ХВОРОБА МАРЕКА: ІНДИКАЦІЯ І ВИВЧЕННЯ БІОЛОГІЧНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ ЗБУДНИКА ТА РОЗРОБКА ЗАСОБІВ ДІАГНОСТИКИ

Краткое содержание

Робота виконана в лабораторії біотехнології Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН впродовж 2002-2005 років.

Епізоотичний стан з хвороби Марека в світі вивчали за даними Міжнародного Епізоотичного Бюро (МЕБ), а в Україні - Державного департаменту ветеринарної медицини МАП України і Центральної державної лабораторії ветеринарної медицини.

Індикацію та культивування вірусу ХМ здійснювали в культурах перещеплюваних (CEF) та первиннотрипсинізованих фібробластів ембріонів курей (ФЕК), качок (ФЕКач), індичок (ФЕІ) та перепілок (ФЕП), а також епітеліоцитів нирок курчат та курячих ембріонів, для виготовлення яких використано близько 200 курячих, 120 перепелиних, 30 качачих, 10 індичих ембріонів та 25 голів курчат добового віку. Первиннотрипсинізовані культури фібробластів отримували за загальноприйнятим методом (Сюрин В.Н., 1991), а клітин нирки курчати - за Miles A. (2001).

Патогенність польових ізолятів для курячих ембріонів вивчали за методом інфікування на ХАО та в жовтковий мішок (Сюрин В.Н., 1991; Sharma J., 1985). З цією метою використано близько 500 курячих ембріонів від племінного стада курей породи білий леггорн, крос Isa White благополучних з інфекційних хвороб господарств.

Біопроба на курчатах проведена шляхом інтраабдомінальної інокуляції вірусовміщуючих суспензій у дозі 500-700 ФУО/голову. Наявність та інфекційну активність вірусу в досліджуваному матеріалі (печінка, очини пір'я, нерви сідничного сплетіння, селезінка та головний мозок) визначали за вірусологічними методами в культурі клітин, а патотип досліджуваних штамів ВХМ - за методом Witter R.L. (1997) та RFLP за Kozdrun W. (2002).

Антигени для РДП та імунізації донорів одержували методом концентрування за допомогою фільтрувальних мембран в апараті типу АР‑102, преципітації білкової антигенної фракції додаванням 50% розчину ПЕГ-6000 або діалізу проти 50% розчину чи сухого ПЕГ‑6000. Для підвищення специфічності їх було виснажено від тканинних антигенів за допомогою протифібробластних сироваток.

Для гіперімунізації використали курей породи брама та кроликів чорно-вогняної породи, масою не менше за 2,5 кг. Курям антиген вводили внутрішньом'язово, підшкірно та внутрішньовенно за двома схемами (з і без використання ПАФ при першому введенні). Схема імунізації кроликів передбачала внутрішньовенне введення антигену. При першому введенні до антигену додавали 5 % димексиду.

Виділення сумарної ДНК з інтактної та інфікованої культури клітин або суспензії клінічного матеріалу (1:10) проводили за допомогою комерційних наборів ДНК-Sorb-A та ДНК-Sorb-В (Амплисенс, Москва, Росія) та фенольним методом (Аминев А.Г., 1997). Випробувано чотири системи праймерів: на серотипоспецифічні ділянки гену gB (Полехин С.В., 1998); на консервативну ділянку гену gD І серотипу ВХМ (Laurent S., 2001); для диференціації онкогенних і неонкогенних штамів ВХМ І серотипу за розміром амплікону гену Meq (Lee S.‑I., 2000).

Теоретичний розрахунок праймерів здійснювали за аналізом нуклеотидних послідовностей, опублікованих в EMBL GenBank. При аналізі консервативних ділянок використано програму BioEdit v.5.2.9. Дизайн праймерів проводився за допомогою програми AmplyX v.1.1.2 для Win98. Аналіз показників якості послідовностей та оптимізацію ампліфікаційних термоциклів здійснювали з використанням пакету програм OLYGOSoft. Праймери люб'язно синтезовані за запропонованими нами послідовностями Dr. D. Rasсhert (Laboratoire de Virologie, Centre de recherches de Tours, Франція).

Статистичний аналіз даних проводили за допомогою редактора електронних таблиць Microsoft Excel XP (2002) та пакету програм Statistica v 6.1 (Rus).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Епізоотологічні аспекти хвороби Марека в Україні. За даними МЕБ (О.І.Е., 2004), ХМ широко розповсюджена на всіх континентах земної кулі, окрім Антарктиди. В останні 7 років найбільша кількість випадків хвороби Марека у гострій формі щорічно реєструвалася в США, Аргентині, Австралії, Мексиці, Канаді, Чілі, Франції, Германії, Ірландії, Новій Зеландії, Норвегії, Китаї, В’єтнамі, Японії та ін. З країн пострадянського простору ХМ діагностується щорічно в Росії, Білорусії, Естонії, Латвії, Литві.