РОЛЬ МЕТАЛОПРОТЕЇНАЗИ ADAM8 У ПАТОГЕНЕЗІ РАКУ ПІДШЛУНКОВОЇ ЗАЛОЗИ : РОЛЬ металлопротеиназ ADAM8 В ПАТОГЕНЕЗЕ рака поджелудочной железы

Краткое описание

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ,
ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ім. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО

На правах рукопису

ВАЛЬКОВСЬКА НАТАЛІЯ ВІКТОРІВНА

УДК: 616-006.04:616.37:577.112.85

РОЛЬ МЕТАЛОПРОТЕЇНАЗИ ADAM8 У ПАТОГЕНЕЗІ РАКУ ПІДШЛУНКОВОЇ ЗАЛОЗИ

14.01.07 онкологія

Дисертація на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук

Наукові керівники-
доктор медичних наук, професор
Осинський Сергій Петрович;
доктор медицини, приват-доцент
Йорг Кліфф

Київ 2008

ЗМІСТ
СПИСОК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ.....................................................................6-7
ВСТУП......................................................................................................................8-15
РОЗДІЛ 1. РАК ПІДШЛУНКОВОЇ ЗАЛОЗИ ТА
МЕТАЛОПРОТЕЇНАЗИ РОДИН ММП ТА ADAM
(ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ)...................................................................................16-42
1.1. Клінічна характеристика раку підшлункової
залози................................................................................................16-19
1.2. Біологічні особливості РПЗ............................................................19-22
1.3. Білки родини ММП........................................................................22-24
1.4. Білки родини ADAM......................................................................24-42
1.4.1. Експресія та функціонування білків родини ADAM
при пухлинному процесі.........................................................................29-34

1.4.2. Шляхи функціонування білків родини ADAM.........................................................................................................34-36

1.4.3. АDАМ8 - один з білків родини АDАМ.........................................................................................................37-42

РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ..............................43-54

2.1. Клітинні лінії та колекціювання тканини......................................43-45

2.2. Кількісна полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)
у реальному часі..............................................................................................45

2.3. Вестерн-блот аналіз.....................................................................45-46

2.4. Імуногістохімічний аналіз..........................................................46-47
2.5. Моделювання гіпоксичного стану у клітинних
лініях РПЗ.........................................................................................................48
2.6. Тварини.............................................................................................48
2.7. Перещеплення пухлини.............................................................48-49
2.8. Визначення сумарної активності ММП
(ММП2таММП 9)............................................................................................49

2.9. Трансфекція siRNA ADAM8 у клітини лінії
Aspc-1............................................................................................................49-50

2.10. Оцінка рівня клітинної проліферації (МТТ тест)......................50-51

2.11. Визначення інвазивних властивостей клітин in vitro................51-52

2.12. Твердофазний імуноферментний
аналіз (ELISA)..................................................................................................52

2.13. SURFACE-ENHANCED LASER DESORPTION/IONIZATION
TIME-OF-FLIGHT MASS SPECTROMETRY
(SELDI-TOF-MS) аналіз..................................................................................53

2.14. Статистичні методи.....................................................................53-54

РОЗДІЛ 3. ДОСЛІДЖЕННЯ ЕКСПРЕСІЇ ADAM8 У КУЛЬТУРАХ
КЛІТИН РПЗ.......................................................................................................55-71

3.1. Визначення експресії ADAM8 на рівні мРНК у клітинних
лініях РПЗ за умов гіпоксії та за нормальних умов
культивування............................................................................................55-58

3.2. Визначення експресії білка ADAM8 у клітинних
лініях РПЗ за умов гіпоксії та за нормальних
умов культивування ..................................................................................58-62

3.3. Визначення взаємозв`язку сумарної активності
матриксних металопротеїназ (ММП-2 та ММП-9) з
прогресією карциноми легені Л`ьюіс (3LL) in vivo................................62-67

3.3.1. Визначення загальної активності желатиназ
(ММП-2 та ММП-9) у пухлинній тканині 3LL, показників
росту пухлини та інтенсивності метастазування у легені............63-65

3.3.2. Визначення кореляції між активністю желатиназ
(ММП-2 та ММП-9) у первинній пухлині 3LL та
Метастазуванням..............................................................................66-67

3.4. Визначення експресії мембранних та розчинних
форм білка АDАМ8 у клітинних лініях РПЗ............................................67-68

РЕЗЮМЕ......................................................................................................68-69

РОЗДІЛ 4. ФУНКЦІОНАЛЬНИЙ АНАЛІЗ БІЛКА
ADAM8 ПРИ РОЗВИТКУ РПЗ.........................................................................72-83

4.1. Трансфекція siRNA АDАМ8 у клітини РПЗ
лінії Aspc-1...................................................................................................72-76

4.2. Визначення впливу білка АDАМ8 на
проліферативну та інвазивну активність клітин РПЗ...............................76-77

4.3. Виявлення змін у профілях білків супернатантів
клітин РПЗ лінії Aspc-1 після проведення трансфекції
siRNA ADAM8...............................................................................................78-81

РЕЗЮМЕ...........................................................................................................82

РОЗДІЛ 5. ДОСЛІДЖЕННЯ ЕКСПРЕСІЇ ADAM8 У
ТКАНИНАХ ПЗ ТА ОЦІНКА ЙОГО ПРОГНОСТИЧНОГО
ЗНАЧЕННЯ........................................................................................................84-95

5.1. Визначення рівня експресії мРНК ADAM8 у
тканинах ПАПЗ, ПЗ хворих на ХП
та ПЗ донорів................................................................................................84-87

5.2. Визначення рівня синтезу білка ADAM8 у
тканинах ПАПЗ та ПЗ хворих на ХП по відношенню
до нормальної тканини ПЗ донорів...........................................................87-89

5.3. Визначення залежності між рівнем експресії
мРНК ADAM8 та тривалістю життя
хворих на ПАПЗ.........................................................................................89-91

5.4. Визначення рівня білка АDАМ8 у сироватці крові
хворих на ПАПЗ, ХП та у сироватці крові донорів................................91-93

РЕЗЮМЕ....................................................................................................93-94

РОЗДІЛ 6. ВИЗНАЧЕННЯ ЛОКАЛІЗАЦІЇ БІЛКА ADAM8
У ПУХЛИННІЙ ТКАНИНІ ХВОРИХ НА ПАПЗ, ТКАНИНІ
ПЗ ХВОРИХ НА ХП, НОРМАЛЬНОЇ ТКАНИНІ
ПЗ ДОНОРІВ І ЛІМФАТИЧНИХ ВУЗЛАХ ХВОРИХ
НА ПАПЗ ТА ОЦІНКА ЙОГО ПРОГНОСТИЧНОГО
ЗНАЧЕННЯ......................................................................................................96-105

6.1. Імуногістохімічне визначення локалізації
білка ADAM8 та інтенсивності імуногістохімічної
реакції з АТ проти ADAM8 у тканинах ПАПЗ,
ПЗ хворих на ХП, ПЗ донорів
та лімфатичних вузлах.........................................................................96-102

6.2. Визначення зв`язку показника тривалості
життя хворих на ПАПЗ з інтенсивністю імуногістохімічної
реакції при виявленні білка ADAM8 у пухлинних
клітинах тканини ПЗ хворих на ПАПЗ............................................102-103

РЕЗЮМЕ...................................................................................................104

РОЗДІЛ 7. АНАЛІЗ ТА УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
ДОСЛІДЖЕННЯ...............................................................................................106-117

ВИСНОВКИ......................................................................................................118-119

СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ............................................................................................................120-135

СПИСОК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ

РПЗ - рак підшлункової залози
ХП - хронічний панкреатит
ПАПЗ - протокова аденокарцинома підшлункової залози
PanIN - інтраепітеліальна неоплазма підшлункової залози
MMП - матриксні металопротеїнази
ПМ - позаклітинний матрикс
ADAM - А Disintegrin And Metalloprotease domain
ADAMTS - ADAM з мотивом тромбоспондину
РКС протеїн киназа С
МАРК мітоген-активована протеїн киназа
Pro - пропептид
MP - металопротеїназний домен
DI- дезінтегриновий домен
CRD - цистеін-збагачений домен
ELD - EGF-подібний домен
ТМ - трансмембранний домен
CTD - цитоплазматичний домен
TNF-α receptor-I - рецептор I фактору некрозу пухлин
TNF-α receptor-II - рецептор II фактору некрозу пухлин
APP - білок попередник β-амілоїду
IL-1-RII рецептор II інтерлейкіну 1
MBP - лужний білок мієліну
TGF-α - трансформуючий фактор росту α
TNF- α - фактор некрозу пухлини α
TNFRI - рецептор I фактору некрозу пухлини
TACE - TNF-α перетворюючий ензим
HB-EGF - гепарин -зв`язуючий епідермальмальний фактор росту
IGFBP-3 - протеін-3 зв`язуючий інсулін-подібний фактор росту
TIMPs тканинні інгібітори матриксних металопротеїназ
РМЗ - рак молочної залози
АТ - антитіла
РГЗ рак грудної залози
ЦНС - центральна нервова система
CK19 - цитокератин 19
3LL - карцинома легені Л`ьюїс
ELISA- тведофазний імуноферментний аналіз
МТТ - 3-(4,5-метилтіазол-2-)-2,-5-діфеніл-тетразоліумбромід
м.м. - молекулярна маса
βNTP - нуклеозид трифосфат
Pi - неорганічний фосфор

ВСТУП
Актуальність проблеми. Рак підшлункової залози (РПЗ) є однією з найбільш агресивних пухлин. Не дивлячись на досягнення останніх 50 років, комплексний підхід до лікування, який включає хірургію, променеву і хіміотерапію та їх комбінації, не збільшує суттєво тривалість життя хворих (Saif M. W. et al., 2007; Kleeff J. et al., 2008; Ghaneh P. et al., 2008). РПЗ посідає 4-те місце серед причин смертності від злоякісних новоутворень у США та в країнах Європи з медіаною тривалості життя хворих близько 6 місяців та 5-річною виживаністю у межах 3-5% (Jemal A. et al., 2007). В Україні РПЗ, як причина смертності від злоякісних пухлин, займає 7-е місце серед чоловіків та 9-е серед жінок (Федоренко З. П. та ін., 2007; Шалимов С. А. та ін., 2007). Відомо, що 85% усіх пухлин підшлункової залози складають аденокарциноми. Протокова аденокарцинома підшлункової залози (ПАПЗ) є найбільш поширеною пухлиною цього органу (Warshaw A. L. et al., 1992; Kloppel G., 2003; Hezel A. F. et al., 2006). Несприятливий прогноз при ПАПЗ пов`язаний з її здатністю до швидкого метастазування у лімфатичні вузли та віддалені органи, що дуже часто має місце вже на час встановлення діагнозу. Така агресивна поведінка та резистентність до різноманітних видів лікування є характерною ознакою даної патології (Kleeff J. et al., 2007).
Існують експериментальні та клінічні докази того, що гіпоксія солідних пухлин, тобто низький рівень оксигенації, впливає на їх ріст, посилює злоякісну прогресію, зокрема метастатичний потенціал, а також зменшує чутливість до хіміотерапевтичних препаратів та іонізуючого опромінення (Shannon A. M. et al., 2003; Zhou J. et al., 2006; Vaupel P. et al., 2007). Гіпоксія розглядається сьогодні як ключовий фактор патогенезу злоякісних новоутворень (Chaudary N. et al., 2007). Koong і співавт. (Koong A. C. et al., 2000) навели прямі докази наявності значного рівня гіпоксії у тканині РПЗ людини. Встановлено також, що гіпоксія у РПЗ асоціюється з агресивністю цього новоутворення, стимулюючи метастазування та формування резистентності до цитостатичних засобів (Büchler P. et al., 2004; Yokoi K. et al., 2004).
Останнім часом встановлено, що до інвазії та метастазування злоякісних пухлин причетні білки родини АDАМ (A Desintegrin And Metalloprotease domen). Це велика родина трансмембранних протеїнів I типу, які містять металопротеїназу та дезінтегриновий домен (Wolfsberg T. G. et al., 1995; Yamamoto S. et al., 1999). У людини було ідентифіковано більш ніж 20 генів родини АDАМ, які виявляються у різноманітних тканинах організму та відіграють важливу роль у злитті сперматозоїда та яйцеклітини, а також у сперматогенезі, міогенезі, нейрогенезі (Wolfsberg T. G. et al., 1995; Yamamoto S. et al., 1999; Kataoka M. et al., 1997). Вкрай важливим є те, що білки родини АDАМ беруть участь як у протеолізі, так і у клітинній адгезії. Це дозволяє припустити їх участь у реконструюванні позаклітинного матриксу (ПМ) та зміні адгезивних властивостей клітини, що є характерним при малігнізації. Було також встановлено, що білки родини АDАМ впливають на клітинну міграцію та контролюють різноманітні сигнальні шляхи, зокрема протеїн киназа С (РКС) та мітоген-активована протеїн киназа (МАРК) сигнальні каскади. Взаємодія дезінтегринового та цистеїн-збагаченого доменів білків ADAMs з інтегринами або синдеканами на клітинах допомогають їм розщеплювати субстрати ПМ. Білки АDАМs модулюють взаємодії інтегринів з ПМ та, таким чином, опосередковано можуть бути промоторами проліферативних сигналів під дією інтегринів (Mochizuki S. et al., 2007).
Серед білків родини ADAM особливу увагу привертає АDАМ8 (MS2, CD156), який був клонований з макрофагів мишей, та який експресується у гранулоцитах, В-клітинах, а також у нейронах і олігодендроцитах (Yamamoto S. et al., 1999). Активність АDАМ8 не пригнічується тканинними інгібіторами металопротеїназ (TIMPs), на відміну від інших білків, які мають протеолітичну активність (Amour A. et al., 2002). Ген АDАМ8 кодує білок, який містить 824 амінокислоти та складається з трансмембранного домену та декількох зовнішньоклітинних доменів, які мають здатність впливати на адгезивні властивості клітин та протеоліз (Wolfsberg T. G. et al., 1995; Yoshizama K. et al., 1997). Було показано, що АDАМ8 здатен функціонувати у двох формах: одна з них утворюється шляхом аутокаталітичного видалення продомену (процесована форма), а інша є залишковим протеїном, який складається з зовнішньоклітинної частини з дезінтегриновим доменом та з трансмембранного і цитоплазматичного доменів (Schlomann U. et al., 2002).
Основною властивістю білків родини АDАМ, та зокрема білка АDАМ8, є здатність до протеолізу мембранних протеїнів: процесу, що називається ectodomain shedding” (злущення” ектодоменів) (Kheradmand F. et al., 2002; Huovila A. P. et al., 2005; Naus S. et al., 2006). Цей процес є вкрай необхідним для запуску механізмів ангіогенезу та метастазування, тому визначення механізмів дії цього білка є дуже важливим для розуміння молекулярних шляхів при розвитку ПАПЗ.
Відомо, що in vitro ADAM8 діє як активна металопротеїназа, яка гідролізує лужний білок мієліну (МВР), білок-попередник β-амілоїду, CD23, інтерлейкіни та фактор некрозу пухлини α (Schlomann U. et al., 2000; Fourie A. M. et al., 2003; King N. E. et al., 2004; Naus S. et al., 2006). В ряді робіт було показано, що білок АDАМ8 є потенційним прогностичним сироватковим маркером при карциномах легені та нирки, а також встановлено кореляцію його експресії з прогресуванням процесу при раку легені, передміхурової залози, з меншою виживаністю хворих при карциномі нирки та зі збільшенням інвазивності пухлин головного мозку (Ishikawa N. et al., 2004; Roemer A. et al., 2004; Fritzsche F. R. et al., 2006; Wildeboer D. et al., 2006).
До теперішнього часу, при розвитку РПЗ була вивчена експресія тільки трьох членів родини АDАМ, а саме АDАМ9, ADAM15 і АDАМ17 та показана їх можлива участь у патогенезі РПЗ (Grutzmann R. et al., 2004; Ringel J. et al., 2006; Yamada D. et al., 2007). Визначено збільшення рівня експресії ADAM9 та ADAM15 у тканині РПЗ та показано, що білок ADAM17 стимулює злоякісну прогресію пухлини. Встановлена кореляція між експресією ADAM9 і меншою виживаністю хворих на РПЗ та зв’язок цього білка з агресивністю пухлини, що вказує на можливість його використання як прогностичного маркера при РПЗ.
Враховуючи дані про участь АDАМ8 у пухлинному процесі, зокрема у реалізації інвазійних потенцій пухлинних клітин, а також характеристику ПАПЗ як високоінвазивної пухлини, було вирішено визначити роль АDАМ8 у розвитку ПАПЗ та встановити можливі механізми його участі в патогенезі РПЗ.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відділі мікрооточення пухлинних клітин ІЕПОР НАН України у відповідності з планом науково-дослідної роботи інституту за темами: Експресія матриксних металопротеїназ і гіпоксія-індукованого фактору у злоякісних пухлинах шлунка та підшлункової залози: вплив на метастазування і перебіг захворювання” (2002-2004 рр., державний реєстраційний № 0102U000393), Експресія гіпоксія-асоційованих білків у пухлинній тканині та їхня роль у появі циркулюючих пухлинних клітин: вплив на злоякісну прогресію” (2005-2007 рр., державний реєстраційний № 0104U000842) та у Європейському дослідницькому центрі підшлункової залози відділу загальної хірургії Університету Карла Рупрехта, м. Хейдельберг (Німеччина) за темою Молекулярно-біологічна характеристика злоякісних пухлин шлунково-кишкового тракту, зокрема раку підшлункової залози” (2005-2007 рр.).
Мета дослідження. Визначити роль білка ADAM8 у розвитку раку підшлункової залози людини та встановити можливі механізми його участі в пухлинній прогресії.
Основні задачі дослідження.
1. Визначити експресію АDАМ8 на рівні мРНК та на рівні білка у клітинних лініях РПЗ та встановити залежність цієї експресії від стану оксигенації клітин.
2. Визначити вплив експресії білка АDАМ8 на інвазивну та проліферативну активність клітин РПЗ.
3. Визначити експресію АDАМ8 на рівні мРНК та на рівні білка у тканинах ПАПЗ та підшлункової залози (ПЗ) при хронічному панкреатиті (ХП) у порівнянні з донорською тканиною ПЗ людини.
4. Визначити локалізацію білка АDАМ8 у тканинах ПАПЗ, ПЗ при ХП та донорській тканині ПЗ людини.
5. Оцінити залежність виживаності хворих на ПАПЗ від експресії АDАМ8 на рівні мРНК та на рівні білка у пухлинній тканині ПЗ.
6. Визначити вміст білка АDАМ8 у сироватці крові хворих на ПАПЗ та ХП у порівнянні з сироваткою крові донорів.
7. Встановити клінічне значення металопротеїнази АDАМ8 при ПАПЗ.
Об’єкт дослідження: тканина ПАПЗ, тканина ПЗ донорів та хворих на ХП, сироватка крові хворих на РПЗ, ХП та здорових донорів, культури клітин карциноми ПЗ, карцинома легені Л´ьюїс мишей С57Bl/6.
Предмет дослідження: молекулярно-біологічні характеристики білка ADAM8, активність металопротеїназ 2 та 9.
Методи дослідження. Експресію білка ADAM8 у тканинному матеріалі визначали за допомогою імуногістохімічного методу, а у сироватці крові, лізатах та супернатантах клітинних ліній РПЗ, використовуючи твердофазний імуноферментний аналіз (ELISA). Рівень експресії білка АDАМ8 у клітинних лініях РПЗ за нормальної оксигенації і за умов гіпоксії та ефективність проведення трансфекції siRNA АDАМ8 у клітини РПЗ лінії Aspc

Список литературы

ВИСНОВКИ

В результаті комплексного дослідження встановлено, що металопротеїназа ADAM8 виконує важливу роль у патогенезі ПАПЗ людини, зокрема у формуванні агресивності пухлини та корелює з несприятливим перебігом захворювання.
1. Встановлено, що за умов гіпоксії рівень експресія мРНК ADAM8 збільшувався у 1,5-5,5 разів у 7 з 8 досліджених клітинних лініях РПЗ людини, при цьому рівень експресії білка ADAM8 (90 кДа) підвищувався в 1,2-5,9 разів у 5 з 8 клітинних ліній РПЗ у порівнянні з таким за умов нормальної оксигенації клітин.
2. Виявлено, що білок ADAM8 суттєво стимулює інвазивний потенціал клітин РПЗ, тоді як проліферативна активність клітин РПЗ не залежить від рівня експресії білка ADAM8.
3. Показано, що експресія мРНК ADAM8 у тканині ПАПЗ та тканині ПЗ хворих на ХП вище, ніж у тканині ПЗ донорів у 5,3 та 2,4 рази, відповідно.
4. Встановлено, що у тканинах ПАПЗ та ПЗ хворих на ХП білок ADAM8 експресується у двох активних формах: білок ”злущення” ADAM8 та залишковий білок ADAM8, який впливає на адгезивні властивості клітин та має значно більший рівень експресії у порівнянні з тканиною ПЗ донорів, де білок ADAM8 існує тільки у одній активній формі, а саме у формі залишкового білка.
5. У нормальній тканині ПЗ донорів експресія білка АDАМ8 (інтенсивність забарвлення при імуногістохімічному виявленні) або відсутня, або її рівень значно менший у порівнянні з тканинами ПАПЗ та ПЗ при ХП, де у 80% випадків інтенсивність забарвлення варіює від середньої до сильної.
6. Встановлено, що хворі на ПАПЗ з високим рівнем експресії мРНК ADAM8 у пухлинній тканині, мають достовірно меншу тривалість життя, ніж хворі, у пухлинній тканині яких рівень експресії мРНК ADAM8 був низький, що вказує на можливість використання визначення рівня експресії мРНК ADAM8 у прогностичних цілях. Встановлена тенденція до наявності зворотньої залежності між виживаністю хворих на РПЗ та рівнем експресії білка ADAM8 у пухлинній тканині.
7. Достовірної різниці між вмістом білка ADAM8 у сироватці крові хворих на РПЗ та ХП у порівнянні з сироваткою крові донорів не було виявлено.
8. Отримані дані дозволяють припустити, що виявлений нами білок з молекулярною масою 39 кДа є потенційним субстратом ”злущення” для металопротеїнази ADAM8 при розвитку РПЗ, який може бути використаний як мішень для створення засобів ”таргетної” терапії.

СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ

1. Pаncreatic cancer microenvironment / J. Kleeff, P. Beckhove , I. Esposito [et al.] // Int J Cancer. 2007.- V. 121, № 4.- Р. 699-705.
2. Saif M. W. Controversies in the adjuvant treatment of pancreatic adenocarcinoma / M. W. Saif // J Pancreas. 2007. - V. 8, № 5. Р. 545-552.
3. Neoadjuvant and adjuvant strategies for pancreatic cancer / P. Ghaneh, R. Smith, C. Tudor-Smith [et al.] // Eur J Surg Oncol. 2008. V. 34. P. 297-305.
4. Cancer statistics, 2007 / A. Jemal, R. Siegel, E. Ward [et al.] // CA Cancer J Clin. 2007. V. 57, № 1. P. 43-66.
5. Рак в Україні, 2005-2006 / [З. П. Федоренко, Л. О. Гулак, Є. Л. Горох та ін.]. - Бюлетень національного канцер-реєстру України. К., 2007. - № 8. 94 с.
6. Рак поджелудочной железы (современное состояние проблемы): Монография / [С. А. Шалимов, Д. С. Осинский, В. А. Черный та ін.]. - К. : Основа, 2007. - 320 с.
7. Genetics and biology of pancreatic ductal adenocarcinoma / A. F. Hezel, A. C. Kimmelman, B. Z. Stanger [et al.] // Genes and Dev. - 2006. V. 20. P. 1218-1249.
8. Tumor hypoxia, chemotherapeuitc resistance and hypoxia-related therapies / A. M. Shannon, D. J. Bouchier-Hayes, C. M. Condron [et al.] // Cancer Treat Rev. - 2003. V. 29. P. 297-307.
9. Tumor hypoxia and cancer progression / J. Zhou, T. Schmidt, S. Schnitzer [et al.] // Cancer Lett. 2006. - V. 237. P. 10-21.
10. Vaupel P. Hypoxia in cancer: significance and impact on clinical outcome / P. Vaupel, A. Mayer // Cancer Metastasis Rev. 2007. - V. 26. P. 225-239.
11. Chaudary N. / Hypoxia and metastasis // N. Chaudary, R.P. Hill // Clin Cancer Res. 2007. V. 13. P. 1947-1949.
12. Pancreatic tumors show high levels of hypoxia / A.C. Koong, V.K. Mehta, Q.T. Le [et al] // Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2000. V. 48. P. 919-922.
13. Tumor hypoxia correlates with metastatic tumor growth of pancreatic cancer in an orthotopic murine model / P. Buchler, H.A. Reber, R.S. Lavey [et al.] // J Surg Res. 2004. V. 120. P. 295-303.
14. Yokoi K. Hypoxia increases resistance of human pancreatic cancer cells to apoptosis induced by gemcitabine / K. Yokoi, I.J. Fidler // Clin Cancer Res. 2004. - V. 10. P. 2299-2306.
15. ADAM, a novel family of membrane proteins containing A Disintegrin And Metalloprotease domain: multipotential functions in cell-cell and cell-matrix interactions / T.G. Wolfsberg, P. Primakoff, D.G. Myles [et al.] // J Cell Biol. - 1995. V. 131. P. 275-278.
16. ADAM family proteins in the immune system / S. Yamamoto, Y. Higuchi, K. Yoshiyama [et al.] // Immunol Today. 1999 V. 20. P. 278-284.
17. A potential fusion peptide and an integrin ligand domain in a protein active in sperm-egg fusion / C.P. Blobel, T.G. Wolfsberg, C.W. Turck [et al.] // Nature (Lond.). 1992. V. 356. P. 248-252.
18. The precursor region of a protein active in sperm-egg fusion contains a metalloprotease and a disintegrin domain: structural, functional, and evolutionary implications / T.G. Wolfsberg, J.F. Bazan, C.P. Blobel [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. - P. 10783-10787.

19. ADAM, a widely distributed and developmentally regulated gene family encoding membrane proteins with A Disintegrin And Metalloprotease domain / T. G. Wolfsberg, P. D. Straight, R. Gerena [et al.] // Dev. Biol. 1995. - V. 169. P. 378-383.

20. Structure of the murine CD156 Gene, characterization of its promoter, and chromosomal location / M. Kataoka, K. Yoshiyama, K. Matsuura [et al.] // J Biol.Chem. 1997. V. 272, № 29. P. 18209-18215.

21. Mochizuki S. ADAMs in cancer cell proliferation and progression / S. Mochizuki, Y. Okada // Cancer Sci. 2007. V. 98, № 5. P. 621-628.

22. Oxidative stress induces ADAM9 protein expression in human prostate cancer cells / S.Y. Sung, H. Kubo, K. Shigemura [et al.] // Cancer Res. 2006. V. 66. P. 95199526.

23. Marshall A.J. Chronic hypoxia in the human neuroblastoma SH-SY5Y causes reduced expression of the putative alpha-secretases, ADAM10 and TACE, without altering their mRNA levels / A.J. Marshall, M. Rattray, P.F. Vaughan // Brain Res. 2006. - V. 1099. P. 18-24.

24. Pancreatic cancer / D. Li, K. Xie, R. Wolff [et al.] // Lancet. 2004. - V. 363. - Р. 1049-1057.
25. Tumor necrosis factor alpha induces a metalloprotease-disintegrin, ADAM8 (CD 156): implications for neuronglia interactions during neurodegeneration / U. Schlomann, S. Rathke-Hartlieb, S. Yamamoto [et al.] // J Neurosci. 2000. - V. 20. P. 79647971.

26. CD156 (human ADAM8): expression, primary amino acid sequence, and gene location / K. Yoshiyama, Y. Higuchi, M. Kataoka [et al.] // Genomics. 1997. V. 41. P. 56-62.
27. Molecular cloning of cDNA encoding MS2 antigen, a novel cell surface antigen strongly expressed in murine monocytic lineage / S. Yoshida, M. Setoguchi, Y. Higuchi [et al.] // Int Immunol. 1990. - V. 2. P. 585-591.
28. The enzymatic activity of ADAM8 and ADAM9 is not regulated by TIMPs / A. Amour, C.G. Knight, W.R. English [et al.] // FEBS Lett. 2002. - V. 524. P. 154-158.
29. Seals D.F. The ADAM8 family of metalloprotease: multidomain proteins with multiple functions / D.F. Seals, S.A. Courtneidge // Genes &Dev. 2003. - V. 17. P. 7-30.
30. The metalloprotease disintegrin ADAM8. Processing by autocatalysis is required for proteolytic activity and cell adhesion / U. Schlomann, D. Wildeboer, A. Webster [et al.] // J Biol Chem. 2002. V. 277, № 48. P. 210-219.
31. Kheradmand F. Shedding light on sheddases: role in growth and development / F. Kheradmand, Z. Werb // Bioessays. 2002. - V. 24. P. 812.

32. Shedding light on ADAM metalloproteinases / A.P. Huovila, A.J. Turner, M. Pelto-Huikko [et al.] // Trends Biochem Sci. 2005. - V. 30. P. 413-422.
33. Identification of candidate substrates for ectodomain shedding by the metalloprotease-disintegrin ADAM8 / S. Naus, S. Reipschlager, D. Wildeboer [et al.] // Biol Chem. 2006. - V. 387. P. 337-346.
34. Catalytic activity of ADAM8, ADAM15, and MDC-L (ADAM28) on synthetic peptide substrates and in ectodomain cleavage of CD23 / A.M. Fourie, F. Coles, V. Moreno [et al.] // J Biol Chem. 2003. - V. 278. P. 30469-30477.
35. Expression and regulation of a disintegrin and metalloproteinase (ADAM) 8 in experimental asthma / N.E. King, N. Zimmermann, S.M. Pope [et al.] // Am J Respir Cell Mol Biol. 2004. - V. 31. P. 257-265.
36. ADAM8 as a novel serological and histochemical marker for lung cancer / N. Ishikawa, Y. Daigo, W. Yasui [et al.] // Clin Cancer Res. 2004. V. 10. P. 8363-8370.
37. The membrane proteases adams and hepsin are differentially expressed in renal cell carcinoma. Are they potential tumor markers / A. Roemer, L. Schwettmann, M. Jung [et al.] // J Urol. 2004. - V. 172. P. 2162-2166.
38. ADAM8 expression in prostate cancer is associated with parameters of unfavorable prognosis / F.R. Fritzsche, M. Jung, C. Xu [et al.] // Virchows Arch. - 2006. - V. 449. P. 628-636.
39. Metalloproteinase disintegrins ADAM8 and ADAM19 are highly regulated in human primary brain tumors and their expression levels and activities are associated with invasiveness / D. Wildeboer, S. Naus, Q.X. Amy Sang [et al.] // J Neuropathol Exp Neurol. 2006. - V. 65. P. 516-527.
40. Increased expression of ADAM 9 and ADAM 15 mRNA in pancreatic cancer / D. Yamada, K. Ohuchida, K. Mizumoto [et al.] // Anticancer Res. 2007. - V. 27. P. 793-799.
41. ADAM9 expression in pancreatic cancer is associated with tumour type and is a prognostic factor in ductal adenocarcinoma / R. Grutzmann, J. Luttges, B. Sipos [et al.] // Br J Cancer. 2004. - V. 90. P. 1053-1058.
42. Aberrant expression of a disintegrin and metalloproteinase 17/tumor necrosis factor-alpha converting enzyme increases the malignant potential in human pancreatic ductal adenocarcinoma / J. Ringel, R. Jesnowski, N. Moniaux [et al.] // Cancer Res. 2006. - V. 66. P. 9045-9053.
43. SEER Cancer statistics Review, 1975-2002 / LAG Ries, D. Melbert, M. Krapcho [et al.] // National Cancer Institute. 2007. - http://seer.cancer.gov/csr/1975_2005/

44. Oya N. Chemoradiotherapy for pancreatic cancer: current status and perspectives / N. Oya // Int J Oncol. 2004. - V. 9. P. 451-457.

45. Garabrant familial risk of pancreatic cancer / M. Schenk, A.G. Schwartz, E. O`Neal [et al.] // J Natl Cancer Inst. 2001. - V. 93. P. 640-644.

46. Dietary factors and the risk of pancreatic cancer: a case-control study in Shanghai, China / B.T. Ji, W.H. Chow, G. Gridley [et al.] // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 1995. - V. 4. P. 885-893.

47. Food habits and pancreatic cancer: a case-control study of the francophone community in Montreal, Canada / P. Ghadirian, J. Baillargeon, A. Simard [et al.] // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 1995. - V. 4. P. 895899.

48. Berrington de Gonzalez A. A meta-analysis of obesity and the risk of pancreatic cancer / A. Berrington de Gonzalez, S. Sweetland, E. Spencer // Br. J. Cancer. 2003. - V. 89. P. 519523.

49. Everhart J. Diabetes mellitus as a risk factor for pancreatic cancer. A meta-analysis / J. Everhart, D. Wright // JAMA. 1995. - V. 273. P. 16051609.

50. A prospective study of cigarette smoking and the risk of pancreatic cancer / C.S. Fuchs, G.A. Colditz, M.J. Stampfer [et al.] // Arch. Intern. Med. 1996. - V. 156. P. 22552260.

51. Abnormal glucose metabolism and pancreatic cancer mortality / S.M. Gapstur, P.H. Gann, W. Lowe [et al.] // JAMA. 2000. - V. 283. P. 25522558.

52. Physical activity, obesity, height, and the risk of pancreatic cancer / D.S. Michaud, E. Giovannucci, W.C. Willett [et al.] // JAMA. 2001. - V. 286. - P. 921929.

53. Spalding D. Pancreatic cancer / D. Spalding, RCN. Williamson // Medicine. 2007. - V. 35, № 6. - P. 325-329.
54. Mancuso A. Current therapies and advances in the treatment of pancreatic cancer / A. Mancuso, F. Calabro, C.N. Sternberg // Crit Rev Oncol Hematol. 2006. - V. 58. P. 231-241.
55. Pancreatic cancer: from bench to 5-year survival / J. Kleeff, C. Michalski, H. Friess [et al.] // Pancreas. 2006. - V. 33. P. 111-118.
56. Welsch T. Molecular pathogenesis of pancreatic cancer: advances and challenges / T. Welsch, J. Kleeff, H. Friess // Curr Mol Med. 2007. - V. 7, № 5. - P. 504-521.
57. Warshaw A.L. Pancreatic carcinoma / A.L. Warshaw, C. Fernandez-del Castillo // N. Engl. J. Med. - 1992. - V. 326. - P. 455465.

58. Hoeckel M. Tumor hypoxia: definitions and current clinical, biologic, and molecular aspects / M. Hoeckel, P. Vaupel // J Natl Cancer Inst. 2001. - V. 93. - P. 266-276.
59. Brown J.M. The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy / J.M. Brown, A.J. // Ciaccia Cancer Res. 1998. - V. 58. - P. 1408-1416.
60. Pugh Ch.W. Regulation of angiogenesis by hypoxia: role of the HIF system / Ch.W. Pugh, P.J. Ratcliff // Nature Med. 2003. - V. 9. - P. 677-684.
61. Dachs G.U. Hypoxia modulated gene expression: angiogenesis, metastasis and therapeutic exploitation / G.U. Dachs, G.M. Tozer // Eur. J. Cancer. 2000. - V. 36. - P. 1649-1660.
62. Chambers A.F. Changing Views of Role of Matrix Metalloproteinases in Metastasis / A.F. Chambers, L.M. Matrisian // J Natl Cancer Inst. 1997. - V. 89. - P. 1260-1270.
63. De Jaeger K. Relationship of hypoxia to metastatic ability in rodent tumours // K. De Jaeger, M-C. Kavanagh, R.P. Hill // Br J Cancer. 2001. - V. 84. - P.1280-1285.
64. Tumor oxygenation predicts for the likelihood of distant metastases in human soft tissue sarcoma / D.M. Brizel, P.S. Scully, J.M. Harrelson [et al.] // Cancer Res. 1996. - V. 56. - P. 941- 943.
65. Hypoxia in human soft tissue sarcoma: adverse impact on survival and no association with p 53 mutations / M. Nordsmark, J. Alsner, J. Keller [et al.] // Br J Cancer. 2001. - V. 84. P. 1070-1075.
66. Association between tumor hypoxia and malignant progression in advanced cancer of the uterine cervix / M. Höckel, K. Schlenger, B. Arai [et al.] // Cancer Res. 1996. - V. 56. - P. 4509-4515.
67. Rofstad E.K. Hypoxia-associated spontaneous pulmonary metastasis in human melanoma xenografts: involvement of microvascular hot spots induced in hypoxic foci by interleukin 8 / E.K. Rofstad, E.F. Halsar // Br J Cancer. 2002. - V. 86. P. 301-308.
68. Zhang L. Hypoxia enhances metastatic efficiency by up-regulation Mdm2 in KHT cells and increasing resistance to apoptosis / L. Zhang, R.P. Hill // Cancer Res. 2004. - V. 64. - P. 4180-4189.
69. Engers R. Mechanisms of tumor metastasis: cell biological aspects and clinical implications / R. Engers, H.E. Gabbert // J Res Clin Oncol. 2000. - V. 126. P. 682-692.
70. Vihinen P. Matrix metalloproteinases in cancer: Prognostic markers and therapeutic tagets / P. Vihinen, V-M. Kähäri // Int J Cancer. 2002. - V. 99. - P. 157-166.
71. Effects of hypoxia, hyperoxia on the regulation of expression and activity of matrix metalloproteinase-2 in hepatic stellate cells / P.S. Chen, W.R. Zhai, X.M. Zhou [et al.] // World J Gastroenterol. 2001. - № 7. - P. 647-651.
72. Influence of hypoxia on the expression of matrix metalloproteinase-1, -3 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in rheumatoid synovial fibroblasts / H.S. Cha, K.S. Ahn, C.H. Jeon [et al.] // Clin Exp Rheumatol. 2003. - V. 21. - P. 593-598.
73. Oxygen-mediated regulation of gelatinase and tissue inhibitor of metalloproteinases-1 expression by invasive cells / M.T. Canning, L.M. Postovit, S.H. Clarke [et al.] // Exp Cell Res. 2001. - V. 267. - P. 88-94.
74. Himelstein B.P. Studies of type IV collagenase regulation by hypoxia / B.P. Himelstein, C.J. Koch // Cancer Lett. 1998. - V. 124. - P. 127-133.
75. Expression and hypoxic regulation of vascular endothelial growth factor and matrix metalloproteinase-9 in esophageal carcinoma / W. Guo, Y. Ran, G. Wang [et al.] // Zhonghua Zhong Liu Za Zhi. - 2002. - V. 24. - P. 44-47.
76. Cuvier C. Exposure to hypoxia, glucose startvation and acidosis: effect on invasive capacity of murine tumor cells and correlation with cathepsin (L + B) secretion / C. Cuvier, A. Jang, R.P. Hill // Clin Exp Metastasis. 1997. - V. 15. - P. 19-25.
77. Kloppel G. Tumors of the endocrine pancreas / G. Kloppel // Pathologe. 2003. - V. 24, № 4. - P. 265-271.
78. Nagase H. Matrix metalloproteinases / H. Nagase, J.F. Woessner // J Biol Chem. 1999. - V. 274. - P. 1491-1494.
79. Sternlicht M.D. How matrix metalloproteinases regulate cell behavior // M.D. Sternlicht, Z. Werb // Annu Rev Cell Dev Biol. 2001. - V. 17. - P. 463-516.
80. Radisky D.C. Matrix metalloproteinase-induced fibrosis and malignancy in breast and lung / D.C. Radisky, J.A. Przybylo // Proc Am Thorac Soc. 2008. - № 5. - P. 316-322.
81. Bissel M.J. Putting tumours in context // M.J. Bissel, D.C. Radisky // Nat Rev Cancer. 2001. - № 1. - P. 46-54.
82. Direct correlation between proliferative activity and dysplasia in pancreatic intraepithelial neoplasia (PanIN): additional evidence for a recent proposed model of progression / W.M. Klein, R.H. Hruban, A.J. Klein-Szanto [et al.] // Mod Pathol. 2002. V.15, № 4. Р. 441-447.
83. Seals D.F. The ADAMs family of metalloproteases: multidomain proteins with multiple functions / D.F. Seals, S.A. Coutneidge // Genes Dev. 2003. - V. 17. - P. 7-30.
84. Cysteine-rich domain of human ADAM 12 (meltrin alpha) supports tumor cell adhesion / K. Iba, R. Albrechtsen, B.J. Gilpin [et al.] // Am J Pathol. 1999. - V. 154. P. 14891501.

85. ADAM13 disintegrin and cysteine- rich domains bind to the second heparin-binding domain of fibronectin / A. Gaultier, H. Cousin, T. Darribere [et al.] // J Biol Chem. 2000. - V. 23. - P. 336344.

86. Regulation of matrix metalloproteinases: an overview / S. Chakraborti, M. Mandal, S. Das [et al.] // 2003. - V. 253, № 1-2. - P. 269-285.

87. Cheng X.C. Advances in assaya of matrix metalloproteinases (MMPs) and their inhibitors / X.C. Cheng, H. Fang, W.F. Xu // J Enzyme Inhib Med Chem. 2008. - V. 23, № 2. - P.154-167.

88. Handsley M.M. Mettaloproteinases and their inhibitors in tumor angiogenesis / M.M. Handsley, D.R. Edwards // Int J Cancer. 2005. - V. 115. - P. 849-860.

89. Vihinen P. Matrix metalloproteinases in cancer: prognostic markers and therapeutic targets / P. Vihinen, V-M. Kähäri // Ins J Cancer. 2002. - V. 99. - P.157-166.

90. Orlichenko L.S. Matrix metalloproteinases stimulate epithelial-mesenchymal transition during tumor development / L.S. Orlichenko, D.C. Radisky. // Clin Exp Metastasis. 2008. V. 25, № 6.- Р. 593-600.
91. Nagase H. Matrix metalloproteinases / H. Nagase, J.F. Jr Woessner // J Biol Chem. 1999. - V. 274. - P. 1491-1494.
92. Sharipo S.D. Matrix metalloproteinase degradation of extracellular matrix: biological concequences / S.D. Sharipo // Curr Opin Cell Biol. 1998. - V. 10. - P. 602-608.

93. Westermarek J. Regulation of matrix metalloproteinase expression in tumour invasion / J. Westermarek, V.M. Kähäri // FASEB J. 1999. - V. 13. - P. 781-792.
94. Baker A.H. Metalloproteinase inhibitors: biological actions and therapeutic opportunities / A.H. Baker, D.R. Edwards, G. Murphy // J Cell Sci. 2002. - V. 115. - P. 37193727.

95. Brew K. Tissue inhibitors of metalloproteinases: evolution, structure and function / K. Brew, D. Dinakarpandian, H. Nagase // Biochim Biophys Acta. 2000. - V. 1477. - P. 267283.

96. E. coli