БІОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ЗБУДНИКА, УДОСКОНАЛЕННЯ МЕТОДІВ ДІАГНОСТИКИ ТА СПЕЦИФІЧНОЇ ПРОФІЛАКТИКИ ЛІСТЕРІОЗУ ТВАРИН

Краткое содержание

Дослідження проводили в період з 2003 по 2008 рр. у лабораторії анаеробних інфекцій ІВМ УААН, тваринницькому господарстві ДГ „Асканія Нова” Херсонської області, бактеріологічному відділі ДНДІЛДВСЕ, лабораторії кафедри лабораторної діагностики інфекційних захворювань сільськогосподарських тварин БДАУ.

У дослідах було використано 660 білих мишей, 20 кролів, 40 мурчаків,                       2 барани-донори еритроцитів та 6057 голів овець.

У роботі використовували 40 культур лістерій, з них Listeria monocytogenes становило – 15 польових ізолятів, L. ivanovii – 2, L. innocua – 10, L. seeligeri – 2,              L. welshimeri – 2, L. grayi – 8 відповідно. Культури виділені з з патологічного матеріалу від хворих тварин та трупів хутрових звірів, дрібної рогатої худоби, свиней, великої рогатої худоби, а також із харчових продуктів та сировини тваринного походження (м¢ясо птиці, шкіра та гузок гусячий) з тваринницьких господарств Херсонської, Кіровоградської, Чернівецької, Луганської, Вінницької, Черкаської та Івано-Франківської областей України, а також референс-штами Listeria monocytogenes № 1, одержані з колекції музею ДНКІБШМ. Для виготовлення концентрованої інактивованої вакцини проти лістеріозу тварин “Лістерисан”, “Набору еталонних тест-культур для ідентифікації лістерій”                       ТУ У 24.4 – 00699715-001:2007, а також для контролю активності вакцини “Лістерисан” використовували штами лістерій: Listeria monocytogenes № М-04 (виробничий, типовий, містить О-антигени типів І, ІІ); Listeria monocytogenes                   № АТСС 19112; Listeria ivanovii № 402; Listeria innocua № АТСС 33090. Крім того, для роботи використано штами E.coli, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, одержані з колекції музею ДНКІБШМ та Micrococcus lysodekticus (“Биохимреактив”, Олайне).

Дослідження штамів проводили за морфологічними, культуральними, біохімічними, біологічними властивостями згідно з ДСТУ ISO 11290-1:2003,                ДСТУ ISO 11290-2:2003, “Лабораторной диагностики листериоза животных и людей, меры борьбы и профилактики”, методичними вказівками „Организація контролю і методи виявлення бактерій Listeria monocytogenes у харчових продуктах та продовольчій сировині” і Міжнародним класифікатором бактерій Берджі.

Чутливість виділених культур до антибактеріальних препаратів визначали методом дифузії в агар згідно з прийнятими методиками із застосуванням паперових дисків, що містять антибіотики (Лабинская А. С., 1972, Антонов Б. Н. та ін., 1986).

Кількість лейкоцитів підраховували в камері Горяєва (Коротченко Н. В., Смиян Ю. П., 1987).

Лейкограму визначали трипольним методом (Краснов И. П.,                  Митюшин В. В., 1988.)

Для вивчення показників Т- і В-лімфоцитів використовували комплекс методів: для Т-лімфоцитів – тест спонтанного розеткоутворення (Е-РУК); для визначення субпопуляцій Т-супресорів, Т-хелперів та Т-кілерів – реакцію теофілінчутливості, а В-лімфоцитів – комплементарне розеткоутворення (ЕАС-РУК) за методикою Д. К. Новикова та ін. (1976) та В. М. Івченка та ін. (2003).

Показники ОФР вивчали за методикою И. М. Карпутя із співавторами (1993), Ю. Н. Федорова та ін. (1983; 1999.), завершеність фагоцитозу – за                                   З. Е. Матусісом (1955; 2003).

Лізоцимну активність сироватки крові (ЛАСК) визначали фотонефело-метричним методом за А. С. Козлюком (1987) на ФЕК при λ = 540 з використанням мікробної маси Micrococcus lysodekticus (“Биохимреактив”, Олайне).

Для визначення бактерицидної активності сироватки крові (БАСК) користувались методикою В. Ю. Чумаченка (1992) із застосуванням добової культури Listeria monocytogenes і подальшою нефелометрією на ФЕК (λ = 540).

Титри специфічних антитіл визначали за реакцією аглютинації, яку проводили класичним (або об¢ємним) методом до антигену Listeria monocytogenes (виробництва ІЕКВМ (м. Харків)) (Івченко В. М., Павленко М. С., 2003).

Напруженість імунітету (рівень титру специфічних антитіл) після щеплення тварин вакциною проти лістеріозу визначали за методикою Г. А. Красникова (1989).

Одержані результати досліджень обробляли методом варіаційної статистики на програмованому калькуляторі “Електроніка МК-61” та за допомогою персонального комп¢ютера. При цьому визначали середнє арифметичне (М), статистичну помилку середнього арифметичного (m), вірогідність різниці між середніми арифметичними двох варіаційних рядів за критерієм вірогідності (р), користувалися таблицею Стьюдента. Середній титр антитіл у серологічних реакціях визначали шляхом обрахунків середнього значення десяткового логарифма. Різницю вважали вірогідною, коли значення р дорівнювало або було меншим 0,05; 0,01; 0,001 (Никитин Н. М., Шайхаманов М. Х., 1996).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Вивчення епізоотичної ситуації з лістеріозу в Україні

За даними ветеринарної статистичної звітності в Україні за 2001–2007 рр. державними лабораторіями ветеринарної медицини проведено 21498 бактеріологічних досліджень патологічного матеріалу та біоматеріалу від тварин різних видів на лістеріоз. Діагноз підтверджено лише у 34 випадках (0,16 %): у 2001 році спостерігалось 5 випадків спалаху лістеріозу серед тварин (по 1 – у свиней та у ВРХ і 3 – серед ДРХ), у 2002 р.– 4 (1 – у свиней , 2– у ВРХ та 1 – при дослідженні інших видів патматеріалу), у 2003 р. – 14 (11 – у ДРХ, 2 – у свиней та 1 – у ВРХ), у 2004 р. – 1 (при дослідженні патматеріалу від хутрових звірів), у 2005 р. – 2 (у ДРХ), у 2006 р. – 6 (1 – у ВРХ та 5 – у свиней), у 2007 р. – 2 (1 – у ВРХ та 1 – при дослідженні патматеріалу від інших видів тварин).

У цей же період під час досліджень сироватки крові від різних видів тварин на лістеріоз виявлено специфічні антитіла лише у 34 випадках (0,01 %): у 2001 – 22            (19 – у ДРХ, 3 – у свиней), у 2004 р. – 5 у ДРХ, у 2006 р. – 1 у свиней, у 2007 р. – 6 у ДРХ.

Аналізуючи результати досліджень з виявлення лістерій у різних об¢єктах довкілля, бачимо, що з води централізованого водопостачання лістерії виділялися лише у 2 випадках з 394 (0,5 %), що пояснюється їх високою чутливістю до хлорвмістимих засобів, які використовуються для знезараження на системах водопостачання. Одним із факторів передачі інфекційного агента при лістеріозі є міські каналізації (29,9 %), стічні води тваринницьких комплексів (30,9 %), стічні води м¢ясокомбінатів та інших харчопереробних об¢єктів (30,6 %).

У ґрунті різних географічних зон України (переважно проби відкритого ґрунту для вирощування овочів) лістерії виявлені у 18,7 % .

У зв¢язку з погіршенням епідемічної ситуації щодо лістеріозу в багатьох країнах світу та в Україні гостро постало питання безпеки продуктів харчування та кормів щодо контамінації їх лістеріями.

За останні чотири роки здійснено 89777 мікробіологічних досліджень харчових продуктів, сировини тваринного походження та кормів на наявність Listeria monocytogenes , але виявлено її лише у 6 зразках (0,01 %): у 2005 р. – виділено з 1 зразка м¢яса, у 2006 р. – з 2 зразків (м¢яса та субпродуктів птиці), у               2007 р. – з 3 зразків (шкіра та гузок гусячий, м¢ясо).

Низький рівень виявлення хворих на лістеріоз тварин та продукції, контамінованої цим збудником, не відображає реальної ситуації щодо цього захворювання в Україні. У більшості випадків це пов¢язано з низькою якістю діагностикумів та відсутністю ефективної системи нагляду за поширенням захворювання.

Складною проблемою є виявлення збудника із різних видів матеріалу у зв¢язку із значною контамінацією їх супутньою мікрофлорою. На загальному мікробному фоні досліджуваного субстрату кількість лістерій, як правило, незначна, тому їх індикація утруднена.

Бактеріологічні дослідження

Визначення залежності індикації лістерій від способів підготовки патматеріалу та біоматеріалу і його висіву. Для даного досліду використовували проби патматеріалу, відібраного від 12 кролів, експериментально заражених лістеріями. Тварини гинули на 4–5 добу після зараження. На розтині трупів відмічали множинні некротичні вогнища в головному мозку, печінці, селезінці та нирках. Для визначення оптимальних умов індикації збудника посіви проводили різними способами: методом відбитків; пастерівською піпеткою; посів гомогенату, розтертого на стерильному фізіологічному розчині з піском та без нього; посів відбитком та гомогенатів проб, які витримували в термостаті за температури +37°С протягом 6 годин; посів відбитком та гомогенатів проб після 10-денного їх витримування в холодильнику за температури +4°С.

Найбільша кількість випадків виявлення лістерій одержана при підготовці             84 проб шляхом їх гомогенізації в ступці з піском (100 % проб) та без піску (57,1 %). В цих випадках лістерії виділені через 48 год, крім проби нирок (гомогенізація без піску), де лістерії виділені через 10 діб.

Попереднє витримування в термостаті чи в холодильнику не призводило до збільшення кількості випадків виявлення лістерій.

Найнижчі показники виявлення лістерій одержані при посіві відбитками тканин або пастерівською піпеткою.

Культивування лістерій. Для проведення порівняльної оцінки ефективності росту культур Listeria monocytogenes на різних живильних середовищах нами було виготовлено такі варіанти: м’ясо-пептонний бульйон (МПБ), МПБ з додаванням             6,5 % натрію хлористого, МПБ з додаванням 1,0 % глюкози, МПБ з додаванням           1,0 % глюкози та 2,0 % гліцерину, МПБ з додаванням 15,0 % жовткової емульсії та 0,5 % активованого вугілля, триптиказо-соєвий бульйон з дріжджовим екстрактом та бульйон Фрейзера з селективними компонентами (налідиксова кислота, літію хлорид, акрифлавін, ескулін, цитрат амонію заліза).

У результаті проведених досліджень встановлено, що накопичення бактеріальної маси L. monocytogenes відбулося в усіх запропонованих варіантах живильних середовищ і становило в середньому 3,510⁶ м. к. в 1 см³ середовища через 24 год культивування, 4,910⁶ м. к. в 1 см³ – через 48 та 72 год культивування та 4,610⁶ м. к.в 1 см³ – через 6 діб культивування.

Максимальне вірогідне накопичення лістерій зареєстровано в бульйоні Фрейзера (в середньому 5,110⁸ м. к. в 1 см³ середовища, р<0,001 по відношенню до традиційних живильних середовищ), триптиказо-соєвому бульйоні з дріжджовим екстрактом (4,010⁷ м. к. в 1 см³ середовища, р<0,001 – 0,05 по відношенню до традиційних живильних середовищ) та в МПБ з додаванням 15,0% жовткової емульсії й 0,5 % активованого вугілля (8,710⁶ м. к. в 1 см³ середовища, р<0,001 по відношенню до традиційних живильних середовищ). У контрольних традиційних живильних середовищах, які використовуються для культивування лістерій, ці показники були нижчими.

Для отримання чистих культур лістерій використовували тверді елективні середовища (середовище з калієм телуритом, ПАЛКАМ – та Оксфордський агари), що містять спеціальних селективні добавки, такі як літію хлорид, акрифлавін, ескулін, налідиксова кислота, цефтазидим, поліміксин В.

Вплив низьких температур на накопичення лістерій. Нами проведені досліди, суть яких полягала в тому, що культуру L. monocytogenes засівали на середовище Фрейзера, культивували в термостаті за температури +37°С протягом  48 год і визначали кількість мікробних клітин в 1см³ середовища. Потім бульйонну культуру лістерій ставили в холодильник за температури +4°С та через кожні 10 діб визначали в ній кількість мікробних клітин у 1см³.

Витримування культури в холодильнику сприяло накопиченню лістерій. Вже через 10 діб кількість мікроорганізмів збільшилась у 2,3 раза, через місяць – у 3,8 раза, а через 2 місяці у 9,4 раза порівняно з вихідними даними.

Ідентифікація лістерій. З метою підтвердження належності культур до роду Listeria проводили морфологічні дослідження, тести на каталазу та рухливість. Для диференціації лістерій від коринебактерій користувались методом Д. А. Васільєва (1994) з використанням 10-водного розчину ТТХ, а від збудника бешихи свиней – культивуванням на індикаторних середовищах з барвниками та в РА з позитивною лістеріозною сироваткою.

Лістерії являли собою поліморфні грампозитивні палички, розміщені під кутом у вигляді римської п¢ятірки або так званого „штакетника”. Добові культури бактерії, вирощеної при кімнатній температурі, були рухомими, знебарвлювали індикаторні середовища та давали позитивну реакцію з полівалентними лістеріозними сироватками.

Одним із важливих факторів вірулентності L. monocytogenes є лецитиназа. Цей фермент необхідний збуднику для виживання та розмноження лістерій в організмі інфікованих тварин. Але у разі культивування на середовищах, які містять лецитин, лецитиназна активність не проявлялася чи виявлялася дуже слабо внаслідок накопичення в середовищі екстраклітинного продукту, який синтезується збудником у процесі росту культури. Цей продукт, що виконує функції аутоcупресора, може бути нейтралізований гідрофобним сорбентом, наприклад активованим вугіллям. При цьому активізуються гени патогенності і відповідно зростає дія фактора патогенності в середовищі, в тому числі і лецитинази. Отже, цей феномен було використано для розробки методу диференціації L. monocytogenes як від непатогенних лістерій, так і від бактерій інших родів, які морфологічно нагадують лістерії. В результаті проведених досліджень виявлено, що Escherichia coli та Enterococcus faecalis не проявляли лецитиназної активності, тоді як Staphylococcus aureus та Staphylococcus epidermidis, навпаки, проявляли її як на середовищі без активованого вугілля, так і в його присутності.

Згідно з результатами досліджень оптимальною для спостереження за змінами продукування лецитинази лістеріями на жовтковому агарі є концентрація активованого вугілля 0,5 %.

У літературі є повідомлення, що можна диференціювати патогенні види лістерій від непатогенних за лецитиназною активностю (Ripio M. T. et al., 1996). Для уточнення цього питання нами було проведено дослідження з різними видами лістерій на наявність у них лецитиназної активності на поживному агарі з курячим жовтком за відсутності та в присутності активованого вугілля (0,5 %). Доведено, що індукція лецитиназної активності на жовтковому середовищі із сорбентом (активованим вугіллям) притаманна лише для L. monocytogenes.

Наступним етапом було визначення ферментативних властивостей лістерій: чисті бульйонні культури лістерій пересівали на середовища з вуглеводами, які витримували при +37°С протягом 10 діб. Лістерії розщеплювали з утворенням кислоти (без газу) глюкозу, мальтозу, трегалозу, саліцин та не розщеплювали  дульцит, інулін, рафінозу, маніт. Проведені біохімічні дослідження на полосках набору системи „API – лістерія”, результати яких можна було отримати вже через  24 год. За цими тестами можна зробити висновок, що спільним для усіх видів лістерій було розщеплення ескуліну та D-арабітолу, а глюкозу-1-фосфат та                     D-тагатозу вони не зброджували. L. monocytogenes відрізнялася від інших лістерій за негативними результатами DIM–тесту.

Вивчаючи гемолітичні властивості лістерій, виявили, що L. seeligeri давала незначний гемоліз, L. monocytogenes – вузьку чітку зону ß-гемолізу, а L. іvanovii –  широку, інші ж види лістерій не володіли гемолітичною активністю.

З результатів КАМП-тесту видно, що L. monocytogenes давала незначну зону розширеного гемолізу біля штриха Staph. aureus, а L. іvanovii – широку зону розширеного гемолізу біля штриха R. еqui, інші види лістерій не володіли гемолітичними властивостями.

Біологічна проба при лістеріозі. Патогенність 40 культур лістерій різних видів (L. monocytogenes – 16 ізолятів, L. ivanovii – 2, L. innocua – 10, L. seeligeri – 2, L. welshimeri – 2, L. grayi – 8 відповідно) вивчали на білих мишах, по 10 голів тварин заражали внутрішньочеревно змивом кожної однодобової агарової культури в дозі                0,5 см³.

У разі позитивної біопроби тварини гинули на 4–5 добу після зараження. На розтині трупів  піддослідних   мишей   відмічали   множинні  некротичні  вогнища  в

печінці, селезінці та нирках.

З шести видів досліджуваних лістерій лише 16 культур L. monocytogenes та              2 культури L. ivanovii виявились патогенними для лабораторних тварин.

Надалі специфічні властивості 16 культур L. monocytogenes та 2 культур                L. ivanovii перевіряли кон’юнктивальною пробою на мурчаках або дермонекротичною пробою на мурчаках та кролях на двох групах дослідних тварин по 10 голів у кожній. Тварин першої групи щеплювали експериментальним зразком вакцини проти лістеріозу „Лістерисан”, яку вводили підшкірно у дозі 1 см³ – для мурчаків та 5 см³ – для кролів.

Специфічні властивості цих видів лістерій спричиняли запальні процеси на кон¢юнктиві та шкірі піддослідних тварин. У щеплених вакциною проти лістеріозу тварин такі зміни не відбувались.

Визначення чутливості лістерій до антибіотиків. Культури                                    L. monocytogenes були резистентними до багатьох антибіотиків, на що вказує вузька зона затримки росту навколо 11 (39 %) дисків антибіотиків з використаних у тесті двадцяти п¢яти, до 10 (38 %) антибіотиків лістерії виявили високий рівень чутливості, у 5 (19 %) випадках їх чутливість була середньою. Всі ж 16 досліджених культур L. monocytogenes були високочутливими та чутливими до карбенциліну, цефазоліну, левофлоксацину, гентаміцину, амоксіциліну.

Засоби специфічної профілактики лістеріозу тварин

Слід відмітити, що вітчизняна біологічна промисловість не випускає протилістеріозної вакцини.

Визначення промислово-технологічного регламенту з виготовлення лістеріозного антигену. Створення бактерійної вакцини ми починали з підготовки живильних середовищ для культивування штамів, щоб вони сприяли збереженню характерної морфології мікроорганізму, містили в необхідній кількості набір амінокислот, який потрібен цьому мікроорганізму при його рості, мали оптимальну для його росту величину рН.

Для культивування виробничого штаму L. monocytogenes № М-04 нами було виготовлено та вивчено п’ять варіантів живильних середовищ. З метою пошуку оптимальних режимів культивування лістерій їх інкубацію здійснювали у двох температурних режимах на кожному із запропонованих середовищ (при +28°С2°С та при +36°С1°С). Через кожні дві–три години вирощування культуру перемішували протягом 2–3 хв.

Протягом періоду вирощування через кожні 24 год відбирали проби культури для мікроскопії, визначення величини pН та кількості мікробних клітин.

При порівнянні кінетичних характеристик було з¢ясовано, що показники росту лістерій на різних середовищах відрізняються за інтенсивністю накопичення бактерійної маси, тривалістю лаг- та експоненціальної фази росту, кінцевої концентрації культур при вирощуванні у визначених умовах.

Вірогідний інтенсивний ріст лістерій (р<0,001 відносно вихідних та попередніх даних) спостерігали, як правило, на третю добу на середовищах, збагачених жовтковою емульсією та глюкозою при +36˚С1˚С або з 13 % гліцерину при +28˚С2˚С в порівнянні із традиційними середовищами.

Порівняльна характеристика умов інактивації та депонування лістеріозного антигену. Основною метою інактивування антигенів є збереження протективних антигенів у більш природньому стані. Тому прикладні дослідження з конструювання інактивованих вакцин спрямовані перш за все на постійний пошук “ідеального” способу інактивації. Вони передбачають підбір засобів та методів інактивації, які руйнували б нуклеїнові кислоти збудника, структури, відповідальні за розмноження, але залишали б інтактними антигенні структури білково-поліцукрових молекул, відповідальних за імуногенність.