ИММУНОГЕННОСТЬ И АНТИГЕННОСТЬ ИНАКТИВИРОВАННЫХ ЭМУЛЬСИН–ВАКЦИН ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО ЭПИДИДИМИТА БАРАНОВ ИЗ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS И BRUCELLA OVIS

Краткое содержание

Дисертаційна робота виконана впродовж 1989-2002 рр. в лабораторії вивчення хвороб рогатої худоби та на експериментальній базі Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини ІЕКВМ УААН. В дослідженнях використано 9 штамів B. abortus, B. ovis і B. melitensis, 2 комерційних алергени (бруцелін, бруцелоовін), 109 баранів, 250 морських свинок, 12 кролів та 110 білих мишей. При визначенні гуморального імунітету досліджено 4194 проби сироватки, клітинного імунітету 1260 та 862 проби крові при гематологічних дослідженнях. Бактеріологічно досліджено біомате-ріал від 109 баранів (2071 об’єкт) та 219 морських свинок (2105 об’єктів).

Культурально-морфологічні та біологічні властивості 2-х вакцинних штамів B. abortus 7-26, B. ovis 67/Б (ІЕКВМ) і 3-х вірулентних штамів B. ovis 65939, B. ovis 8406, B. ovis 08337 вивчали за методами, запропонованими ФАО / ВОЗ (1986) та МЕБ (2000). З метою здешевлення технології та оптимізації виготовлення інактивованої емульсин-вакцини селекційовані клони B. ovis 67/Б-1 та 67/Б-2.

Інактивацію бактеріальних суспензій B. abortus та B. ovis з концентрацією від 25,0х10⁶ до 50,0х10⁹ м. к./ см³ проводили 0,4 % комерційним формаліном. Повноту інактивації перевіряли шляхом бактеріальних висівів за ГОСТ 28085-89. Інактивовані емульсин-вакцини одержували шляхом швидкісної гомогенізації інактивованої суспензії бруцел з масляним ад’ювантом ВНДЯІ або Montanide ISA 70 на гомогенізаторі Type MPW 302, а гідроокисалюмінієву (ГОА) вакцину шутулюванням на шутель-апараті суспензії бруцел з 20 % гідроксалом та наступним витримуванням для адсорбції в термостаті t 37±0,5^О С. Виготовлено 17 експериментальних серій інактивованих вакцин із штамів B. abortus 7-26, B. ovis 67/Б, клонів B. ovis 67/Б-1 та 67/Б-2. На етапах виготовлення окремих антигенних компонентів і вакцин проводили контроль стерильності та нешкідливості. Нешкідливість вакцини досліджували в біопробі на двох морських свинках і 10 білих мишах на кожну серію препарату. Надалі нешкідливість визначали за ГСТУ 46.024-2002. Реактогенні властивості вакцин досліджували після їх введення візуально клінічним спостереженням за станом тварин, появою локальних змін, а також термометрією.

Вірулентні властивості контрольного штаму B. оvis 65939 визначали в досліді на 20 морських свинках після підшкірного введення культури в дозах від 2,0х10⁵ до 2,0х10⁹ м. к. та в досліді на 16 баранах шляхом аплікації на кон’юнктиву і слизову оболонку препуція в дозах від 10,0х10⁷ до 10,0х10⁹ м. к. Бактеріологічні дослідження біоматериалу тварин проводили відповідно до “Настанови по діагностиці бруцельозу тварин” (1982, 1998) та “Методичних рекомендацій по бактеріологічній діагностиці бруцела овіс инфекції” (УНДІЕВ, 1987).

Гуморальну імунну відповідь у тварин вивчали серологічним дослідженням сироватки крові тварин на бруцельоз в РБП, РА, РЗК і на інфекційний епідидиміт в РТЗК, реакції імунодифузії (РІД). Серологічні реакції ставили за загально прийнятими методиками згідно з настановами по застосуванню з використанням комерційних діагностикумів, виготовлених на Херсонській біофабриці, в ДП “Ветмедицина” (Україна) та НВО “РІВЕС” (Росія). Реакцію аглютинації проводили також з застосуванням виготовленого нами бруцельозного антигену з штаму B. abortus 7-26.

Клітинну імунну відповідь у щеплених і контрольних баранів вивчали в опсоно-фагоцитарній реакції (ОФР) та специфічного лізису лейкоцитів (РСЛЛ). При дослідженні крові методом ОФР за В.А. Штрітером (1940) визначали інтенсивність фагоцитозу (фагоцитарне число) та фагоцитарну активність лейкоцитов відносно суспензії B. ovis 65939 з оцінкою результатів за В.Є. Чумаченко (1990). Специфічну гіперчутливість лейкоцитів визначали РСЛЛ з бруцеліном за Г.А. Об’єдковим (1989) та з бруцелоовіном. Гематологічні дослідження крові (визначення кількості лейкоцитів та лейкоцитарної формули) проводили за загальноприйнятими методами.

В порівняльному досліді на 109 морських свинках вивчили імуногенність живої (кон’юнктивальна аплікація в дозах 5,0х10⁷ і 4,0х10⁸ м. к.) та інактивованої емульсин-вакцини (підшкірна вакцинація в дозах від 25,0х10⁶ до 2,0х10⁹ м. к.) з штаму B. abortus 7-26 в порівнянні з підшкірним введенням живої вакцини в дозі 25,0х10⁷ м. к. Інактивовану емульсин-вакцину з штаму B. abortus 7-26 досліджено на 67 баранах при підшкірному введенні в дозах 5,0х10⁶-50,0х10⁹ м. к. в порівнянні з живою вакциною в дозі 5,0х10⁹ м. к.

В комісійних дослідах на 75 морських свинках і 26 баранах провели випро-бування інактивованої емульсин-вакцини проти інфекційного епідидиміту баранів з штаму B. ovis 67/Б та його клонів 67/Б-1, 67/Б-2 на основі масляних ад’ювантів російського і французського (Montanide ISA 70) виробництва.

Статистичну обробку отриманих даних проводили за допомогою комп’ютерної програми “Stat SF”, розробленою в ІЕКВМ УААН.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Вивчення культурально-морфологічних та біологічних властивостей вакцинних штамів Brucella abortus та Brucella оvis. Культурально-морфологічні та антигенні властивості вакцинних штамів B. abortus 7-26 та B. ovis 67/Б стабільно зберігалися впродовж 10 років шляхом пересівів на щільних живильних середовищах з інтервалом 30-45 діб або в ліофілізованному стані. Встановлено, що культура B. abortus 7-26 (RS– форма) росла на бруцельозному середовищі (МППГГА) в вигляді напівпрозорого нальоту, утворювала сірководень, росла на напіврідкому агарі з фуксином в концентрації 1:50000, була чутливою до бактеріофагу Тб, аглютинувалась S– та R– бруце-льозними сироватками і 0,2 % розчином трипафлавіну, утворювала осад через 72 години в пробі термофлокуляції. Після фарбування за Уайт-Вільсоном колонії мали фіолетовий колір із червоним відтінком у центрі. Біологічні властивості культури B. ovis 67/Б свідчили, що штам стабільно зберігав ознаки для B. ovis в типовій R– формі: культура росла на бруцельозному середовищі з сироваткою в умовах підвищенного вмісту СО₂ в атмосфері культивування, не продукувала Н₂S, росла на напіврідкому агарі з тіоніном в концентрації 1:50000, позитивно реагувала з R– бруцельозною, R– родо та видоспеци-фічними бруцелаовісними і негативно з S– бруцельозною сироватками; мала аглютинацію в трипафлавіновій пробі та реакції термоаглютинації. Після фарбування за Уайт-Вільсоном колонії культури на щільних середовищах мали синьо-фіолетовий колір.

Нами селекційовані клони B. ovis 67/Б-1 і B. ovis 67/Б-2, що стабільно зберігали антигенні властивості вихідного штаму B. ovis 67/Б та відрізнялися накопиченням і більш легким змивом бактеріальної маси (концентрація суспензії 176,2х10⁹±12,7 та 169,4х10⁹±13,2 м. к./ см³) при вирощуванні на щільних бруцельозних середовищах без сироватки крові тварин і без підвищенного вмісту СО₂ в атмосфері.

Вивчення вірулентних властивостей контрольного штаму B. ovis 65939 в дослідах на 20 морських свинках та 16 баранах свідчило, що інфікуюча доза, яка викликає зараження 50 % (ІД ₅₀) дослідних тварин склала: для морських свинок – 0,36х10⁶ м. к./ см³, для баранів – 8,13х10⁸ м. к./ см³. Інфікуюча доза 2,0х10⁸ м. к./ см³ після підшкірного введення викликала зараження 100 % морських свинок з генералізованою формою інфекції, індекс інфікованності (І. І.) – 25,0 %. В досліді на баранах інфікуюча доза 10,0х10⁹ м. к./ см³ після одночасної аплікації на слизову оболонку очей та препуція викликала зараження 100 % тварин з генералізованою формою інфекції, індекс інфікованності становив 15,3 %.

Порівняльне вивчення імуногенних властивостей живої та інактивованої вакцин із штаму Brucella abortus 7-26 на морських свинках. В трьох дослідах на 109 морських свинках вивчили приживлюваність та гуморальну імунну відповідь після кон’юнктивальної аплікації живої та підшкірного щеплення інактивованої вакцин із штаму B. abortus 7-26 відносно бруцельозного та бруцелаовісного антигенів. В першому досліді 24 морські свинки (по 12 голів в групі) вакцинували шляхом аплікації на кон’юнктиву по 0,2 см³ 25,0х10⁷ і 2,0х10⁹ м. к. (дози 5,0х10⁷ та 4,0х10⁸ м. к.) культури вакцинного штаму B. abortus 7-26; в другому досліді (37 морських свинок) – щепили живою вакциною штаму 7-26 кон’юнктивально в дозі 4,0х10⁸ м. к. або підшкірно 25,0х10⁷ м. к. в об’ємі 1,0 см³ та інактивованою емульсин-вакциною з даного штаму в дозах 25,0х10⁷ і 2,0х10⁹ м. к. підшкірно двократно; в третьому досліді (48 морських свинок) – щепили кон’юнктивально в дозах 5,0х10⁷ та 4,0х10⁸ м. к. або підшкірно в дозі 25,0х10⁷ м. к. живою вакциною, а також підшкірно однократно інактивованою емульсин-вакциною з шт. B. abortus 7-26 в дозах 25,0х10⁶, 25,0х10⁷ і 2,0х10⁹ м. к. Морських свинок дослідних і контрольних груп (2 і 3-й дослід) через 2 місяця після щеплення заразили підшкірно культурою B. ovis 65939 в дозі 2,0х10⁹ м. к.

Після аплікації на кон’юнктиву культури вакцинного штаму B. abortus 7-26 в дозах 5,0х10⁷ і 4,0х10⁸ м. к. через 25 діб незалежно від дози вакцини виявили приживлення культури бруцел і розселення її по всьому організму тварин (І. І. – 66,7-76,2 %). Повну елімінацію вакцинної культури з організму спостерігали через 49 діб після щеплення. При серологічному дослідженні сироватки крові морських свинок в РА з комерційним бруцельозним S– антигеном антитіла виявили у титрі 1:10-1:20 у 33,3-66,7 % тварин з повним їх зникненням на 63 добу досліду, в той час як в РА з гомологічним антигеном культури B. abortus 7-26 всі морські свинки реагували в більш високому титрі 1:40-1:320. Після підшкірного щеплення живою вакциною з штаму B. abortus 7-26 бруцельозну та бруцелаовісну серопозитивність виявили у 16,7-33,3 % тварин через 45 діб, в той час як застосування інактивованої емульсин-вакцини викликало більш високий рівень гуморальних антитіл у всіх щеплених морських свинок, як з бруцельозним (РА – 2,70±0,11 lg, РЗК – 2,64±0,11 lg), так і з бруцелаовісним (РТЗК – 2,45±0,11 lg, РІД – 1,83±0,32 lоg₂) антигенами.

У морських свинок, щеплених однократно в дозах 25,0х10⁶, 25,0х10⁷ та 2,0х10⁹ м. к. інактивованою емульсин-вакциною, формувалися невеликі гранульоми (від 0,6х0,9 до 0,9х1,2 см²) в залежності від дози вакцини і залишалися у вигляді ущільнень до кінця досліду (90 діб). Після введення живої вакцини в дозі 25,0х10⁷ м. к. вираженої місцевої реакції не спостерігали.

Через 60 діб після щеплення кон’юнктивальний спосіб аплікації живої вакцини з штаму B. abortus 7-26 в дозі 5,0х10⁷ м. к. створював повний імунітет у 100 % тварин в порівнянні з підшкірним щепленням цієї вакцини в дозі 25,0х10⁷ м. к., котра індукувала імунітет у 83,3-100,0 % тварин. Інактивована емульсин-вакцина з штаму B. abortus 7-26 при підшкірному введенні в дозі 25,0х10⁶ м. к. створювала імунітет у всіх щеплених морських свинок. У морських свинок контрольних груп заражаючий штам реізольований у 83,3-100 % тварин, індекс інфікованності – 21,4-28,6 %.

Порівняльне дослідження гуморальних і клітинних реакцій імунітету поряд з прямим зараженням для оцінки імуногенності інактивованої та живої вакцин із штаму Brucella abortus 7-26 в дослідах на баранах. На 67 баранах інактивовану емульсин-вакцину досліджено в дозах 5,0х10⁶; 5,0х10⁹; 10,0х10⁹; 25,0х10⁹ і 50,0х10⁹ м. к., живу вакцину в дозі 5,0х10⁹ м. к., інактивовані суспензії бруцел в дозах 5,0х10⁹ і 5,0х10⁶ м. к. без ад’юванту. Контрольним тваринам вводили тільки ад’ювант або нічого не вводили. Імуногенну активність різних зразків емульсин-вакцини оцінювали за протективними і антигенними властивостями.

Спостереження показали, що реактогенність інактивованої вакцини знижувалася з зменшенням вмісту бруцел в дозі. Місцева реакція на введення інактивованої емульсин-вакцини в дозі 5,0х10⁹ м. к. у баранів проявилася в вигляді безболісної припухлості розміром 1,5-1,8х2,0-2,5 см². У баранів, щеплених емульсин-вакциною в більших дозах (10,0-50,0х10⁹ м. к.), у 16,7 % тварин спостерігали кульгавість впродовж 12-15 діб і абсцеси асептичного характеру. Впродовж 10 діб після щеплення емульсин-вакцинами в дозах 5,0-50,0х10⁹ м. к. виявлено підвищення температури тіла на 0,4-1,0^ОС на 2 добу (39,3±0,14-39,8±0,37^ОС) і на 5 добу на 1,3-1,5^ОС в порівнянні з показниками в контрольних групах. Найменший підйом температури (на 0,50±0,11^ОС) відмічали у баранів, щеплених емульсин-вакциною в дозі 5,0х10⁹ м. к. В подальшому на 9-10 добу відзначали її зниження. При гематологічному дослідженні крові на 10 добу після щеплення баранів, щеплених емульсин-вакциною в дозах 5,0х10⁹-50,0х10⁹ м. к., виявили незначні зрушення незалежно від дози, а при підрахунку лейкоформули в мазках крові – збільшення паличкоядерних нейтрофілів до 1,52±0,33 % і моноцитів до 0,75±0,18 %, що свідчило про активізацію поліморфноядерних лейкоцитів і системи мононук-леарних фагоцитів. Кількість лейкоцитів крові та показники лейкоцитарної формули у баранів, щеплених інактивованою і живою вакцинами в дозі 5,0х10⁹ м. к., на 168 добу після щеплення наближалися до вихідних даних. На 35-44 добу після контрольного зараження у щеплених інактивованою і живою вакцинами баранів (доза 5,0х10⁹ м. к) зміна в лейкоформулі та загальному вмісту лейкоцитів в крові були незначними. У контрольних інфікованних баранів після зараження культурою B. ovis відмічали зрушення лейкоформули вліво до паличкоядерних нейтрофілів, зниження відносної і абсолютної кількості лімфоцитів та підвищення загальної кількості лейкоцитів крові, що свідчило про розвиток інфекційного процесу. Результати гематологічних показників також свідчать, що найменші зрушення в крові при вакцинному процесі виявили у баранів, щеплених інактивованою та живою вакцинами в дозі 5,0х10⁹ м. к.

Застосування інактивованої емульсин-вакцини з штаму B. abortus 7-26 викликає серопозитивність до бруцельозного та бруцелаовісного антигенів впродовж 7,5 місяців (строк спостереження). Титри антитіл при серологічному дослідженні баранів на 90 добу після щеплення емульсин-вакциною в дозі 5,0х10⁹ м. к., був: в РБП 1:16-1:32 (4,50±0,33 log₂), РА 1:400-1:800 (2,83±0,09 lg), РЗК 1:1280 (3,10±0 lg) з бруцельозним, а також з бруцелаовісним антигенами в РА 1:400-1:800 (2,83±0,09 lg), РТЗК 1:160-1:320 (2,35±0,10 lg), РІД 1:32-1:64 (5,50±0,33 lоg₂). Слід зазначити, що після введення живої вакцини в дозі 5,0х10⁹ м. к. зникненння серопозитивності у тварин виявили на 100 добу.