Порівняльна характеристика методів діагностики та їх удосконалення при хламідіозі сільськогосподарських тварин

Краткое содержание

Робота виконувалась протягом 2000–2007 років на кафедрі мікробіології, вірусології та біотехнології НАУ ВМЯБПТ Національного аграрного університету, на базі вірусологічного, бактеріологічного та патолого-анатомічного відділів Черкаської обласної державної лабораторії ветеринарної медицини, Полтавського філіалу ІВМ УААН.

Клініко-епізоотологічні, патолого-анатомічні дослідження проведені на 2779 головах великої рогатої худоби, 3205 головах свиней, що належали СПП «РВД-Агро» Черкаського району, ТОВ Агрофірма МКТ Чигиринського району, ТОВ «Плешкані», СТОВ а/ф «Маяк», СТОВ «Пальмира» Золотоніського району, ТОВ ім. Шевченка, СТОВ «Родина», ТОВ «Богодухівське», СТОВ «Лан», СТОВ ім. Чкалова, ПСП «Веселий Хутір» Чорнобаївського району, СТОВ «Перемога», ДСП «Агрокомплекс» Смілянського району, СТОВ «Новоселиця» Катеринопільського району.

У процесі досліджень використали 16830 курячих ембріонів, 1376 білих мишей, 928 морських свинок, 10 півнів. Імунологічними методами досліджено 7307 проб сироватки крові великої рогатої худоби, 6765 проб сироватки крові свиней. На наявність хламідій досліджено 3611 проб патологічного матеріалу від тварин та птиці.

У роботі використали клінічні, епізоотологічні, бактеріологічні, вірусологічні, гематологічні, імунологічні, статистичні методи досліджень.

Клінічне обстеження тварин, патолого-анатомічний розтин трупів проводили за загальноприйнятими методами. Епізоотологічне обстеження господарств проводили відповідно до «Методологических указаний по эпизоотологическому обследованию» (Бакулов И.А. и др., 1986).

Для дослідження на хламідіоз відбирали патологічний матеріал: а) від корів і свиноматок, які абортували: абортовані плоди або їх внутрішні органи, мертвонароджені плоди, вагінальний слиз, ділянки плаценти із геморагічними інфільтратами; б) від поросят, телят, інших тварин: ділянки головного мозку, шматочки печінки, селезінки, нирок, легень, лімфатичні вузли, синовій, кон’юнктивальні зскрібки; в) від кнурів і бугаїв – зразки сперми або вражені сім’яники. Проби доставляли в лабораторію у термосах з льодом.

З метою порівняльної оцінки мазки із досліджуваного матеріалу фарбували методами Романовського-Гімза, Стемпа, Маккіавелло, акридиновим оранжевим та обробляли антихламідійними діагностичними сироватками з антитілами, міченими ФІТЦ, для постановки реакції імунофлуоресценції (РІФ).

Для постановки РІФ використали «Набор флуоресцирующих иммуноглобулинов и контрольных сывороток для диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных» виробництва ВНДВІ (м. Казань).

Для виділення культур хламідій використали 5–6-добові курячі ембріони (КЕ), білих мишей та вагітних морських свинок.

Курячі ембріони заражали в жовтковий мішок у дозі 0,3–0,5 см³ суспензією із патологічного матеріалу, яку звільняли від бактерій і грибів центрифугуванням при 2–3-х тис. об/хв. протягом 15–20 хв з додаванням до надосадової   рідини   гентаміцину   (25   мкг/мл),   стрептоміцину    (100 – 200 мкг/мл), канаміцину (100 мкг/мл), ністатину (25 мкг/мл). Через добу при відсутності росту на МПА, МПБ, МППБ матеріал використовували для зараження КЕ.

Заражені КЕ інкубували в інкубаторі при температурі 37–39ºС з відносною вологістю повітря 55–60 % і двічі на добу проглядали в овоскопі. Ембріони, які загинули не раніше 4-ої доби після зараження, розтинали в умовах стерильного боксу, для дослідження відбирали жовтковий мішок. Після звільнення від жовтка з стінок мішка готували 20 % суспензію для наступного пасажу, з решти – готували мазки для світлової та люмінесцентної мікроскопії.

Білих мишей масою 16–20 г заражали в черевну порожнину  в  дозі    0,5 см³ або в грудну порожнину через міжреберні зони з правого боку в дозі 0,3 см³. Для визначення спектра патогенності виділених штамів хламідій білих мишей також заражали інтрацеребрально та інтраназально.

Вагітних морських свинок заражали підготовленим досліджуваним матеріалом у черевну порожнину в дозі 0,5 см³, або інтраторакально в дозі 0,3 см³. У випадку загибелі після розтину трупів готували 20 % суспензію із внутрішніх органів на фізіологічному розчині. Мазки із внутрішніх органів досліджували на наявність хламідійних структур світловою та люмінесцентною мікроскопією.

Імунологічні дослідження проводили з використанням реакції зв’язування комплементу (РЗК), непрямої гемаглютинації (РНГА), імуноферментного аналізу (ІФА), нейтралізації (РН).

РЗК ставили у вигляді прямого варіанта, мікрометодом, та непрямого варіанта (РНЗК), який позначають ще як інгібіторну РЗК і використовують для виявлення «неповних або блокуючих антитіл».

РНГА ставили з еритроцитарним діагностикумом, виготовленим ВНДВІ, м. Казань. Досліджувані сироватки розводили фосфатно-сольовим буфером з  1 % конячої сироватки 1:5 в пробірках Флоринського і інактивували у водяній бані при 56–58ºС. Проби сироваток розводили від 1:10 до 1:5120, розливали в U-подібні планшети в дозі 50 мкл, додавали еритроцитарний діагностикум по 20 мкл. Після змішування суміші планшети залишали при кімнатній температурі і через 1–1,5 години проводили облік реакції.

Реакцію ІФА ставили з використанням двох наборів: 1) набору Chlamydia psittaci bovine cypress diagnostics для виявлення антитіл у сироватці крові великої рогатої худоби; 2) тест-системи діагностичної імуноферментної «Chlamyliso test AB» для виявлення антитіл у сироватці крові будь-яких сільськогосподарських тварин. В останньому наборі так звана антивидова сироватка, мічена пероксидазою, замінена на рекомбінантний білок, синтезований в лабораторії вірусології НАУ за нашою участю. Для цієї реакції нами підготовлені завідомо позитивні хламідійні сироватки та завідомо негативні сироватки, які використані як контролі. Облік проводили не пізніше ніж через 3 хв. після зупинення кольорової реакції шляхом визначення оптичної густини в лунках у двохвильовому режимі (450/ 620 нм).

Виділені штами хламідій ідентифікували на підставі виявлення в препаратах характерних для хламідій морфологічних структур типу елементарних та ретикулярних тілець з використанням світлового та люмінесцентного мікроскопів. Остаточне визначення природи виділених штамів хламідій здійснювали за допомогою ПЛР, яку ставили на базі Полтавської дослідної станції ІВМ УААН під керівництвом ст. наукового співробітника І.М. Ксьонза. ПЛР ставили з використанням специфічних олігонуклеотидних праймерів, комплементарних ділянкам генів, що кодують 16 Sp РНК з універсальною довжиною для всіх видів хламідій.

Визначення титру виділених штамів хламідій проводили за показником LD₅₀ для курячих ембріонів за методом Ріда і Менча. Час загибелі ембріонів, як середньостатистичний показник, розрахували за методом O.J. Golub.

Експериментальне відтворення хламідіозу на поросятах-гнотобіотах провели разом із співробітниками Полтавської дослідної станції ІВМ УААН під керівництвом ст. наукового співробітника І.М. Ксьонза. В досліді використали штам А-2536, виділений із внутрішніх органів абортованих плодів свиноматки. Штам пройшов 6 пасажів через жовтковий мішок КЕ і мав титр 10^-4,16 ЕLD_50/0,4мл. Три групи поросят-гнотобіотів заражали 20 % суспензією жовткових мішків КЕ 6-го пасажу різними способами: інтраназально та орально; в черевну порожнину; інтраназально, орально, в черевну порожнину. Двоє поросят знаходились в контакті з зараженими, ще двоє, як контрольні, утримувались ізольовано.

Імунологічну характеристику хламідій визначали в дослідах перехресного зараження білих мишей, яких попередньо імунізували інактивованими штамами хламідій: штам ВС-2099 виділений із вагінального слизу корови, що абортувала; Т-1549 виділений із внутрішніх органів теляти з респіраторним синдромом; А-2536 виділений із абортованих плодів свиноматки; ДС-2562 виділений із внутрішніх органів свинки, що загинула. Інактивацію штамів перед імунізацією мишей  здійснювали  за  методом Ф.М. Хусаинова (2007).

Після закінчення імунізації білих мишей перехресно заражали в черевну порожнину відповідними активними штамами хламідій. Результат експерименту визначали за кількістю мишей, що вижили, на фоні 100 % загибелі тварин у відповідних контролях.

Імунологічну спорідненість виділених штамів хламідій визначали також шляхом постановки реакції нейтралізації (РН). Попередньо готували гіперімунні сироватки проти штамів хламідій ДС-2562 і Т-1549, виділених відповідно від свинки і теляти. Сироватки отримували шляхом 9-ти разових почергових внутрішньом’язових і внутрішньовенних ін’єкцій названих штамів півням. Після завершення імунізації в пробах сироватки крові півнів виявили антитіла до хламідіозного антигену в титрах 3 log₂ (РЗК), 4 log₂ (РНГА).

РН ставили на білих мишах, яким у черевну порожнину вводили відповідний штам хламідій в концентрації 100 LD_{50/0,4 мл} для КЕ у співвідношенні 1:1 по 0,25 мл з гіперімунною сироваткою. Суміш перед зараженням витримували в термостаті протягом 60 хв. Окремій групі білих мишей вводили аналогічну суміш, до якої додавали 2 ОД комплементу. Контрольні групи роздільно заражали чистими штамами хламідій, гіперімунною сироваткою та комплементом. Облік реакції здійснювали через 24 год. після загибелі мишей у відповідних контрольних групах.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Основні клініко-епізоотологічні, патолого-анатомічні дані та їх значення при діагностиці хламідіозу сільськогосподарських тварин. За наслідками проведеного епізоотологічного моніторингу та спеціальних лабораторних досліджень хламідіоз на території Черкаської області був зареєстрований серед великої рогатої худоби та свиней в переважній більшості районів. Незначна кількість неблагополучних пунктів щодо інших видів тварин пояснюється, в першу чергу, значним скороченням і навіть відсутністю деяких із них. Зокрема, відчутно скоротилось поголів’я коней, у більшості районів зникли вівці, кози, норки, зменшилось поголів’я водоплавної птиці.

Встановлено, що хламідіоз уражає всі вікові і статеві групи тварин і має тенденцію до міжвидової передачі. Факторами передачі інфекції в одних випадках виявились інфіковані корми, як це мало місце в КСП «Зоря» Черкаського району, де одним транспортом і одним обслуговуючим персоналом завозились корми на неблагополучну ферму великої рогатої худоби і вівцеферму, що призвело до появи хламідіозу серед овець. В інших випадках збудник хламідіозу легко передавався через молоко хворих корів, внаслідок чого захворіли поросята і ягнята, яким згодовували таке молоко. Корови виділяють збудника хламідіозу також з вагінальним слизом після патологічних родів або аборту. Так, із 649-ти досліджених проб вагінального слизу наявність хламідій була підтверджена виділенням збудника на КЕ та світловою мікроскопією в 145-ти пробах (22,3 %). Постійно збудник виділяється із внутрішніх органів абортованих плодів та тварин, що загинули. З 2432-х таких проб хламідії були підтверджені спеціальними дослідженнями в 739-ти (30,4 %) пробах. Досить високим був показник виділення хламідій із сперми бугаїв-плідників (113 позитивних проб із 412-ти досліджених), кон’юнктивального та носового слизу телят (40 і 15 % позитивних проб відповідно).

Встановлено, що стаціонарність вогнища хламідіозної інфекції постійно підтримують деякі види птиці та окремі види диких тварин. Оригінальний ланцюг передачі хламідіозу зареєстровано нами в спеціалізованому господарстві з вирощування качок (Золотоніський район). Від хворих голубів, які перебували на території качатників, заразились качки, від останніх контактним шляхом – телята. В іншому випадку серед голубів гастролюючого цирку виник орнітоз, переважна більшість птахів загинула. Шимпанзе, який мав контакт з хворими голубами, захворів з ураженням органів дихання та шлунково-кишкового тракту і загинув. Комплексним дослідженням матеріалів від голубів і шимпанзе був підтверджений діагноз  на хламідіоз.

Окрім голубів, носіями збудника хламідіозу виявились папуги, перепели, качки, гуси, із внутрішніх органів яких (33 проби) ми в 100 % випадків виділили хламідії. Підтвердженням наявності активного інфекційного процесу в організмі голубів є виявлення у сироватці їх крові антитіл до хламідіозного антигену в діагностичних титрах (із 18 досліджених проб (Чорнобаївський район) позитивними були 14 (77,7 %) в титрах 3–5,5 ± 0,92 log₂. Із 34-х проб сироватки крові голубів (Черкаський район) позитивними були 7 проб (20,5 %) з титрами 2-5 ± 1,2 log₂ (РЗК). Антитіла в РНГА виявили також у 13,6 % проб сироватки крові диких свиней в титрах 2,1-3,2 ± 0,8 log₂ та у 18,1 % проб косуль в титрах до 5 log₂ (± 1,2).

У ряді випадків хламідіоз може проявлятись як змішана інфекція. При дослідженні сироватки крові телят в РЗГА антитіла до вірусу парагрипу-3 виявлялись у 96,4 % в титрах 6,5–9,2 log₂, до рота-, коронавірусів – у 100 % випадків в титрах 4-8 log₂. Титри антитіл у парних сироватках підвищувались в діагностично достовірних величинах.

Хламідіоз може перебігати як у гострій, так і хронічній формах. Перша із них притаманна господарствам, в яких захворювання виникає вперше, або серед тварин, які до цього не хворіли. Різко підвищити активність інфекційного процесу з переходом хронічної форми в гостру можуть стресові ситуації, особливо у випадку перевезення тварин на далекі відстані. В одне із господарств Чорнобаївського району із Данії були завезені ремонтні свинки і кнурці, яких розмістили в окремих підготовлених ізольованих приміщеннях з нормальними умовами утримання і годівлі. Не зважаючи на це, через 1,5–2 доби тварини захворіли, переважно з ураженням органів дихання та травлення з розвитком орхітів, кон’юнктивітів, артритів. Із внутрішніх органів свинки, що загинула, був виділений штам хламідій ДС-2562. При дослідженні 30-ти проб сироватки крові хворих свиней антитіла до хламідіозного антигену в РЗК були виявлені в 9-ти пробах (30 %) у титрах 2–3 log₂. На підставі характерних клінічних ознак, даних патолого-анатомічного розтину та результатів лабораторних досліджень був поставлений діагноз на хламідіоз, який із латентної форми на фоні стресового впливу перейшов у гостру форму. При цьому бактеріологічними та вірусологічним дослідженнями не були виявлені інші найбільш поширені інфекційні хвороби.

При порівнянні клінічних ознак хламідіозу у великої рогатої худоби і свиней виявлена практично їх ідентичність, що пояснюється, в першу чергу, природою збудника, який здатний уражати всі органи і системи організму. Розвиток клінічних ознак знаходиться в прямій залежності від гостроти перебігу хламідіозної інфекції (табл. 1).

Із таблиці видно, що при первинному виникненні хвороби у корів, які раніше не хворіли, кількість абортів становить 52 %. У стаціонарно неблагополучних господарствах абортують 5–6 % корів.

Аборти відбуваються на 7–9-му місяцях тільності, в окремих корів – на 3–4-му місяцях. Нерідко корови народжують живих телят, проте внаслідок внутрішньоутробного зараження молодняк нежиттєздатний і гине в перші дні життя від 30 до 96 %.

У корів після аборту або патологічних родів спостерігається затримка посліду (31–45 %), розвиваються ендометрити (31–34 %) та мастити, на які припадає близько 24 %. Такі корови виділяють збудника хламідіозу з вагінальним слизом та молоком.