МУЗИКА ДЕНИС ВАСИЛЬОВИЧ ОРТОМІКСОВІРУСНІ ТА ПАРАМІКСОВІРУСНІ ІНФЕКЦІЇ ДИКОЇ ТА СІЛЬСЬКОГОСПОДАРСЬКОЇ ПТИЦІ В УКРАЇНІ (ЕПІЗООТОЛОГІЯ, ЗАСОБИ ДІАГНОСТИКИ ТА СПЕЦИФІЧНОЇ ПРОФІЛАКТИКИ)

Краткое содержание

Дисертаційна робота виконувалась протягом 2006–2014 рр. у відділі вивчення хвороб птиці ННЦ «ІЕКВМ», Біосферному заповіднику «Асканія-Нова», Чорноморському біосферному заповіднику, Дунайському біосферному заповіднику, Азово-Чорноморській орнітологічній станції, Південно-Східній дослідницькій лабораторії з хвороб птиці (США), на базі Кримської, Одеської, Дніпропетровської дослідних станцій ННЦ «ІЕКВМ».
Відбір біологічного матеріалу від диких і свійських птахів. Збір проб біологічного матеріалу (клоакальні, трахеальні, назофарингіальні змиви, проби фекалій, патологічний матеріал, сироватки крові, яйця) від диких птахів різних екологічних груп і голубів проводили у 2006–2012 рр. у водно-болотних угіддях Херсонської, Запорізької, Миколаївської, Одеської, Харківської, Сумської, Донецької, Дніпропетровської областей та АР Крим. Для вірусологічних досліджень зібрано матеріал від 6 281 особини диких птахів 98 видів 29 родин, для серологічних досліджень — від 946 особин диких птахів 44 видів, які належать до 11 рядів: Пірникозоподібні, Пеліканоподібні, Лелекоподібні, Гусеподібні, Куроподібні, Журавлеподібні, Сивкоподібні, Сиворакшеподібні, Голубоподібні, Дятлоподібні, Горобцеподібні. Відбір проб біологічного матеріалу (проби крові, яйця, клоакальні змиви, патологічний матеріал) від свійських птахів (кури, гуси, качки) з присадибних і промислових господарств проводився у Харківській, Одеській, Миколаївській, Херсонській, Черкаській, Дніпропетровській, Полтавській, Луганській, Донецькій областях та АР Крим.
Імунологічні дослідження. Відбір, підготовку крові проводили за загальноприйнятими методиками (OIE, 2008). Частина проб крові диких птахів збиралася на фільтрувальному папері (Spackman E. 2008). Яйця диких птахів збирали в місцях гніздування, яйця сільськогосподарської птиці відбирали відразу після знесення. Підготовку жовтків яєць птахів проводили за методикою (Стегній Б. Т., Музика Д. В., 2004). Сироватки крові та жовтки яєць диких і свійських птахів досліджували щодо наявності антитіл (АТ) до збудника грипу А підтипів Н1–Н14, НХ, а також ПМВ 2–ПМВ 9 за допомогою реакції затримки гемаглютинації (РЗГА). Постановку та інтерпретацію результатів РЗГА здійснювали за рекомендаціями МЕБ (Spackman E., 2008; Alexander D., 2009; OIE, 2008). Для серологічних досліджень використовували ІФА тест-системи: ID Screen® Influenza A Antibody Competition (ID VET, Франція), FlockChek® (MultiS-Screen) Avian influenza virus antibody test kit ELISA (IDEXX, США).
Вірусологічні дослідження. Відбір патологічного матеріалу, клоакальних і трахеальних змивів, проб фекалій, підготовку та їх дослідження проводили згідно методик МЕБ (Spackman E., 2008; OIE, 2008; Alexander D., 2009). Для ізолювання вірусу використовували ВПФ курячі ембріони (КЕ) (Valo, Німеччина) та комерційні. Реакцію гемаглютинації (РГА), РЗГА, реакцію пригнічення нейрамінідазної активності (РПНА) проводили за загальноприйнятими методиками (Сюрин В. М., 1991; Spackman E. 2008; Alexander D., 2009; OIE, 2008). У дослідженнях були використані референтні сироватки крові до орто- та параміксовірусів виробництва Veterinary Laboratories Agency (м. Вейбрідж, Англія), Instituto Zooprofilattio Sperimentale delle Venezie (м. Падуя, Італія). Визначення патогенності ізолятів вірусу грипу (ВГ) проводили за інтравенозним індексом патогенності (ІВІП), ізолятів параміксовірусів — за інтрацеребральним індексом патогенності (ІЦІП), а також за результатами секвенування згідно з рекомендаціями МЕБ (Spackman E., 2008; Alexander D. J., 2009; OIE, 2008).
Для експериментального інфікування використовували 5 ізолятів вірусу грипу підтипів Н5N2, H7N3, Н4N6, Н13N8, H6N2, а також 3 ізоляти ПМВ, що виділені від диких водоплавних і навколоводних птахів в Україні. Інфікування курчат кросу «Хай-Лайн» 30–50 добового віку та курей 100–217 добового віку проводили інтраназально та внутрішньом’язово в дозах 103,83–106,3 ЕІД50. Строк спостереження за інфікованою птицею — 10–14 діб.
Вивчення рецепторної специфічності ізолятів вірусу грипу та НХ проводили за допомогою РГА з використанням 1 % ї суспензії еритроцитів 5 видів свійських птахів, 13 видів диких птахів, а також 4 видів ссавців. Вивчення термочутливості гемаглютиніну вірусів грипу та НХ проводили протягом 360 хв на термошейкері Eppendorf Termomixer Comfort за температури 56 і 60 °С. Біологічну активність вірусів визначали титруванням на КЕ, виражали в ЕІД50, ЕЛД50, за Рідом та Менчем (Dufour-Zavala L., 2008). Інактивацію вірусів здійснювали формальдегідом у кінцевих концентраціях 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 % або β пропіолактоном — 0,05, 0,025, 0,0125 % за температури 37 і 4 °С (Сюрин В. М., 1991; Spackman E., 2008; Alexander D. J., 2009; OIE, 2008). Перед ліофілізацією до інактивованих антигенів вірусів додавали захисні середовища (знежирене молоко; гідролізатлактальбумін; суміш пептону (4 %), сахарози (10 %), желатину (1 %)).
Орто- та параміксовіруси, використані під час досліджень. У роботі використовували виробничі штами вірусу грипу підтипів Н1N1, Н2N2, Н3N8, Н4N6, Н5N3, Н6N2, Н7N7, Н8N4, Н9N2, Н10N7, Н11N6, Н12N5, Н13N6, Н14N2, H5N1, Н5N2, Н7N1, H7N3, Н15N7, Н16N3; контрольний штам вірусу ВПГП «Сиваш» H5N1 (5 й пасаж); штами вірусу НХ НХ/крижень/Асканія-Нова/ТМ434774/2002, «ЛГ 85», а також 98 польових ізолятів вірусів грипу та ПМВ.
Гістологічні та імуногістохімічні дослідження. Зразки органів фіксували у 10 % му розчині нейтрального формаліну, після чого заливали у парафінові блоки за методом Г. А. Меркулова (Горальский Л. П., 2005). Зрізи фарбували гематоксиліном та еозином. Гістоморфометричну оцінку виготовлених препаратів проводили за Г. А. Красніковим (1989). Для визначення рівня субпопуляцій Т лімфоцитів, В лімфоцитів, макрофагів і М клітин зразки внутрішніх органів курчат (кишечника, легень, трахеї, селезінки) на 1 шу, 3 тю, 5 ту, 7 му та 10 ту доби після інтраназального інфікування вірусом НПГП досліджували за допомогою імуногістохімічного методу міченого стрептавідин-біотину (Be
dt A. et al., 2000). Для детекції субпопуляції клітин використовували немічені первинні моноклональні АТ проти антигенів CD4, CD8, клітин продуцентів IgM, IgG, IgA, макрофагів (Southe
Biotechnology Associates, Germany), а також набір компонентів для фарбування (ChemMate Detection kit, DakoCytomation, Denmark). Візуалізацію й аналіз зрізів, облік клітинних субпопуляцій в органах здійснювали за допомогою системи візуалізації та комп’ютерної програми «ВидеоТест-Морфология 5.1» (РФ) за інструментального збільшення × 200. Статистичний аналіз проведено за допомогою програми SPSS 17.0.
Експериментальні серії вакцин і вакцинація сільськогосподарської птиці. Моновалентні вакцини. У роботі були використані інактивовані антигени вірусу ВПГП А/курка/Сиваш/02/05 Н5N1 серій №8а, №8б, серія А (15.01.07), серія Б (22.01.07); серія В (09.10.06); серія 1 (15.01.2007 р.), серія 9 (28.08.2006 р.); інактивована вакцина проти ВПГП «АвіФлуВак-ІЕКВМ», а також інактивований антиген вірусу грипу А/крячок/Південна Африка/61 Н5N3. Для визначення строків появи перших АТ до вірусу ВПГП у дорослих курей було проведено одноразове щеплення у дозі 0,5 см3. Проби крові відбирали на 3 тю, 5 ту, 7 му, 10 ту, 14 ту, 21 шу, 28 му, 60 ту, 90 ту, 120 ту та 150 ту доби після щеплення. Для вивчення трансоваріального імунітету у курей проведено дворазове щеплення у дозах: 0,5, 1,0, 1,5, 2,5 см3. Рівень АТ і динаміку їх накопичення визначали у сироватці крові та жовтку яєць кожні 30 діб. Для визначення терміну придатності використано вакцину «АвіФлуВак-ІЕКВМ» зі строком зберігання 6, 12 і 18 міс. Для вивчення антигенних властивостей вакцини з різним рівнем гемаглютинінів в антигені (1:64, 1:128, 1:256, 1:512) виготовлено 4 експериментальні серії біопрепарату «АвіФлуВак-ІЕКВМ». Бівалентні вакцини. Використовували 3 експериментальні серії «Бівалентної інактивованої вакцини проти ВПГП підтипів Н5 та Н7» (А/курка/ Сиваш/02/05 H5N1, А/курка/Росія/87 Н7N1). Співвідношення інактивованих антигенів 1:1, 1:2, 2:1. Тривалентні вакцини. Використано 4 експериментальні серії «Тривалентної інактивованої вакцини проти ВПГП підтипів Н5, Н7 та НХ» (А/курка/Сиваш/02/05 H5 N1, А/курка/Росія/87 Н7N1, «ЛГ 85»). Співвідношення інактивованих антигенів 1:1:1, 2:1:1, 1:2:1, 1:1:2.
Для виготовлення всіх вакцин використовували масляний ад’ювант «Монтанід ISA 70» (Seppic, Франція). Співвідношення антигену й ад’юванту становило 30:70. В усіх дослідах щеплення курей проводили внутрішньом’язово в дозі 0,5 см3, качок — 1,0 см3, індиків — 1,0 см3, гусей — 2,0 см3 одноразово або дворазово з інтервалом 3 тижні. Рівень АТ у сироватці крові до вірусу грипу підтипу Н5, Н7 і вірусу НХ визначали через 21 добу після одноразового введення та через 30, 90 та 120 діб після дворазового щеплення за допомогою РЗГА згідно з методикою МЕБ (Spackman E., 2008; Alexander D. J., 2009; OIE, 2008). Титр антитіл 1:32 (5 log2) та більше до вірусу грипу підтипів Н5, Н7, а також 1:16 (4 log2) і більше до вірусу НХ вважали захисним.
У роботі використовували курчат 45 добового віку та курей
200–220 добового віку кросів «Домінант», «Хай-Лайн» 180 добового віку, «Хай-Лайн білий» 37 добового віку, порід адлерська срібляста 60 добового віку, бірківська барвиста 45 добового віку; індиків породи біла широкогруда кросу «Харківський» (140–195 діб); качок порід українська біла (150 діб), пекінська біла (60–165 діб); гусей породи велика сіра (145 діб).
Молекулярно-біологічні дослідження. Екстракцію нуклеїнових кислот здійснювали за допомогою комерційних наборів «Рибо-сорб 50» (ФДУН «ЦНДІЕ», РФ), «Биоком» (РФ). Напрацювання кДНК проводили за допомогою комерційного набору «Реверта L» (ФДУН «ЦНДІЕ», РФ), або «RT Core» (ТОВ «Ізоген», РФ), або AMV Reverse Transcriptase (Promega, США). Для проведення ПЛР з ізолятами ПМВ 1 го серотипу використовували праймери, які фланкують ділянку гена F довжиною 679 нуклеотидних залишків (н. з.). Для проведення ПЛР з ізолятами ПМВ 4 було використано праймери APMV4–4157F, APMV4–5253R, APMV4–5009F та APMV4–6257R. У роботі використовували «Тест-систему для виявлення РНК ВПГП субтипу Н5 методом ПЛР» (ННЦ «ІЕКВМ», Україна), праймери AivA, AivN1 (Герілович А. П., 2006), тест-систему «Грипп А, Н5» (ФДУН «ЦНДІЕ», РФ). Електрофоретичний аналіз здійснювали з використанням 0,8 % го та 1,5 % го агарозних гелів, напруги 7–20 В/см, сили струму 25–100 мА впродовж 20–120 хв в електрофоретичній камері фірми «BioRad» (США).
Секвенування та філогенетичний аналіз. Отримані продукти ЗТ ПЛР очищували за допомогою наборів реактивів «WizardTM PCR Preps DNA Purification Kit» («Promega», США) та «QIA-Quick Gel Extraction Kit» («Qiagen», США). Хімічний сиквенс проводили з використанням комерційних наборів «AbіPrіsm Terminator Kit» (Applied Biosystems). Електрофоретичний аналіз продуктів реакції було здійснено на ДНК-аналізаторі ABІ 3000 (AbіPrіsm) на базі Південно-Східної дослідної лабораторії з вивчення хвороб птиці (м. Атенс, США). Отримані послідовності вивчали за допомогою пакету програм DNAStar, LaserGene. Аналіз нуклеотидних і відповідних до них амінокислотних послідовностей проводили за допомогою пакету програм MEGA v. 5.0. Для порівняння використовували нуклеотидні послідовності вірусів, які опубліковані у базі даних GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank).