МІКОБІОТА ЗЕРНА КУКУРУДЗИ ТА ТОКСИГЕННІ ВЛАСТИВОСТІ ГРИБІВ РОДІВ FUSARIUM LINK І ASPERGILLUS MICHELI
Тип:
Автореферат
Краткое содержание:
Робота виконувалась упродовж 2000–2005 рр. у науково-дослідній лабораторії кафедри мікробіології та вірусології Білоцерківського державного аграрного університету.
Матеріалом мікологічних досліджень були 90 проб зерна кукурудзи, відібраних у 2000–2002 рр. в колгоспах, агрофірмах та приватних підприємствах із 10 областей України: Київської, Вінницької, Житомирської, Кіровоградської, Херсонської, Одеської, Харківської, Миколаївської, Дніпропетровської та Донецької в період зберігання. Зразки середніх проб відбирали відповідно до діючих державних стандартів (ГОСТ 13586, 3–83). З метою проведення діагностичних досліджень із зерна кукурудзи сумнівної якості відбирали проби із місць з найбільш вираженими ознаками ураження.
Виділено та ідентифіковано за видовою приналежністю 527 культур грибів, токсикологічно досліджено 64 культури грибів роду Fusarium та 169 роду Aspergillus.
Для виявлення загальної мікобіоти зерно пінцетом по 6–7 штук розкладали в чотири бактеріологічні чашки з середовищем Чапека. З метою виявлення глибинної мікобіоти зерно протравлювали 3-відсотковим розчином формаліну і промивали стерильною водою, ділили надвоє і розкладали в чотири чашки з середовищем Чапека по 5–8 штук. Посіви культивували по дві чашки при 24 та 37 °С протягом тижня. Для отримання чистих культур, починаючи з 3-го дня росту, гриби відсівали на скошене середовище Чапека.
З метою вивчення кількісного складу мікобіоти зерно подрібнювали і готували серійні розведення. Для цього наважку подрібненого зерна масою 10 г заливали до 100 мл стерильною водою і струшували протягом 15–20 хвилин. Із отриманого розведення готували послідовні розведення в пробірках 1:100, 1:1000 та 1:10000, з яких у стерильні чашки Петрі вносили по 1 мл суспензії, заливали 15 мл розплавленого і охолодженого до 45 °С агару Чапека і перемішували коловими рухами. Кожне розведення висівали в 4 чашки і по дві інкубували при 24 та 37 °С. На 3–5-й день росту проводили підрахунок кількості колоній грибів та визначали вміст діаспор грибів в
5
одному грамі корму. Статистичну обробку отриманих результатів проводили за І.А. Ашмаріним і А.А.Ворбйовим (1962).
Ідентифікацію виділених грибів проводили за допомогою визначників грибів Н.М. Підоплічка (1946, 1953, 1977), В.И. Билай (1977). Для видової ідентифікації грибів роду Fusarium, що не утворювали конідій, застосовували метод мікрокультури (Билай В.И., Элланская И.А., 1983). Розміри конідій і міцелію грибів визначали мікроскопією роздавленої краплі на середньому збільшенні (40 x), а в деяких випадках в імерсійній системі (90 x) за допомогою окуляр-мікрометра.
Визначення видової належності виділених грибів роду Fusarium проводили у відділі фізіології та систематики мікроміцетів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за участю кандидатів біологічних наук І.О. Еланської та О.В. Соколової, яким автор висловлює щиру подяку.
Токсичність 64 штамів грибів роду Fusarium досліджували мікробіологічним методом (Рухляда В.В., Башмакова Е.В., 1988), який базується на встановленні пригнічення росту чутливого тест-мікроорганізму – Candida pseudotropicalisштам 44 ПК токсином грибів. Використовували два варіанти: метод паперових дисків та агарових блоків. Оцінку токсичності грибів проводили на підставі розміру зон пригнічення росту тест-мікроорганізму навколо дисків або блоків: слаботоксичні гриби утворювали зони затримки діаметром – до 15 мм, токсичні – більше 16 мм і нетоксичні – зон не утворювали.
40 культур грибів роду Fusarium, що мали токсичні властивості та пригнічували ріст тест-культури Candida pseudotropicalis штам 44 ПК, досліджували на здатність виробляти Т-2 токсин, НТ-2 токсин, діацетоксисцирпенол і неосоланіол. Кількісний уміст Т-2 токсину в культурах грибів визначали розробленим нами способом експресного визначення здатності грибів роду Fusarium продукувати Т-2 токсин (Рухляда В.В.та ін., 2005). У виявленого вперше нового продуцента Т-2 токсину гриба F. sambucinum (шт. 814/61 та 824/7) досліджували потенційну здатність продукувати цей токсин на різних видах рослинних субстратів та з'ясовували вплив факторів навколишнього середовища (температура, вологість та тривалість інкубування) на цей процес.
Кількісний уміст Т-2 токсину в культурах грибів визначали модифікованим методом тонкошарової хроматографії (ТШХ) з біоавтографією (Рухляда В.В., 1998).
Для вивчення впливу факторів навколишнього середовища на біосинтез Т-2 токсину використовували F. sambucinum штам 824/7. У
6
зволожені зернові субстрати масою 10,0 г у 100 мл колбах інокулювали двотижневі культури гриба на агарі Чапека і вирощували в термостаті при різних режимах.
Як природні поживні субстрати були досліджені стерильні зерна гречки, рису, пшениці, сої, проса, вівса, ячменю, жита, кукурудзи з білим та жовтим забарвленням зернівки та насіння соняшнику, на яких гриб вирощували протягом 14 днів при 25 °С та стільки ж часу – у холодильнику (4 °С).
При вивченні впливу температури на біосинтез Т-2 токсину гриб висівали на стерильні зерна жита, проса, ячменю, вівса, білої та жовтої кукурудзи масою 10 г у колбах ємкістю 100 мл та інкубували протягом 30 днів при 4, 12, 20, 24 і 37 °С.
Для вивчення впливу вологості субстрату на біосинтез Т-2 токсину гриб культивували на стерильних зернах проса, жита, ячменю, вівса, білої та жовтої кукурудзи різної вологості (14, 20, 30, 40 і 50 %) спочатку протягом 14 днів при 24 °С, а потім стільки ж часу витримували в холодильнику (4 °С).
Здатність виробляти зеараленон (F-2 токсин) та дезоксініваленол (ДОН) культури різних видів фузаріїв досліджували за допомогою ТШХ на пластинах “Silufol”. (Жбураев В.И., 1990). Пластину оглядали в УФ–254. Зеараленон виявляли у вигляді плям блакитно-зеленого кольору з Rf – 0,50, а після обприскування 20-відсотковим розчином H2SO4 в метанолі та прогрівання протягом 10 хв при 110 °С проявлявся плямами цегляного кольору.
Властивість продукувати моніліформін досліджували у 25 культурах грибів роду Fusarium різних видів:F. culmorum (1 шт), F. moniliforme var.lactis (17 шт.), F. solani (7 шт.) методом ТШХ на пластинах “Silufol” (Rabie C.J. et al., 1978). Пластину оглядали в УФ–254. Моніліформін проявлявся плямами блакитно-зеленого кольору з Rf – 0,25–0,3. Після обприскування плям моніліформіну 2,4-денітрофенілгідразином та прогрівання при температурі 110 °С протягом 10 хв, він проявлявся плямами червоно-коричневого кольору.
Для вивчення афлатоксиноутворюючих властивостей штами гриба Aspergillus flavus культивували в колбах об’ємом 100 мл з 20 мл цукрово-дріжджового середовища (ЦДС), потім інкубували в термостаті при 37 °С та досліджували методом ТШХ (Львова А.С. и др., 1978). Наявність афлатоксинів встановлювали шляхом огляду хроматограм в УФ–356. Афлатоксинів при проведенні досліджень не виявлено. Одночасно визначали наявність коєвої кислоти якісною пробою шляхом обприс-
7
кування пластин 1-відсотковим розчином хлорного заліза. При наявності коєвої кислоти з додаванням FeCL3 плями на пластинах забарвлювалися у червоний колір.
Для визначення токсичності 54 культури гриба A. fumigatus і 45 культур A. niger вирощували на агарі Чапека в чашках Петрі при температурі 37 °С протягом двох тижнів. Токсичні властивості грибів визначали мікробіологічним методом з використанням агарових блоків.
