РОЗРОБКА ТА УДОСКОНАЛЕННЯ ЗАСОБІВ СПЕЦИФІЧНОЇ ДІАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЬОЗУ ПТИЦІ : РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ средств специфической диагностики туберкулеза ПТИЦЫ

Краткое содержание

Роботу виконували протягом 2004 ‑ 2008 рр. у лабораторії вивчення туберкульозу Національного наукового центру «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини» (ННЦ ІЕКВМ), птахівничих господарствах різних форм власності Луганської, Донецької і Херсонської областей.

Клінічним і алергічним методами досліджено на туберкульоз 2831 курей-несучок, 16 страусів, 70 цесарок, 3 павичів, 100 перепелів, які перебували в особистих підсобних господарствах громадян, спеціалізованих птахогосподарствах різного напряму продуктивності та умов утримання, розташованих у зонах Степу і Лісостепу України, а також синантропну птицю.

Для туберкулінізації птиці використовували туберкулін очищений (ППД) для птиці Курської біофабрики, серія № 6, контроль № 6, виготовлений 15.11.03. Алерген вводили внутрішньошкірно інсуліновими шприцами в дозі 0,1 см³ (2500 ТО) курам і цесаркам у ліву сережку, а перепелам, павичам і страусам в ділянці шкіри зовнішнього боку гомілки лівої кінцівки. Страусам туберкулін вводили внутрішньошкірно безголковим ін'єктором БІ ‑ 7 у дозі 0,1 см³ (5000 ТО). Облік реакції здійснювали через 30 і 36 годин після введення алергена. Реагуючу на туберкулін птицю піддавали діагностичному забою.

Бактеріологічне дослідження патологічного матеріалу здійснювали згідно з «Настановою по діагностиці туберкульозу тварин та птиці», затвердженою ГУВ МСГП України в 1994 році. Бактеріологічним методом досліджено 57 проб свіжого та замороженого біоматеріалу, відібраного від 41 курки, 8 голубів, 1 шпака і 7 горобців.

Передпосівну обробку патологічного матеріалу від птиці проводили за методом А.П. Алікаєвої (1954). В культурах мікобактерій першої генерації вивчали морфологічні ознаки, тинкторіальні властивості ‑ в мазках, забарвлених за методом Ціля‑Нільсена; культуральні властивості ‑ морфологію колоній, швидкість і характер росту на яєчному живильному середовищі за температур 25^оС, 37^оС і 45^оС; фотохромогенність ‑ за методом G. Kubica, (1973), каталазну (З. Middlebrook, 1954) і амідазну активність (A. Taegnet et al., 1964) ‑ в модифікації Т.Б. Ільїної (1981); реакцію з теллуритом калію (J. Kielbu et al, 1969); гідроліз Твін‑80 (G. Wayne, 1962), стійкість до 5% натрію хлористого (D. Kestle, 1967), а також ріст на м’ясопептонному бульйоні.

Біологічні властивості мікобактерій, виділених з патологічного матеріалу, вивчали в дослідах на морських свинках, кролях і курах.

У процесі визначення видової належності ізольованих епізоотичних штамів мікобактерій для контролю були використані референтні штами мікобактерій M. avium, M. terrae, M. intracellulare, M. triviale, M. nonchromogenicum, які перебували в колекції культур лабораторії вивчення туберкульозу ННЦ «Інститут експериментальної та клінічної ветеринарної медицини».

Виділення протеїногенного штаму здійснювали шляхом селекції з використанням дев’яти штамів M.avium, які добре росли на середовищі Павловського на 20 день. Для цього робили висів на яєчне середовище в розведенні від 10^-1 до 10^-8. З типових колоній культуру пересівали на яєчне середовище і середовище Павловського для накопичення бактеріальної маси.

Бактеріальну масу, що виросла на середовищі Павловського, інактивували в автоклаві за температури 102^оС упродовж 60 хвилин. З інактивованої бактеріальної маси виготовляли антиген для ККРА. Виготовлений антиген перевіряли на повноту інактивації, стерильність, активність, специфічність, самоаглютинацію із сироватками крові та пробами крові здорових і експериментально заражених M. avium курей.

У процесі виготовлення туберкуліну очищеного (ППД) для птиці одержані шляхом селекції культури M. avium висівали на синтетичне живильне середовище ЗКП – 1 і через 60 днів визначали вихід бактеріальної маси з 1 літра середовища шляхом зважування її на аналітичних вагах.

Вміст білка в культуральному фільтраті M. avium визначали за методом Кельдаля (1960), після цього виготовляли три мікросерії туберкуліну очищеного (ППД) для птиці. У кожній серії виготовленого алергена визначали зовнішній вигляд, однорідність, стерильність, нешкідливість, рН, вміст гліцерину, натрію хлористого, фенолу, сенсибілізаційні властивості, специфічність та активність.

Сенсибілізаційну властивість туберкуліну вивчали в дослідах на здорових морських свинках після трьохразового з інтервалом 5 діб та через 15 діб, внутрішньошкірного введення в дозі 0,1 см³. Облік реакції на введення туберкуліну здійснювали через 24 години після останнього введення алергена.

Специфічність кожної серії окремо визначали в дослідах на здорових морських свинках і курах, які до початку досліду не реагували на туберкулін для птиці. Кожній окремо морській свинці з лівого боку, а курці в ліву борідку вводили дослідний алерген, а з правого боку та в праву борідку ‑ контрольний туберкулін для птиці. Облік реакції на туберкулін у морських свинок враховували через 24 години, а у курей ‑ через 30‑36 годин після введення.

Активність туберкуліну вивчали в дослідах на морських свинках, сенсибілізованих живою культурою M. avium. Згідно з ГОСТом 23881-79 кожне розведення (100 ТО і 500 ТО в 0,1 см³) внутрішньошкірно вводили в депільовані ділянки шкіри з лівого та правого боків тіла.

Нешкідливість кожної серії туберкуліну перевіряли в дослідах на білих мишах вагою 18 – 20 г, яким підшкірно вводили 0,25 см³ стерильного туберкуліну та спостерігали протягом 10-ти діб.

Біологічну активність кожної серії алергена вивчали порівняно з контрольною серією туберкуліну в дослідах на хворих туберкульозом курах. Для сенсибілізації морських свинок і зараження курей використовували виробничий штам M. avium ІЕКВМ УААН.

При визначенні нешкідливості, активності та сенсибілізаційних властивостей виготовлених серій туберкуліну для контролю використовували туберкулін очищений (ППД) для птиці Курської біофабрики, серія № 6, контроль № 6, виготовлений 15.11.03.

Для ліофілізації використовували бактеріальну масу штаму M. avium ЗСП ‑ 93, одержану на середовищі Павловського. Після бактеріоскопічного контролю культури на чистоту з бактеріальної маси готували суспензію, з вмістом 1, 100, 200, 300, 400 мг/см³ захисного середовища й розливали в ампули або флакони, вміст яких піддавали заморожуванню та ліофільному висушуванню.

Після ліофільного висушування ампули запаювали, а флакони закривали гумовими пробками, здійснювали контроль ефективності ліофілізації шляхом визначення залишкової вологи у висушеній культурі, морфологічні, тинкторіальні, культуральні, біохімічні, біологічні властивості, рівень життєздатності ліофілізованих культур M. avium і стерильність.

Як захисні суспензійні середовища при ліофілізації використовували стерильне сахарозо-желатинозне середовище (СВ), сахарозо-желатиново-агарове середовище (СЖА), сахарозо-желатинове середовище (СЖ).

Ліофілізацію M. avium здійснювали на установці «ОЕ ‑ 960» за температури конденсора -50 ^оС та вакууму не менше 100 мм рт. ст. Через 36 годин ампули з ліофільновисушеною культурою М. avium запаювали під вакуумом, а флакони закривали гумовими пробками.

Залишкову вологу в ліофільно висушених культурах визначали прискореним методом шляхом висушування в сушильній шафі за атмосферного тиску 100 мм рт. ст. й температури 100 ± 1 °С впродовж однієї години.

Вміст залишкової вологи в ліофілізованому матеріалі визначали за формулою: