ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ БАКТЕРИЦИДНОГО ДЕЙСТВИЯ ДЕЗИНФИЦИРУЮЩИХ ПРЕПАРАТОВ НА МИКОБАКТЕРИИ : ОЦІНКА ЕФЕКТИВНОСТІ БАКТЕРИЦИДНОЇ ДІЇ ДЕЗІНФІКУЮЧИХ ПРЕПАРАТІВ НА МІКОБАКТЕРІЇ

Краткое содержание

Робота виконана в період з 1991 по 2003 роки у лабораторії вивчення туберкульозу Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини Української академії аграрних наук, а також у лабораторії патоморфології Інституту загальної та невідкладної хірургії Академії медичних наук України.

У дослідах були використані референтні штами збудників туберкульозу бичачого, пташиного видів та атипових мікобактерій: Mycobacterium bovis (штам Vallee), M. avium (штам ІЕКВМ УААН), M. fortuitum (штам 122), M. intracellulare (штам 78–98), M. scrofulaceum (штам 31–82).

Тест-культури збудника туберкульозу бичачого виду M. bovis (штам Vallee) вирощували на гліцериновій картоплі Павловського протягом 30–45 діб, збудника туберкульозу пташиного виду M. avium (штам ІЕКВМ УААН) і атипових мікобактерій M. fortuitum (штам 122), M. intracellulare (штам 78–98), M. scrofulaceum (штам 31–82) – протягом 14–21 доби при температурі 37ºС.

Бактеріоскопічне дослідження тест-культур мікобактерій проводили шляхом фарбування препаратів за методом Ціля–Нільсена, з використанням  мікроскопу фірми «ЛОМО» (Росія), типу «Мікмед–1», при збільшенні 40×100.

У дослідах із визначення бактерицидної активності дезінфектантів використовували живильне середовище для культивування мікобактерій (Деклараційний патент України на винахід UA 29901А від 13.10.1997).

Для проведення досліджень біологічним методом використали 50 здорових морських свинок вагою 300–350 г.

Вивчена бактерицидна активність 25 препаратів і композицій з різних груп хімічних сполук щодо збудників туберкульозу та атипових мікобактерій.

Враховували, що в препаратах «Бациллол плюс», «Корзолекс базик», «Корзолін іД», «Кристал–900», «Біоклін», «Делеголь» основною діючою речовиною є глутаровий альдегід; у препаратах «Дезокс», «НУК–1», «Кристал–700» і «Дівозан форте» – перекис водню, оцтова та надоцтова кислоти. Основою препаратів «Ветазоль», «Водозоль» і БМСС–Т є біокиснева метало–силікогелева композиція. Бактерицидний ефект препарату «Віркон–С» обумовлений присутністю в його складі калію персульфату (50% складу).

Випробувані бактерицидні властивості препаратів: 1–хлор–2–нафтол (в основі – продукти нафтопереробного виробництва); «Йоддімекс» (в основі – йодистий калій та йод); «Тетрамікс»; «Септодор»; «Дисмозон пур»; «Баррисідал»; композиції препарату «Баррисідал» із формальдегідом і трихлороцтовою кислотою; «Хлорантоін»; «Біодор» і «Гембар».

Як контрольний бактерицидний препарат використовували загальновизнаний дезінфектант: 3%-ний лужний розчин формальдегіду.

Вивчення бактерицидних властивостей дезінфікуючих препаратів здійснювали згідно з методичними вказівками «О порядке испытания новых дезинфицирующих средств для ветеринарной практики», що затверджені Держагропромом СРСР у 1987 році.

Статистичну обробку результатів досліджень проводили з використанням методу критерію знаків Z, який відноситься до непараметричних статистичних критеріїв (Лакін Г.Ф., 1990).

Вивчення структурних змін, які відбуваються в клітинах мікобактерій при дії дезінфікуючих препаратів, вивчали шляхом електронно-мікроскопічного дослідження ультратонких зрізів клітин мікобактерій до та після дії дезінфектантів.

При цьому використовували тест-культури  збудника   туберкульозу   бичачого (штам Vallee) та пташиного видів (штам ІЕКВМ УААН), а  також  атипових мікобактерій  видів:  Мycobacterium fortuitum (штам 122), М. scrofulaceum (штам 31–82),  М. intracellulare (штам 78–98), які були вирощені на середовищі Павловського.

При проведенні електронно-мікроскопічного дослідження бактеріальну масу тест-культур мікобактерій переносили бактеріологічною петлею в дослідні та контрольні флакони ємкістю 20 см³. Масу мікобактерій визначали шляхом зважування флаконів із бактеріальною масою. В дослідні флакони вносили водні розчини дезінфектантів із розрахунку отримання в 1см³ розчину 100 млн. мікобактеріальних клітин. Електронно-мікроскопічному дослідженню піддавали культури мікобактерій, на які діяли наступними дезінфектантами: «Кристал – 700» (концентрація – 9%, експозиція – 3 години), «Біоклін» (концентрація – 2,5%, експозиція – 2 години) та в якості контролю – 3%–ний лужний розчин формальдегіду (експозиція – 3 години). В контрольні флакони замість розчинів дезінфектантів вносили стерильний ізотонічний розчин у відповідній кількості.

Після певної експозиції дії з флаконів видаляли розчини дезінфектантів і стерильного ізотонічного розчину, а бактеріальну масу тест-культур мікобактерій піддавали попередній фіксації у 2,5%-ному забуференому розчині глутарового альдегіду протягом 4–6 годин при температурі 4ºС. Потім проводили промивання отриманих препаратів тест-культур мікобактерій у забуференому ізотонічному розчині та здійснювали остаточну фіксацію у 1%-ному забуференому розчині оксиду осмію (ІV) протягом 2–3 годин при температурі  4ºС . Після фіксації бактеріальні клітини відмивали забуференим ізотонічним розчином та дегідрували в зростаючих концентраціях етилового спирту (50º, 70º, 96º, 100º) та ацетоні. Препарати тест-культур мікобактерій, після дегідрації у спиртах і ацетоні, вносили в суміш епоксидних смол. Полімеризацію блоків проводили в термостаті при температурі 60ºС  протягом двох діб.

Ультратонкі зрізи виготовляли на ультрамікротомі УМТП–6, наносили на підтримуючі сіточки та після контрастування цитратом свинцю досліджували під електронним мікроскопом ЕМВ–100 БР при прискорюючій напрузі 75 кВ.

У якості контролю використовували тест-культури мікобактерій, яких не піддавали дії  дезінфікуючих препаратів.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Розробка комплексної методики визначення

бактерицидних властивостей дезінфікуючих препаратів.

Вивчення бактерицидних властивостей потенційних  дезінфектантів. На попередньому етапі вивчення бактерицидних властивостей потенційних  дезінфектантів проводили згідно з методичними вказівками «О порядке испытания новых дезинфицирующих средств для ветеринарной практики». Досліди здійснювали з атиповими мікобактеріями виду Мycobacterium fortuitum в зв’язку з тим, що методикою саме їх  передбачено використовувати як тест-культури.

Вивчали бактерицидну дію препаратів «Ветазоль», «Водозоль», БМСС–Т, 1–хлор–2–нафтол, «Тетрамікс», «Хлорантоін», «НУК–1» і «Дезокс».

Встановлено, що випробувані в максимальних режимах застосування препарати «Ветазоль» (концентрація 35 мл/м³ та експозиція 30 хвилин), «Водозоль» (концентрація 15% та експозиція 30 хвилин), БМСС–Т (концентрація 30 мл/м³ та експозиція 30 хвилин), 1–хлор–2–нафтол (концентрація 20% та експозиція 1 година), «Тетрамікс» (концентрація 10% та експозиція 5 годин) і «Хлорантоін» (концентрація 5% та експозиція 2 години) не інактивували тест-культуру мікобактерій. Це свідчило про їх низьку бактерицидну активність щодо мікобактерій.

Препарати  «Дезокс» в концентрації 0,5%  і «НУК–1» в концентрації 0,5% інактивували тест-культуру мікобактерій протягом 1 години.

Удосконалення методики вивчення бактерицидних властивостей дезінфектантів. У процесі вивчення бактерицидних властивостей потенційних дезінфектантів було визначено ряд недоліків, які ускладнювали проведення дослідів за існуючою методикою. Вони виражались у великій трудомісткості  та багатоступінчасті проведення досліджень, у відсутності універсальної тест-культури атипових мікобактерій та невикористанні в якості тест-культури патогенних мікобактерій, що робило неможливим постановку біопроби на лабораторних тваринах. Крім того, використання в якості додаткового захисного фактору для забезпечення мікобактерій від дії дезінфектантів стерильної сироватки крові великої рогатої худоби або коней, що передбачено діючими рекомендаціями, було недостатньо обґрунтованим. Потрібен був вибір більш природного середовища, в якому мікобактерії знаходяться в тваринницьких приміщеннях. В якості такого середовища було вибрано гноївку.

З метою усунення перелічених недоліків, у існуючих методичних вказівках, нами була розроблена комплексна методика визначення бактерицидних властивостей дезінфектантів щодо збудників туберкульозу та атипових мікобактерій, яка склала основу «Методичних рекомендацій з визначення бактерицидної дії дезінфектантів, перспективних для знешкодження збудників туберкульозу в довкіллі». Дослідження з використанням цієї методики проводили за наступною схемою.

Попереднє визначення бактерицидної дії препаратів здійснювали у відношенні атипових мікобактерій. Для цього водні розчини потенційного дезінфектанту  різної концентрації вносили по 10 см³ у флакони ємкістю 20 см³. У контрольні флакони замість розчинів дезінфектанту вносили по 10 см³ стерильного ізотонічного розчину. В кожний флакон вносили по 0,2 см³   двомільярдної зависі атипових мікобактерій.

Після витримування певної експозиції дії дезінфектанту  проби зависі по 10 см³ переносили з флаконів у центрифужні пробірки. Вміст пробірок центрифугували при 3000 об/хв., протягом 30 хвилин. Для припинення дії дезінфектанту в дослідних пробах осад, що утворився після центрифугування, двічі відмивали на центрифузі стерильним ізотонічним розчином при 3000 об/хв., протягом 30 хвилин.

Аналогічно обробляли контрольні проби. Завись осаду з дослідних та контрольних проб висівали на живильне середовище для культивування мікобактерій. Відсутність або наявність росту колоній мікобактерій у пробірках із дослідними посівами, при наявності росту колоній мікобактерій у пробірках із контрольними посівами, були ознакою відповідно прояву або відсутності бактерицидних властивостей у дезінфектанту.

Заключне визначення бактерицидної дії препаратів здійснювали у відношенні збудника туберкульозу. Випробування проводили на тест-об’єктах: батистових смужках розміром 1×2 см, дерев’яних брусках та цементних плитках розміром 12×12×2 см. На дослідні та контрольні тест-об’єкти наносили суміш  тест-культури та стерильної  гноївки з розрахунку:  на 0,5 см³ гноївки – 1 см³ двомільярдної зависі мікобактерій. Дослідні тест-об’єкти обробляли розчином випробуваного дезінфектанту. На контрольні тест-об’єкти наносили лише стерильний ізотонічний розчин. Після закінчення випробуваного часу дії дезінфектанту з кожного дослідного тест-об’єкту робили зскрібок та змив стерильним ізотонічним розчином у стерильні чашки Петрі. Вміст чашок Петрі переносили в центрифужні пробірки. Центрифугування здійснювали при 3000 об/хв. протягом 30 хвилин. Для припинення дії дезінфектанту осад у пробірці двічі відмивали на центрифузі стерильним ізотонічним розчином. Суспензію осаду на стерильному ізотонічному розчині висівали на живильне середовище для культивування мікобактерій, а також використовували для проведення біопроби. Аналогічно обробляли зскрібок та змив із кожного контрольного тест–об’єкту. Всі досліди виконували в триразовому повторі.

Остаточний висновок про прояв або відсутність бактерицидної дії препаратів щодо збудника туберкульозу та атипових мікобактерій здійснювали на підставі біологічного дослідження лабораторних тварин, яким підтверджували результати культурального дослідження.

Розроблена нами комплексна методика мала наступні переваги. Попереднє визначення бактерицидної дії дезінфектантів щодо швидкоростучих мікобактерій дозволяло скоротити час їх вивчення в 2–2,5 рази в порівнянні з діючими методиками.

Обов’язкове використання в якості тест–культури патогенних мікобактерій робило можливим проведення біологічного дослідження на лабораторних тваринах для підтвердження результатів культурального дослідження.

Використання в якості додаткового захисного фактору для забезпечення мікобактерій від дії дезінфектантів стерильної гноївки замість сироватки крові наближало проведення дослідів до реальних умов їх застосування.

Попереднє визначення бактерицидної дії дезінфектантів

культуральним методом досліджень.

За розробленою комплексною методикою культуральним методом досліджень було проведено попереднє визначення бактерицидної дії щодо атипових мікобактерій 19-ти потенційних дезінфектантів.

Першу групу дезінфектантів становили препарати, що створені на основі використання глутарового альдегіду: «Бациллол плюс», «Корзолекс базик», «Корзолін іД», «Кристал–900», «Біоклін», «Делеголь». У другу групу увійшли препарати, що створені на основі використання перекису водню, оцтової та надоцтової кислот: «Дезокс», «НУК–1», «Кристал–700» і «Дівозан форте». Також були вивчені бактерицидні властивості препаратів, що створені на основі використання других хімічних сполук: «Септодор», «Дисмозон пур»,  «Виркон–С», «Баррисідал», композиції препарату «Баррисідал» із формальдегідом і трихлороцтовою  кислотою, «Йоддімекс», «Біодор» і «Гембар».

В якості контролю бактерицидної дії препаратів, що вивчались, використовували загальновизнаний дезінфектант: 3%-ний лужний розчин формальдегіду. Для визначення життєздатності тест-культури мікобактерій проводили висів двомільярдної зависі безпосередньо на живильне середовище без попередньої обробки дезінфектантами. Крім того, з зависі тест-культури мікобактерій готували мазки для світлової мікроскопії, які фарбували за методом Ціля–Нільсена.

Результати попереднього визначення бактерицидної дії дезінфектантів наведені в таблиці 1.

На підставі аналізу даних, наведених в таблиці 1, зроблено висновок, що препарати «Дезокс» (концентрація 0,5%, експозиція 1 година), «НУК–1» (концентрація 0,5%, експозиція 1 година), «Дівозан форте» (концентрація 3%, експозиція 1 година), «Баррисідал» у композиції з формальдегідом (концентрації відповідно 3% та 1%, експозиція 72 години), «Баррисідал» у композиції з  трихлороцтовою  кислотою (концентрації відповідно 3% та 1%, експозиція 72 години), «Йоддімекс» (концентрація 10%, експозиція 3 години), «Гембар» (концентрація 3%, експозиція 3 години), «Кристал–700» (концентрація 7%, експозиція 3 години), «Кристал–900» (концентрація 1%, експозиція 3 години) і «Біоклін» (концентрація 2,5%, експозиція 2 години) мають виражену бактерицидну дію щодо атипових мікобактерій.