ЗАСТОСУВАННЯ ПОЛІМЕРАЗНОЇ ЛАНЦЮГОВОЇ РЕАКЦІЇ ДЛЯ ДІАГНОСТИКИ ХЛАМІДІОЗУ СВИНЕЙ : Применение полимеразной цепной реакции ДЛЯ диагностики хламидиоза СВИНЕЙ

Краткое содержание

На захист виносяться наукові дані, одержані здобувачем за останні 5 років. Робота виконувалась на базі Полтавського філіалу Інституту ветеринарної медицини УААН, лабораторії генетики Інституту свинарства ім. О.В.Квасницького УААН, лабораторій біотехнології і клінічної біохімії та вивчення хворб великої рогатої худоби Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, лабораторії вірусології Полтавської обласної лабораторії ветеринарної медицини та 10 сільськогосподарських підприємств різних форм власності Полтавської та Дніпропетровської областей.

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). В основі методу ПЛР лежить комплементарна добудова ДНК - мішені, обмеженої специфічними праймерами, що здійснюється in vitro за допомогою ферменту ДНК-полімерази.

При застосуванні нами ПЛР для діагностики хламідіозу ДНК-мішенню є фрагмент ДНК хламідії, праймерами – олігонуклеотиди, комплементарні ділянкам генів, що кодують 16S рPHK, які мають універсальну довжину для усіх видів хламідій [Pollard D.R. et al.,1989, Kaltenboeck B. et al., 1993, Meijer A., 2000, Башмакова М.А. і співавт., 2001].

Полімеразна ланцюгова реакція складається з трьох основних етапів: виділення ДНК із біопроби, безпосередньо ПЛР (ампліфікації) та реєстрації результатів за допомогою електрофорезу.

Реєстрація результатів ПЛР-аналізу. Першим етапом є розподіл продуктів ампліфікації методом горизонтального електрофорезу, другим - аналіз результатів електрофорезу, тобто читання електрофореграми. В усіх зразках повинна виявлятися смуга, відповідна за рухливістю внутрішньому контролю розміром 308 пар нуклеотидів, яка вказує на те що ампліфікація пройшла нормально. В позитивних контролях повинна виявлятися смуга розміром 501 пара нуклеотидів, а в негативних контролях смуга на рівні позитивного контролю повинна бути відсутня (поява смуги в негативному контролі свідчить про контамінацію компонентів набору).

В досліджуваних пробах відсутність смуги суто на рівні позитивного контролю свідчить про відсутність даного збудника в пробі (негативний результат). Наявність смуги, відповідної за електрофоретичною рухливістю позитивному контролю, вказує на наявність хламідії в даній пробі (позитивний результат).

Реакцію зв’язування комплементу проводили за загальноприйнятою методикою з застосуванням хламідійного і контрольного антигенів; хламідійної (позитивної) і контрольної (негативної) сироваток; комплементу; гемолізину; досліджуваних сироваток; 2,5% суспензії еритроцитів барана.

Виділення та культивування хламідій на курячих ембріонах та білих мишах. Для зараження 6-7-денних курячих ембріонів (КЕ) та білих мишей із патологічного та клінічного матеріалу готували 10-20% суспензії на фізрозчині з шматочків головного мозку, легень та паренхіматозних органів аборт-плодів, загиблих та вимушено забитих тварин, сперми, тощо з додаванням стрептоміцину (0,1 г/см³). Для наступних пасажів використовували 10% суспензії з біоптатів білих мишей та КЕ попереднього пасажу без додавання антибіотика, дотримуючись стерильності на усіх етапах роботи.

Курячі ембріони заражали в жовткові міхури, білих мишей - інтраназально, інтраперитоніально та інтрацеребрально.

Мікроскопічні дослідження. Для мікроскопічних досліджень на хламідіоз готували мазки з проб сперми, мазки-відбитки з тканин головного мозку, легень, селезінки, печінки та нирок аборт-плодів, загиблих або вимушено-забитих свиней та лабораторних білих мишей і з жовткових міхурів КЕ, на яких культивувались суспензії досліджуваних матеріалів, які забарвлювали за Стемпом. Також досліджувались гістологічні препарати тканин органів поросят-гнотобіотів при експериментальному відтворенні хламідіозу.