ИНФЕКЦИОННЫЙ БРОНХИТ КУР (ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ И ХИМИОТЕРАПИИ С ПОМОЩЬЮ ПРЕПАРАТОВ ТРИАЗОЛИНОВОГО РЯДА) : ІНФЕКЦІЙНИЙ БРОНХІТ КУРЕЙ (ЕФЕКТИВНІСТЬ ВАКЦИНОПРОФІЛАКТИКИ І ХІМІОТЕРАПІЇ ЗА ДОПОМОГОЮ ПРЕПАРАТІВ ТРИАЗОЛІНОВОГО РЯДУ)

Краткое содержание

У роботі використовували вакцинні штами вірусу інфекційного бронхіту (ВІБ): Н‑120 (жива ліофілізована вакцина ТАД IB vac 1 Н‑120, 5 000 доз, титр 10⁶ ЕІД₅₀/см³, серотип Масачусетс); Ma‑5 (жива ліофілізована вакцина НОБІЛІС IB МА5, 2 500 доз, шт. Ма‑5, серотип Масачусетс); штам ЛІ‑2 (титр 10^6,26 ЕІД₅₀/см³, ізольований від птиці 150‑добового віку в Україні, та ізолят І‑1, виділений з інкубаційного яйця курей кросу Хаббард у Йорданії.

Біологічні об’єкти: 700 курячих ембріонів (КЕ) 9–11‑добової інкубації; 60 гусячих ембріонів (ГЕ); первинна культура клітин фібробластів курячого зародку (ФКЗ); культура перещеплюваних клітин Vero; 15 тис. курчат кросу Хаббард 1–40‑добового віку; 100  курчат кросу Хайсекс білий, 4 кролики.

Препарати триазолінового ряду ВПК‑108 (піперідіній 2-[5-(2-фуріл)-4-феніл-1,2,4-тріазол-3-ілтіо] ацетат) і румосол (морфоліній 3-(4-піріділ)-1,2,4-триазоліл-5-тіоацетат); фоспреніл (продукт фосфорілірування поліпренолів хвої, в основі якого динатрієва сіль фосфату поліпренолів).

Серологічний контроль напруженості імунітету курей різного віку проводили за допомогою реакції непрямої гемаглютинації (РНГА) та реакції затримки гемаглютинації (РЗГА). Експресивна хроматографічна імунореакція була застосована для виявлення вірусів інфекційного бронхіту і ньюкаслської хвороби у посліді та антитіл у сироватці крові птиці у птахогосподарствах Йорданії.

Реакцію імунної дифузії (РІД) для виявлення ВІБ у вірусовміщуючому ембріональному матеріалі ставили в агарі 1,5 %‑ї концентрації, забарвленому метиловим оранжевим, за Оухтерлоні. Використовували гіперімунну сироватку крові до ВІБ (штам Ма5), яку отримували на кроликах.

Електронну мікроскопію (ЕМ) проводили після ультрацентрифугування ВІБ (штам ЛІ‑2) у градієнті щільності 30 %‑ї сахарози та негативного контрастування в електронному мікроскопі ПЕМ‑125 К (АТ «SELMI», м. Суми).

Належність ізоляту ЛІ‑2 до родини Coronaviridae визначали у полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР) з системою праймерів ділянки S1 гену вірусу інфекційного бронхіту курей.

Ембріотоксичність ВПК‑108 та румосолу визначали за патологічними змінами у курчат, яким вводили випробувані концентрації речовин, у порівнянні з контролем. Противірусну активність щодо вірусу ІБК препаратів триазолінового ряду ВПК‑108 та румосолу вивчали у порівнянні з фоспренілом. Препарати ВПК‑108 та румосол у концентраціях 1,0 % (2 мг), 0,5 % (1 мг), 0,25 % (0,5 мг), 0,02 % (0,04 мг), 0,01 % (0,02 мг) вводили одночасно з ВІБ (штам Н‑120) у розведенні 10^–2, в об’ємі 0,2 см³  на хоріоналантоїсну оболонку (ХАО).

Культуру клітин ФКЗ вирощували у флаконах, ємністю 20 см³, посівна концентрація становила 850 тисяч клітин у 1 см³. Поживні середовища містили рівні об’єми середовищ 199 та Ігла, 10 % сироватки крові великої рогатої худоби. Оптимальну концентрацію препаратів триазолінового ряду та фоспренілу, що не зумовлює цитотоксичну дію (ЦТД) на клітини, визначали в моношаровій культурі ФКЗ.

Противірусну активність препаратів у культурі ФКЗ, яку після внесення їх на моношар клітин і після 5-, 10- та 15‑хвилинної експозиції клітини інфікували вірусом ІБК (штамом Ма‑5 або ЛІ‑2). Зниження титру вірусу після культивування у присутності препаратів по відношенню до титру вірусу, що культивувався без препаратів, та час прояву цитопатогенної дії (ЦПД) вірусу слугували критеріями оцінки противірусної активності препаратів у культурі клітин ФКЗ. Титр вірусу визначали за Рідом і Менчем та позначали в ЕІД₅₀/см³ або ТЦД₅₀/см³ у залежності від біологічної системи, використаної для титрування.

Вплив препаратів триазолінового ряду на організм курчат після триразового їх введення з наступним інтратрахеальним інфікуванням вірусом ІБК (штам ЛІ‑2) вивчали за циліарною активністю трахеї курчат, титром специфічних антитіл до ВІБ, гематологічними показниками крові, фагоцитарною активністю нейтрофілів, гістологічними змінами трахеї, індексом фабрицієвої бурси (ФБ), швидкістю осідання еритроцитів (ШОЕ), рівнем гемоглобіну (Нв). Гематологічні показники розраховували за К. С. Фоміною та В. І. Шмельніковою, швидкість осідання еритроцитів визначали за Т. Г. Панченковим, вміст гемоглобіну — за методом Салі, що викладені у довіднику «Лабораторні методи досліджень у клініці» під редакцією В. В. Меншикова (1987). Фагоцитарну активність нейтрофілів у відношенні Staphylococcus aureus (штам № 209) та бурсальний індекс розраховували за І. О. Болотніковим (1982).

Циліарну активність трахеї курчат, інфікованих вірусом інфекційного бронхіту курей після внутрішньом’язового введення препаратів триазолінового ряду, визначали в динаміці за шкалою балів (Мало А., 2002).

Статистичну обробку даних здійснювали з використанням комп’ютерної програми Excel XP Professional і пакету Statistica v.6.1.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Серологічний та вірусологічний моніторинг інфекційного бронхіту курей в Україні та Йорданії. Серологічний та вірусологічний моніторинги птахогосподарств сходу України та Йорданії впродовж 2005–2008 років дослідження свідчать про циркуляцію збудника інфекційного бронхіту серед курей м’ясного напрямку продуктивності та низьку ефективність профілактичних щеплень птиці. У ЗАТ «Ландгут Бройлер» у 2007 р. відмічали середньогеометричний титр антитіл від 3,17 до 4,63 log₂, при цьому кількість реагуючих із захисним титром антитіл до ВІБ від 3,75 log₂ не перевищувала 40 %, до 4,5 log₂ — 60 %. Аналіз даних сероконтролю, проведеного у 2008 р., вказує на низький рівень групового імунітету (40–50 % птахопоголів’я), середньогеометричний титр антитіл коливався від 3,0 до 4,5 log₂ у залежності від віку птиці та проведеного щеплення.

Імунізація гібридного молодняку в птахогосподарстві «Агроукрптаха» щодо ІБК у 2007 р. зумовила груповий захист на рівні тільки 40,0–56,7 % із середньогеометричним титром 3,4–3,8 log₂, тоді як у 2008 р. кількість захищеної птиці з рівнем антитіл 3,5–4,8 log₂ становила відповідно 25–50 %.

Напруженість імунітету курчат-бройлерів птахофабрики «Чернухінська» в 2007 р коливалась від 3,0 до 5,0 log₂, при цьому материнські антитіла реєстрували в титрах 3,0–4,6 log₂ і кількість реагуючих із захисним титром антитіл курчат становила від 25 до 85 % у залежності від строків щеплення батьківських стад проти ІБК. Стабільним у птахопоголів’я залишався титр антитіл 3,2 log₂ у 2008 році.

За аналізу збереженості курчат-бройлерів під час вирощування впродовж 2005–2008 рр. у птахогосподартвах Йорданії найвищу загибель птиці встановлено у 2005 р. (14,0 %). У залежності від віку вирощування відмічали збільшення цього показника від 0,7 до 5,3 %.

Дослідження жовтків яєць, відібраних на інкубаторній станції в Йорданії, за допомогою РНГА вказує на високий рівень післявакцинальних антитіл до вірусу ньюкаслської хвороби (1:32–1:1024). Найнижчий титр антитіл виявляли до вірусу віспи (1:4), інфекційного бронхіту (1:8–1:16), інфекційного ларинготрахеїту (1:4–1:32).

За допомогою експрес-методу імунохроматографії впродовж
2005–2008 рр. було встановлено наявність антитіл у сироватці крові курчат до ВІБ, вірусу ньюкаслської хвороби. При цьому кількість позитивних особин становила 41–60 % у залежності від року дослідження. Використання цього тесту підтвердило наявність вірусу інфекційного бронхіту у посліді.

Біологічні властивості ізоляту ЛІ‑2 вірусу інфекційного бронхіту курей. Розмноження ізоляту ЛІ‑2 ВІБ у курячих ембріонах супроводжувалось патологічними змінами з характерними ознаками дії ВІБ, а саме: загибеллю до 40 %, карликовістю та набряком ХАО до 100 %, збільшенням місткості екстраембріональної рідини у 15 % та крововиливами на тілі зародка.

Інфекційна активність ізоляту ЛІ‑2 після культивування в КЕ складала 10^6,26 ЕІД₅₀/см³. Культивування цього ізоляту у первинній культурі ФКЗ супроводжувалось округленням клітин з подальшим утворенням синцитію через 36 годин після інфікування. Інфекційна активність вірусу після розмноження у ФКЗ становила 10^5,2 ТЦД₅₀/см³, а ізоляту І‑1 ВІБ 10^4,0 ТЦД₅₀/см³.

Адаптація ізоляту ЛІ‑2 у гетерологічній культурі перещеплюваних клітин Vero супроводжувалася цитопатогенною дією вірусу за типом синцитію, час якої скоротився вдвічі після трьох послідовних пасажів. Титр вірусу у цій біосистемі становив 10^5,2 ТЦД₅₀/см³.

За морфологією ізолят ЛІ‑2 представлений віріонами неправильної форми із зовнішньою оболонкою у вигляді корони, при цьому розмір віріонів коливався від 122 до 169 нм.

За дослідження ізоляту ЛІ‑2 за допомогою полімеразної ланцюгової реакції його віднесено до родини Coronaviridae, роду Coronavirus.

За визначення патогенних властивостей вірусу інфекційного бронхіту, який виділено із яйця від курей кросу Хаббард з Йорданії (І‑1), для курячих та гусячих зародків встановлено схожість патологічних змін, які індукував ізолят ЛІ‑2 ВІБ, ізольований від курей в Україні. Титр цього ізоляту після 4‑го пасажу в КЕ становив 10 ЕІД₅₀/см³. У біопробі на курчатах 7‑добового віку спостерігали пригнічення, важке дихання, які проявлялись через 24–36 годин у 60 % курчат, при цьому не виявляли загибелі курчат.

Дослідження у РНГА парних сироваток від курчат, що знаходились у біопробі, показало приріст антитіл до ВІБ на 3 log₂. Позитивна РІД з ембріональним матеріалом після 4‑го пасажу та гіперімунною сироваткою до штаму Ма‑5 ВІБ підтвердила наявність вірусу в досліджуваному матеріалі від птиці з Йорданії.

Оптимізація противірусних доз препаратів триазолінового ряду ВПК‑108 та румосолу за ембріо- та цитотоксичністю. В експерименті випробувано різні дози препаратів ВПК‑108 та румосолу: 1 % (2 мг), 0,5 % (1 мг), 0,25 % (0,5 мг), 0,1 % (0,2 мг), 0,02 %(0,04 мг), 0,01 % (0,02 мг), які були інокульовані у КЕ 11‑добової інкубації на ХАО в об’ємі 0,2 см³. Румосол в 1 % (2 мг) в 100 % КЕ уповільнював згортання крові впродовж 12 годин охолодження зародків за температури + 4 С. У концентрації 0,25 % (0,5 мг) румосол зумовлював менший прояв ембриотоксичності порівняно з ВПК‑108 у цій же дозі. Під дією румосолу відбувався набряк ХАО у 40 % КЕ, що на 20 % нижче за ВПК‑108. Кількість КЕ з гіперемованою ХАО після введення румосолу була нижчою на 60% порівняно з ВПК‑108 (100 %). Одночасне введення 0,01 % (0,02 мг) ВПК‑108 зі штамом Н‑120 ВІБ сприяло зниженню до 33 % кількості зародків, що скручувались, тоді як 0,02 % (0,04 мг) препарату — на 25 %. В інфікованих на фоні 0,02 %‑ї концентрації ВПК‑108 (0,04 мг) відмічали 100 % гіперемію ХАО та її набряк, підвищений вміст уремічних солей в алантоїсній рідині, збільшення нирок, блідість серця.

Титр штаму Н‑120 ВІБ при культивуванні на фоні ВПК‑108 у 0,01 % концентрації (0,02 мг) в КЕ знижувався на 2,0 lg від початкового (10^6,0 ЕІД₅₀/см³), тоді як за концентрації 0,02 % (0,04 мг) — на 1–1,2 lg.

Уперше вивчено вплив препаратів триазолінового ряду на клітини моношарової первинної культури ФКЗ у порівнянні з фоспренілом. Для визначення концентрації препаратів з найнижчою цитотоксичністю готували розведення препаратів на розчині Хенкса: 1,0 % (10 мг/см³), 0,5 % (5 мг/см³), 0,1 % (1 мг/см³). Експозицію препаратів у моношарі ФКЗ перед зараженням ВІБ (штами Ма5 та ЛІ‑2) підбирали за збереженістю цілісності моношару та життєздатністю клітин, що знаходились у безпосередньому контакті з досліджуваними концентраціями ВПК‑108, румосолу та фоспренілу. Встановлено, що ВПК‑108 у кількості 1 мг/см³ за експозиції 5 та 10 хвилин не проявляли цитотоксичність, тоді як через 15 хвилин відбувалась руйнація 25 % моношару. За більш високої концентрації ВПК‑108 (10 мг/см³) за всіх експозицій проявлялась досить виражена цитотоксичність, що супроводжувалось руйнуванням моношару від 50 до 75 %.

Румосол у 0,1 % концентрації (1 мг/см³) проявляв аналогічну ВПК‑108 дію, тоді як у концентраціях 0,5 % (5 мг/см³) та 1,0 % (10 мг/см³) незалежно від експозиції викликав аналогічно фоспренілу 50–100 %‑у дегенерацію клітин моношару. Ураховуючи, що концентрація 1 та 5 мг/см³  ВПК‑108 і румосолу за експозиції 5 хвилин зумовлювали найменшу деструктивну цитотоксичну дію у моношарі клітин, ці концентрації були досліджені за визначення противірусної активності відносно ВІБ (штами Ма5 та ЛІ‑2) у порівнянні до фоспренілу.

Установлено, що 0,5 % концентрація (5 мг/см³)  ВПК‑108 сприяла більш тривалій збереженості життєздатних клітин у моношарі і менш інтенсивному прояву ЦПД вірусу (штам ЛІ‑2) при інфікуючій дозі 10^–1 ЕІД₅₀/см³. Інфікуюча доза 10^–2 ЕІД₅₀/см³ у присутності ВПК‑108 у цій же концентрації була менш ефективною, що забезпечувало збереженість 50 % життєздатних клітин моношару через 48 годин після інфікування.

Румосол у 0,5 %‑й концентрації (5 мг/см³) виявляв аналогічну ВПК‑108 дію щодо інфікованих ВІБ клітин. На фоні фоспренілу у 0,4 %‑й концентрації (4 мг/см³) вже через 12 годин після інфікування відбувалась загибель 50 % клітин моношару ФКЗ. Через 48 годин спостерігалась повна деструкція моношару клітин, інфікованих штамом ЛІ‑2 у дозі 10^–1 ЕІД₅₀/см³ на фоні фоспренілу.

Титр вірусу після культивування штаму ЛІ‑2 на фоні ВПК‑108 складав 10³ ЕІД₅₀/см³, румосолу — 10³ ЕІД₅₀/см³, фоспренілу — 10^2,3 ЕІД₅₀/см³. При вивченні інфекційної активності ВІБ (штам Ма5) у культурі ФКЗ на фоні ВПК‑108 у 0,5 % концентрації (5 мг/см³) встановлено зниження титру вірусу на 2,5 lg у порівнянні з контролем. Інфекційна активність штаму Ма5 на фоні 0,5 %‑ї концентрації (5 мг/см³) румосолу та 0,4 %‑ї концентрації (4 мг/см³) фоспренілу знижувалась до 1,8 та 1,5 lg відповідно.