ІМУНОМОДУЛЮЮЧА АКТИВНІСТЬ ТРАНСФЕР-ФАКТОРА ПРОТИ ВІРУСУ ЧУМИ М’ЯСОЇДНИХ

Краткое содержание

Дослідження проводили в період з 2004 по 2008 роки   на базі кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології Національного університету біоресурсів і природокористування України. Окремі дослідження проведено у  лабораторії  ДДВП "Біоветпрепарат" Інституту ветеринарної медицини УААН, в комплексі з вирощування свиней  ДП АНТК ім. О.К. Антонова (с. Круглик Васильківського району), комунальному підприємстві «Притулок для тварин» (м. Бородянка)  та лабораторії ДПЛРЦ (с. Капітанівка Києво-Святошинського району Київської області). 

   На перших етапах досліджень ми здійснили оптимізацію культивування двох штамів збудника  ЧМ  (шт. 668–КФ і штам ТС–2) з метою отримання  препаративної кількості вірусної сировини. З цією метою випробувані  курячі ембріони та отримана з них культура клітин. 

  Як тварин-донорів трансфер-фактора, специфічного щодо  збудника ЧМ, використали свиней породи велика біла, масою тіла 80–90 кг, віком 7–8 міс. Як тварин-реципієнтів використовували білих нелінійних мишей масою 18–20 г, безпородних собак (самок) масою 17–21 кг віком 1,5–2,5 роки та  кролів породи шиншила    масою 1250–1500 г.  Всього використано 40 голів свиней, 8 собак, 28 кролів та 160 білих мишей. Для визначення терапевтичного ефекту експериментальних зразків ТФ було піддано обробці 144 собаки різних порід і вікових груп. Для культивування вірусу ЧМ, визначення протективних властивостей трансфер-фактора та для приготування первинно-трипсинізованої культури клітин фібробластів курячих ембріонів  (ФКЕ)  було використано 420 КЕ.

Дослідних свиней імунізували антигенами чуми м’ясоїдних двох видів: – перший антиген являв аттенуйований вірус чуми м’ясоїдних, адаптований до курячих ембріонів  – штам ТС–2;  другий антиген – вакцинний штам 668–КФ вірусу чуми м’ясоїдних. В обох  випадках  використовували ад’ювант ISA–25, частка якого становила 25 %. Як алерген для постановки реакції гіперчутливості сповільненого типу використовували штам 668–КФ ВЧС з ад’ювантом ISA–25 (75 % і 25 % відповідно).  Дослідження проведені на п’яти, сформованих за принципом аналогів, групах свиней   (по шість тварин у кожній). Перші дві групи (1 та 2) імунізували антигеном ТС–2, причому 1-шу  групу одноразово, а другу – триразово. Третю та четверту групи  імунізували антигеном  668–КФ, причому 3-тю групу одноразово, а 4-ту – триразово. П’ята група тварин була контрольною. Свиней першої  та третьої груп імунізували одноразовим введенням антигену. Тваринам другої та четвертої груп антиген вводився триразово – на першу, восьму та 15-у добу. П’ятій групі замість антигену вводили стерильний 0,85 %-й розчин NaCl. Препарати вводили внутрішньом’язово в дозі 3,0 cм³ у привушну ділянку в області каудального косого м’яза голови. Забій тварин першої  та третьої груп і відбір матеріалу для виготовлення ТФ проводили на 8 добу після одноразового введення антигену, другої та четвертої – на 8 добу після третьої вакцинації, п’ятої – одночасно з тваринами другої  та четвертої груп. Забивали по 3 тварини з кожної групи. Для визначення наявності та ступеня сенсибілізації до збудника чуми м’ясоїдних  імунізованих свиней як індикатор гіперчутливості сповільненого типу використали алергійну шкірну пробу. Постановку алергійної проби здійснювали у тварин дослідних та контрольної груп через 7 діб після закінчення курсу імунізації. Ґрунтуючись на результатах шкірної проби, в усіх дослідних групах відбирали тварин з найбільш вираженою сенсибілізацією до антигену з метою їх подальшого використання для отримання трансфер-фактора, специфічного щодо збудника чуми м’ясоїдних.

 Для перенесення гіперчутливості сповільненого типу з використанням отрима-них зразків трансфер-фактора реципієнтами слугували нелінійні білі миші. Одна доза ТФ відповідала діалізату 4 х 10⁸ клітин. Сформували 3 групи  по 10 мишей в кожній.     Перенесення ГСТ білим мишам досліджували за такою схемою: мишам першої групи вводили внутрішньочеревно трансфер-фактор антигенспецифічний одноразово вакцинованих донорів  (ТФ–ПЧМ–1), тваринам другої групи – триразово вакцинованих донорів (ТФ–ПЧМ–3),  третьої групи – ДЕЛ лімфоїдних органів неімунізованих проти чуми м’ясоїдних  свиней. Доза препарату становила 1,0 см³. Через сім діб у плесневий м’якуш лівої кінцівки вводили по 0,05 см³ антигену чуми м’ясоїдних у розведенні 1 : 10, а правої – стерильний апірогенний 0,85 %-й  розчин NaCl у такому ж об’ємі. Товщину шкірної складки вимірювали перед введенням алергену,  а далі через добу до повного зникнення набряку та еритеми. За позитивний результат вважали потовщення складки плесневого м’якуша, що вірогідно перевищувало відповідні показники тварин контрольних груп. Результати перенесення стану ГСТ ксеногенним реципієнтам визначали за допомогою реакції інгібіції міграції лейкоцитів, оброблених досліджуваними зразками ТФ, у пластикових чашках Петрі під шаром агарози за методом Г.Фрімель (1987). Для сенсибілізації лейкоцитів селезінок інтактних мишей застосовували зразки трансфер-фактора, отримані із лімфоїдних органів одноразово (ТФ–ПЧМ–1) та триразово (ТФ–ПЧМ–3) вакцинованих свиней.

          Інтенсивність бластоутворення тест-лімфоцитів периферійної крові кролів, сенсибілізованих ТФ та антигеном ЧМ, досліджували за допомогою реакції бластоутворення лімфоцитів у присутності специфічного антигену та фіто-гемаглютиніну за методикою Arala-Chaves M.P. et al. (1987).

           Дослідження впливу  специфічного щодо вірусу чуми м’ясоїдних трансфер-фактора на деякі біохімічні,  гематологічні  та імунобіологічні показники крові  собак  проводили на безпородних собаках віком 1,5—2,5 роки, живою масою тіла 17— 21 кг.  Тваринам дослідної групи (5 собак) на початку досліду та через тиждень потому вводили підшкірно в дозі 2,0 см³  препарату ТФ (ТФ–ПЧМ–1), а тваринам контрольної групи (3 собаки) — за аналогічною схемою і в тій дозі вводили стерильний фізіологічний розчин.  Перед введенням ТФ та потім,  ще тричі з інтервалом 7 діб, від піддослідних тварин відбирали проби крові для дослідження. Гематологічні показники піддослідних тварин визначали за загальновизнаними методиками (Судаков М.О., 1975; Чумаченко В.Е. и др., 1991; Бакулов И.А., 1998;), біохімічні (вміст загального білка, альбумінів, глобулінів, сечовини, білірубіна, Са++ та Р) — за методиками (Судаков М.О., 1975; Чумаченко В.Е. и др., 1991); а на вміст креатиніну, амілази, ГГТ, лужної фосфатази, АлАТ та АсАТ — за методиками  (Меньшиков В.В., 1988; Горячковский А.М., 1994) з використанням наборів реактивів, виготовлених ТОВ НВП «Філісіт-Діагностика» м. Дніпропетровськ, Україна та Pliva-Lachema a.s. м. Брно, Чехія. Кількість лейкоцитів підраховували в камері Горяєва. Лейкограму виводили методом Філіппченко (Чумаченко В.Е. и др., 1991). Визначення популяційного та субпопуляційного складу імунокомпетентних клітин собак здійснювали за методиками (Tachibana T. A. et al., 1973;  Новиков Д. К. и др., 1976;  Пастер Е.У. и др., 1989;  Чумаченко В.Е. и др., 1991; Бакулов И.А., 1998; Івченко В. М. та ін., 2003).

Активність отриманих зразків фактора перенесення активного імунітету, специфічного щодо вірусу чуми м’ясоїдних,  визначали на курячих ембріонах.

            Клінічні випробовування дослідних зразків ТФ проводили в клініках             м. Києва та Чернігова  на хворих собаках  обох статей, різного віку  і різних порід,  які поступали у відповідні лікувальні установи.  Всього лікуванню   хворих собак на ЧМ, парвовірусну інфекцію собак (ПВІС), інфекційний гепатит, аденовіроз та лептоспіроз  як із застосуванням ТФ, так і без нього було задіяно 144 тварини.       

            Отриманий цифровий матеріал був оброблений за загальноприйнятими методами варіаційної статистики. Визначались середня величина (М), похибка середньої величини (m), критерій вірогідності (t), рівень значущості (р). Вірогідність одержаних результатів оцінювали загальноприйнятим методом за допомогою критерію Ст’юдента. Статистичну обробку експериментальних даних проводили з використанням програми MS Excel: – середню арифметичну визначали за допомогою функції СРЗНАЧ; – стандартне відхилення (σ) – за функцією СТАНДОТКЛОН; помилку середньої арифметичної визначали за формулою:                                                                                                                                                           m = σ / √ n ; –  вірогідність різниці між групами отриманих даних визначали за допомогою функції ТТЕСТ. Вірогідність вважалась встановленою, якщо позитивний ефект становив не менше 95 % (р < 0,05).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Оптимізація культивування вірусу чуми  м’ясоїдних з метою отримання його препаративної маси  для імунізації тварин-донорів ТФ. На перших етапах досліджень ми здійснили оптимізацію культивування двох штамів збудника ЧМ (штами 668–КФ і ТС–2) з метою отримання  препаративної кількості вірусної сировини.  З цією метою були випробувані курячі ембріони та отримана з них культура клітин.   Було проведено  сім пасажів  штаму ТС–2  та чотири пасажі штаму 668–КФ.  Їх здійснювали, використовуючи різні методи зараження КЕ (в алантоїсну порожнину, на хоріоналантоїсну оболонку та одночасно вводили матеріал на ХАО і в алантоїсну порожнину). Залежно від методу зараження вік КЕ коливався  від 8 до 10 днів. Для кожного пасажу вірусу використовували не менше 6 КЕ. Ідентифікацію адаптованого до КЕ вірусу штаму ТС–2 здійснювали за допомогою діагностичного набору для виявлення антигену чуми м’ясоїдних імуноферментним аналізом, виготовленим НВО “Нарвак” (Росія, ТУ 9388-016-044525703-2000).

Штам 668–КФ вірусу ЧМ не проявляв гемаглютинаційної активності. Не встановлено суттєвої різниці в методах зараження КЕ вірусом. Інфекційний титр штаму  ТС–2  вірусу на рівні сьомого пасажу становив 10^5,24ЕЛД_50/см3.  Загибель КЕ відмічали, як правило, на 5–8 добу після їх зараження. Проведені дослідження  дозволили дійти висновків : – при розмноженні вірус в КЕ  спричиняє загибель їх, а   також   патолого-анатомічні   зміни  зародка  і  хоріоналантоїсної оболонки (ХАО);   –   вірус  чуми  м’ясоїдних   розмножується  в  КЕ  за  різних  способів інокуляції,  але видимі патолого-анатомічні зміни найбільш яскраво проявляються при зараженні КЕ на ХАО або в жовтковий міхур.

Для оптимізації процесу приготування фібробластів курячого ембріона,  ми дещо скорегувати загальновизнані методики приготування так, щоб не знижуючи якості культури, виграти в часі та спростити сам процес приготування. В дослідах випробовували різні концентрації трипсину, визначали оптимальну експозицію дії його на тканини ембріона та визначали при якому температурному режимі процес трипсинізації є найбільш ніжним відносно  до клітин, а вихід   життєздатних клітин був би максимальним. Проведені дослідження показали, що найбільш вдалою концентрацією 0,25 %-го трипсину є його розведення  живильним середовищем 1:10. При такому розведенні трипсину та при температурі навколишнього середовища в межах 25±2 ⁰С за 50–60 хв відбувається максимальний вихід життєздатних клітин. Після цього дію трипсину призупиняли внесенням у суспензію клітин 10 % сироватки крові великої рогатої худоби. Найбільшу кількість живих фібробластів вдається отримати при  температурі 25±2 ⁰С  за умови вмісту трипсину в розчині у концентрації – 0,025 % (50–60 хв трипсинізації). Проведені дослідження показали, що оптимальною посівною концентрацією клітин є 450000±              120000 клітин/см³.  Клітинний моношар фібробластів курячих ембріонів формується через 20–36 год  інкубації  при температурі  37 ⁰С. Таким чином, завдяки вилученню із процесу трипсинізації таких загальноприйнятих маніпуляцій як центрифугування та  фільтрування, нам  вдалося суттєво скоротити витрати часу без помітної втрати життєздатних клітин. Отримані нами фібробласти КЕ виявилися чутливими до вірусу чуми м’ясоїдних так само, як і при приготуванні  цієї КК традиційним методом. 

          Культивування  вірусу чуми м’ясоїдних у клітинній культурі фібробластів курячих ембріонів  виконували  за методикою (Сюрин В.Н. и др., 1986). Реплікація штамів ТС–2 і 668–КФ вірусу ЧМ у культурі клітин ФКЕ супроводжувалась чітким цитопатичним ефектом (ЦПЕ), який спостерігали у цій культурі  у  першому пасажі.  Зумовлений  віру­сом ЦПЕ характеризувався  округленням клітин. Клітини ставали рефрактильними та  відшаро­вувались від скла. Протягом 72–96 год після зараження моношар клітин повністю руйнувався. Перші ознаки цитопатичної дії (округлення частини клітин) проявлялися через 30–36 год після зараження, а 50 %-на  цитопатична дія вірусу у зараженій культурі клітин відмічалася вже через 48–60 год. Максимальна цитопатична дія (ЦПД) вірусу на клітинний моношар  відмічалася через 80–96 год. Культуральна рідина заражених штамом ТС–2  вірусу ЧМ культур клітин містила гемаглютинін до еритроцитів півня, але титри його не перевищували значення 1:16. Специфічна сироватка проти ЧМ затримувала  гемаглютинацію.

           З метою визначення оптимального терміну інкубування заражених вірусом культури клітин фібробластів курячих ембріонів ми припиняли інкубування її зразків через 24, 48, 60, 72, 84, 96 та 120 год,  тричі заморожували і відтаювали та визначали біологічний титр вірусу. Результати проведених досліджень свідчать, що вірус ЧМ у найбільш високих титрах виявляється в період  72–84 год інфекції.  Надалі титр вірусу поступово знижується. Дані цих досліджень наведено в табл. 1. Збільшення строку інкубації призводить до  інактивації вірусу під дією температури.

           У результаті цієї серії досліджень була  розроблена раціональна  методика отримання первинно-трипсинізованої клітинної культури фібробластів курячого ембріона та методика культивування в ній лабораторних штамів вірусу чуми м’ясоїдних   (шт. 668–КФ та шт. ТС–2),  що забезпечило найбільшу репродукцію  останніх та дозволило отримати вірусний матеріал  у кількості, необхідній  для проведення подальших досліджень в плані реалізації дисертаційних наукових завдань.