповідь через 21 добу після вакцинації була слабкою і виявлена у 35,7 % тварин в РТЗК у титрах від 1:5 до 1:20 порівняно з 21,4 % позитивно реагуючих тварин до вакцинації. Через 8 місяців після першої вакцинації, у віці 16 місяців, тваринам повторно було введено інактивовану емульсин-вакцини проти ІЕ баранів, яка зумовила імунну відповідь на бруцелаовісні антигени у 92,3 % тварин із середньогеометричними титрами 3,066 log₂. Результати досліджень на хламідіоз у цей же період свідчили про зниження кількості серопозитивних тварин, що вказувало на відсутність кореляції поміж серологічним статусом тварин на ІЕ та хламідіоз. Протягом наступних двох місяців бруцелаовісна серопозитивність поступово знижувалась. Привертає увагу, що саме в цей період, на спаді бруцелаовісної серопозитивності, значно поширилась хламідійна інфекція.

Через 3 місяці після вакцинації проти ІЕ баранів було проведено алергічну пробу бруцеліном ВІЕВ. При серологічному дослідженні через 14 днів після алерготесту виявили різке зростання кількості серопозитивних на ІЕ серед 14 дослідних тварин з 27,8 до 72,2 %. При цьому значно збільшилися середньогеометричні титри з 0,475 log₂ до 3,585 (Р<0,05). Заслуговують на увагу результати дослідження на хламідіоз у тіж строки. При серологічному дослідженні в РЗК через 14 днів після алергічної проби виявили достовірне підвищення середньогеометричних титрів антитіл з 0,475 до 4,013 (P<0,05). Рівень серопозитивності становив 94,4 % у порівнянні з попереднім дослідженням – 22,2 %. Тобто, введення бруцеліну по фону латентних бруцелаовісної й хламідійної інфекцій супроводжувалось підвищенням специфічних бруцелаовісних антитіл, а також протихламідійних. Необхідно зазначити, що введення алергену призвело до підвищення титрів протихламідійних антитіл у тварин, які раніше реагували за РЗК (№№ 25, 29, 64, 31, 34, 61, 72), та появу серопозитивності у негативних тварин (№№ 27, 32, 35, 38, 40, 58).

Через 3,5 місяці після вакцинації всім тваринам було підшкірно, в області пахової складки, введено живу культуру вірулентного штаму B.ovis 65/65939 в дозі 2×10⁹ м.к., що викликало підвищення титрів протибруцелаовісних антитіл при дослідженні через 21 добу, які було виявлено в усіх штучно інфікованих тварин. Граничні титри бруцелаовісних антитіл сягали від 1:10 до 1:160 (5,251 ±0,298 log₂). Дослідження сироваток від заражених тварин в РЗК з хламідійним антигеном виявило тенденцію до збільшення серопозитивності з 94,4 до 100 % тварин із середньогеометричним титром протихламідійних антитіл 4,108 ±0,270 log₂. Протягом наступних 1,5 місяців відбувалося поступове зниження серопозитивності на обидві інфекції.

Через 6 місяців після інокуляції живої культури B.ovis, було проведено алергічну пробу бруцеліном ВІЕВ з метою з’ясування рівня клітинної імунної відповіді, а також визначення впливу активності клітин імунної пам’яті. Алергічна реакція на бруцелін була негативною. При дослідженні сироваток крові через 14 днів після введення алергена, встановлено, що титри антитіл проти обох збудників зросли з 1,393 ±0,636 log₂ до 2,922 ±0,447 log₂ (Р<0,05) при дослідженні в РТЗК із бруцелаовісним антигеном, і з 1,593 ±0,755 log₂ до 2,658 ±0,743 log₂ (Р>0,05) – з хламідійним. Разом із тим, необхідно наголосити, що в даному випадку рівень підвищення титрів антитіл проти антигенів B.ovis і Chl.abortus був дещо меншим, ніж в першому дослідженні з бруцеліном, особливо це стосується протихламідійних антитіл.

При бактеріологічному дослідженні біоматеріалу від 10 забитих баранів у 2-х випадках від позитивно реагуючих баранів було ізольовано культуру B.ovis. Мікроскопією мазків-відбитків із внутрішніх органів пофарбованих за Стемпом і Романовським-Гімза від баранів №№ 27, 28 , 40 та 61 виявлено елементарні тільця хламідій. Усі ці барани були серопозитивні на хламідіоз у титрах від 1:5 до 1:20. Необхідно зазначити, що у баранів №№ 27 і 40 діагноз підтверджено серологічно, бактеріологічно та бактеріоскопічно на обидві хвороби.

За результатами клінічних і серологічних досліджень слід вважати, що серед поголів’я овець у 5–6-ти місячному віці реєструвався латентний перебіг бруцелаовісної й хламідійної інфекцій. Введення специфічних бруцелаовісних антигенів, зокрема, емульсин-вакцини проти ІЕ баранів або живої культури B.ovis, призводило до збільшення показників імунного статусу тварин, що свідчило про специфічну вторинну імунну відповідь латентно інфікованих тварин. Установлено, що введення сенсибілізованим тваринам R-бруцеліну не тільки підвищувало титри протибруцелаовісних антитіл, але й стимулювало параспецифічну імунну відповідь, що проявлялося підвищенням титрів антитіл на антигени хламідій.

З’ясування причин виявлення перехресних серологічних реакцій при дослідженнях із застосуванням бруцелаовісних і хламідійних антигенів. Нами проведено вивчення перехресних реакцій із застосуванням серологічних тест-систем в РА, РЗК та ІФА. В дослідах було використано специфічні бруцелаовісні та хламідійні антигени комерційного виробництва, які досліджували в перехресних реакціях із гомологічними й гетерологічними комерційними сироватками (хламідійними й бруцелаовісними) овець та гіперімунними сироватками кролів з установленням граничного титру сироваток й антигенів, а також із моноклональними протихламідійними антитілами. За результатами досліджень встановлено, що в РА стандартний R-бруцелаовісний антиген (НВО “Рівес”, Росія) аглютинувався бруцелаовісною сироваткою розведеною 1:80. У той же час, спостерігали позитивну реакцію аглютинації і з комерційною хламідійної сироваткою, але в значно нижчих титрах – 1:20. Аналогічний результат отримано і при дослідженні бруцелаовісного антигена ІЕКВМ для РА. Титри бруцелаовісної сироватки в РА з цим антигеном сягали 1:640, тоді як хламідійної сироватки – 1:10. В РЗК тільки в одному випадку зареєстровано неспецифічну реакцію, коли позитивна бруцелаовісна сироватка реагувала з хламідійним антигеном у розведені 1:10 ++. При дослідженні гіперімунних бруцелаовісних сироваток кролів в РЗК із хламідійним антигеном перехресних реакцій не виявлено (табл. 1).

Дослідження комерційних хламідійних антигенів (серії 6 і 3) у хламідійні тест-системі ІФА виявило позитивні результати: оптична щільність (ОЩ) становила від 0,998 (серія 6) до 1,287 (серія 3) одиниць при довжині хвилі 490 нм. В РЗК із позитивною хламідійної сироваткою ці антигени мали граничні титри розведені 1:256 та 1:64 відповідно. При дослідженні бруцелаовісних антигенів для РА та РТЗК у хламідійній тест-системі ІФА було одержано негативні результати. Оптична щільність з корпускулярним антигеном становила 0,057 одиниць, а з розчинним 0,045 одиниць, тобто не перевищувала значення показника KP/CUT-OFF.