МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНА ДИФЕРЕНЦІАЦІЯ МІКОБАКТЕРІЙ, ВИДІЛЕНИХ В УКРАЇНІ, ТА ЇХ ФІЛОГЕНЕТИЧНІ ВЗАЄМОЗВ’ЯЗКИ

Краткое содержание

Роботу виконано в Національному науковому центрі «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини» впродовж 2003–2006 років, частину досліджень проведено під час стажувань у Федеральному дослідному інституті здоров’я тварин ім. Ф. Льоффлера (м. Йєна, Німеччина).

Культури досліджуваних мікобактерій було виділено від ВРХ, свиней, собак, сільськогосподарської, зоопаркової та синантропної птиці, а також із молока ВРХ, водопровідної води, силосу, навколишнього середовища в 11 областях України в період з 1982 по 2004 роки і були отримані з колекції культур лабораторії вивчення туберкульозу ННЦ «ІЕКВМ», Чернігівського інституту сільськогосподарської мікробіології УААН, обласних лабораторій ветеринарної медицини. Всього було досліджено 128 культур мікобактерій.

Культурально-морфологічні властивості всіх ізолятів мікобактерій досліджували з використанням 4 живильних середовищ: бульйону (7Н9 Meaddlebrook), агарвміщуючого (7Н10 Meaddlebrook) та яєчних (Stonebrink з піруватом та Ogawa з гліцеролом). Тинкторіальні властивості ізолятів досліджували в мазках, пофарбованих за методом Циля-Нільсена.

Визначення ефективності методів екстракції ДНК із бактеріальної маси мікобактерій проводили методом ПЛР шляхом ампліфікації десятикратних розведень (до 1:10⁴) екстрактів ДНК, отриманих у результаті гомогенізації суспензій мікобактерій у фосфатно-сольовому буфері та приведення їх до однакової концентрації методами ультразвукової дезінтеграції клітин, впливом мікрохвильового випромінювання, руйнуванням скляними бусинками, фенол-хлороформною екстракцією, нагріванням суспензії до температури 100±1 °С.

Видову диференціацію та генотипування досліджуваних ізолятів проводили з використанням ПЛР (10 систем родо- та видоспецифічних праймерів), РЕА-hsp65, споліготайпінгу, ГЕПП, секвенування гіперваріабельної ділянки 16S рДНК.

Множинне вирівнювання секвенованих послідовностей проводили з використанням програми CLUSTAL X v.1.83 на основі алгоритму матриці IUB. Філогенетичний аналіз було здійснено за допомогою програми MEGA v. 3.1. Філогенетичне древо розраховане за методом neighbour-joining. Матрицю відмінностей було сформовано на основі моделі Кімури. Статистичну вірогідність галуження визначали за допомогою бутстреп-аналізу.

Теоретичний розрахунок праймерів під час розробки тест-системи для детекції ДНК бактерій роду Mycobacterium методом ПЛР здійснювали за аналізом консервативних ділянок 16S рДНК нуклеотидних послідовностей, опублікованих у GenBank, EMBL, DDBJ. Дизайн праймерів проводили з використанням програми AmplifX v.1.10. Аналіз показників якості праймерів здійснювали за допомогою програми Oligo Analyser v.1.0.2.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Вивчення культуральних, тинкторіальних та морфологічних особливостей досліджуваних штамів мікобактерій. При мікроскопії мазків з культур мікобактерій спостерігали палички червоного кольору, характерні для мікобактерій. Під час культивування на живильних середовищах культури мікобактерій мали різноманітний характер росту. На щільних середовищах вони росли у вигляді різних за величиною, вологих і гладких або сухих і зморшкуватих, матових або блискучих колоній без пігменту (85 культур) або із жовтим пігментом різного ступеня інтенсивності, від кремового до помаранчевого й рожевого (40 культур). Деякі культури росли нерозрізненними дрібними колоніями у вигляді напилювання, формуючи суцільний газон сухуватого або слизького нальоту. 81 культура росла у S-, а 42 культури – у R-формі, дві культури росли як у R-, так і у S-формах. Найшвидші темпи росту фіксували в бульйоні 7Н9 Meaddlebrook. Первинний ріст M. bovis спостерігали на 16–36 добу, M. caprae – на 15–29 добу, M. avium – на 7–29 добу, M. doricum – на 42 добу, M. frederiksbergensе – на 4 добу, M. engbackii – на 9 добу, M. parascrofulaceum – на 7 добу, M.  confluentis – на 6 добу, M. hassiacum та M. elephantis – на 5 добу.

Порівняльні дослідження ефективності методів екстракції  мікобактеріальної ДНК. Для виділення ДНК із культур мікобактерій найменш ефективною (відсутня ампліфікація розведень 1:10³ та 1:10⁴) і водночас найбільш тривалою (2,5 год) виявилася фенол-хлороформна екстракція. Порівняно з нею інші методи фізичної екстракції були більш ефективними (отримано ампліфікацію розведення 1:10⁴) і швидкими – від 6 хв (руйнування клітин скляними бусинками) до 25 хв (решта методів). З огляду на такі критерії, як швидкість, трудомісткість, витрати на реактиви та обладнання, найбільш ефективним виявився запропонований нами метод екстракції ДНК шляхом обробки мікобактеріальних клітин нагріванням за температури 100±1 °С (Деклараційний патент України № 8094 від 15.07.2005).

Видова диференціація культур мікобактерій методом ПЛР. За результатами досліджень культур мікобактерій методом ПЛР із праймерами, специфічними до комплексу M. tuberculosis, позитивними виявилось 17 (13,6 %) зі 125 зразків ДНК мікобактерій. Усі ці культури було досліджено також і з праймерами, специфічними до M. bovis і M. tuberculosis, у результаті чого 16 (12,8 %) культур віднесено до виду M. bovis.