ОСОБЛИВОСТІ РОЗСЕЛЕННЯ І ДИФЕРЕНЦІЮВАННЯ ГЕМОПОЕТИЧНИХ СТОВБУРОВИХ КЛІТИН РІЗНОГО СТУПЕНЯ ЗРІЛОСТІ ТА ЇХ ВПЛИВ НА ФУНКЦІЮ ІМУННОЇ СИСТЕМИ У МИШЕЙ РІЗНОГО ВІКУ : ОСОБЕННОСТИ РАССЕЛЕНИЯ И дифференцировку гемопоэтических стволовых клеток разной степени зрелости И ИХ ВЛИЯНИЕ НА функции иммунной системы у мышей РАЗНОГО ВОЗРАСТА

Краткое описание

ДЕРЖАВНА УСТАНОВА
ІНСТИТУТ ГЕРОНТОЛОГІЇ
АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ”

На правах рукопису
Кирик Віталій Михайлович

УДК: 612.119.014.3-612.67.071.1

ОСОБЛИВОСТІ РОЗСЕЛЕННЯ І ДИФЕРЕНЦІЮВАННЯ ГЕМОПОЕТИЧНИХ СТОВБУРОВИХ КЛІТИН РІЗНОГО СТУПЕНЯ ЗРІЛОСТІ ТА ЇХ ВПЛИВ НА ФУНКЦІЮ ІМУННОЇ СИСТЕМИ У МИШЕЙ РІЗНОГО ВІКУ

14.03.08 імунологія та алергологія

Дисертація на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук

Науковий керівник

Бутенко Геннадій Михайлович
доктор медичних наук, професор, академік АМН України

Київ 2009

ЗМІСТ

ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ..........................................................

6

ВСТУП...............................................................................................................

7

РОЗДІЛ 1. Огляд літератури.........................................................................

12

1.1. Загальні фенотипічні характеристики ГСК............................................

14

1.2. Диференціація ГСК в кістковому мозку та тимусі.................................

17

1.3. Роль ніші у розвитку і функціонуванні ГСК...........................................

20

1.4. ГСК та старіння організму.........................................................................

22

1.5. Відновлення гемопоезу після опромінення.............................................

24

1.6. Регенераторний потенціал фетальних ГСК.............................................

26

1.7. Дослідження міграції та пластичності ГСК............................................

28

РОЗДІЛ 2. Матеріали і методи досліджень................................................

32

2.1 Загальна характеристика експериментальної моделі і тварин................

32

2.2. Методика експерименту............................................................................

36

2.2.1. Методика опромінення мишей...............................................................

36

2.2.2. Методика виділення ГСК кісткового мозку мишей.............................

36

2.2.3. Методика виділення ГСК фетальної печінки мишей...........................

37

2.2.4. Визначення субпопуляцій ГСК в кістковому мозку та фетальній печінці та сортування їх для трансплантації...................................................

38

2.2.5. Методика трансплантації ГСК мишам..................................................

40

2.2.6. Методика моделювання ішемії гіпокампа у мишей.............................

41

2.2.6. Методика трансплантації ГСК мишам з моделлю ішемії гіпокампа.

41

2.3. Методи досліджень експериментальних тварин.....................................

42

2.3.1. Евтаназія та розтин експериментальних тварин..................................

42

2.3.2. Забір крові у лабораторних тварин та отримання сироватки..............

42

2.3.3. Виділення клітин кісткового мозку тварин..........................................

43

2.3.4. Виділення клітин тимуса тварин............................................................

43

2.3.5. Виділення клітин селезінки тварин.......................................................

44

2.3.6. Виділення клітин перитонеального ексудату тварин..........................

44

2.3.7. Підрахунок кількості клітин кісткового мозку, тимуса, селезінки та перитонеального ексудату................................................................................

45

2.3.8. Визначення кількості антитілоутворюючих та авто-антитілоутворюючих клітин селезінки методом реакція локального гемолізу в гелі (за Еrne)....................................................................................

45

2.3.9. Визначення поглинальної активності перитонеальних макрофагів...

47

2.3.10. Визначення титру гемаглютинінів та гемолізинів в сироватці крові мишей........................................................................................................

48

2.3.11. Визначення кількості клітин-попередників гранулоцитарно-макрофагальних колоній в кістковому мозку мишей...................................

49

2.3.12. Визначення кількості колоній стромальних клітин-попередників фібробластів в моношарових культурах кісткового мозку мишей..................................................................................................................

51

2.3.13. Визначення проліферативної активності спленоцитів в реакції бласттрансформації під впливом Т- та В-клітинних мітогенів.....................

52

2.3.14. Визначення субпопуляцій Т-лімфоцитів в кістковому мозку, тимусі та селезінці мишей................................................................................

53

2.3.15. Імуногістохімічний метод виявлення трансплантованих клітин в головному мозку мишей...................................................................................

54

2.4. Методи статистичної обробки результатів досліджень..........................

56

РОЗДІЛ 3. Вплив трансплантації ГСК кісткового мозку та фетальної печінки на відновлення функцій імунної системи у мишей після їх летального опромінення..................................................................

57

3.1. Характеристика ГСК кісткового мозку та фетальної печінки...............

57

3.2. Виживання тварин після опромінення та трансплантації ГСК.............

61

3.3. Зміни в кістковому мозку у опромінених тварин після трансплантації ГСК...........................................................................................

63

3.4. Зміни в тимусі у опромінених тварин після трансплантації ГСК.....................................................................................................................

68

3.5. Зміни субпопуляцій тимоцитів у опромінених тварин після трансплантації ГСК...........................................................................................

73

3.6. Зміни в селезінці у опромінених тварин після трансплантації ГСК.....................................................................................................................

76

3.7. Показники фагоцитарної активності перитонеальних макрофагів у опромінених реципієнтів ГСК..................................................................

81

3.8. Показники гуморального імунітету у опромінених реципієнтів ГСК.....................................................................................................................

83

3.9. Висновки ..................................................................................................

89

РОЗДІЛ 4. Вплив трансплантації ГСК кісткового мозку та фетальної печінки на функцію імунної системи в неопроміненому організмі.........................................................................................................

91

4.1. Клітинні показники кісткового мозку у неопромінених тварин після трансплантації ГСК..........................................................................................

92

4.2. Вміст КУК-ГМ та КУК-Ф в кістковому мозку реципієнтів ГСК..........

95

4.3. Зміни клітинних показників тимуса у тварин після трансплантації ГСК......................................................................................................................

98

4.4. Зміни субпопуляцій клітин селезінки у тварин з трансплантацією ГСК......................................................................................................................

102

4.5. Проліферативна активність спленоцитів у реципієнтів ГСК................

105

4.6. Фагоцитарна активність перитонеальних макрофагів у неопромінених реципієнтів ГСК...................................................................

107

4.7. Висновки розділу ......................................................................................

109

РОЗДІЛ 5. Оцінка розселення трансплантованих клітин........................

111

5.1. Заселення кісткового мозку трансплантованими клітинами.................

111

5.2. Проліферативний потенціал трансплантованих ГСК в культурах клітин кісткового мозку....................................................................................

113

5.3. Здатність ГСК мігрувати в осередок пошкодження нервової тканини.

118

5.4. Висновки розділу......................................................................................

121

РОЗДІЛ 6. Аналіз і узагальнення результатів досліджень......................

123

ВИСНОВКИ......................................................................................................

141

СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ.....................................................

144

ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ

АУК

антитілоутворюючі клітини

автоАУК

автоантитілоутворюючі клітини

Гр

грей

ГСК

гемопоетичні стовбурові клітини

ГСК КМ

гемопоетичні стовбурові клітини кісткового мозку

ГСК ФП

гемопоетичні стовбурові клітини фетальної печінки

КУК-Ф

колонієутворююча клітина фібробластів

КУК-ГМ

колонієутворююча клітина гранулоцитів та макрофагів

ЛПС

ліпополісахарид

СЕК

сироватка ембріонів корів

ФГА

фітогемаглютинін

CD

cluster of differentiation, кластер диференціації (маркерна молекула фенотипу клітини)

DN

double negative, подвійні негативні (тимоцити)

DP

double positive, подвійні позитивні (тимоцити)

FACS

fluorescence-activated cell sorting, флуоресцентно-активоване сортування клітин

GFP

green fluorescent protein, зелений флуоресцентний білок

LSK клітини

гемопоетичні стовбурові клітини з фенотипом Lin-Sca-1+c-kit+

LT-HSC

long-term hematopoietic stem cells, гемопоетичні клітини, здатні довготривало підтримувати гемопоез

SP

single positive, одинарні позитивні (тимоцити)

ST-HSC

short-term hematopoietic stem cells, гемопоетичні клітини, здатні короткочасно підтримувати гемопоез

TN

triple negative, потрійні негативні (тимоцити)

ВСТУП

Актуальність теми. Імунна система відіграє важливу роль в адаптації організму до впливу умов зовнішнього середовища та регулюванні його гомеостазу [1, 2, 3]. Ця система постійно зазнає негативного впливу зовнішніх факторів та спричинених ними ендогенних порушень, що позначається на зниженні функціональних можливостей системи імунітету та організму в цілому [4, 5]. Особливо чітко ці порушення простежуються з віком, коли накопичення змін в імунологічній реактивності призводить до стійкого зниження адаптаційних та репаративних можливостей організму [6, 7, 8, 9, 10]. Припускають, що відновлення вихідного стану імунної системи або корекція наявних порушень можуть бути досягнуті за рахунок заміщення втрачених або функціонально ослаблених імунокомпетентних клітин. Як відомо, їх попередниками є гемопоетичні стовбурові клітини (ГСК), вміст в тканинах та функціональна активність яких з віком можуть зменшуватись [11, 12, 13, 14].
Найважливіша властивість ГСК полягає в здатності підтримувати власну популяцію протягом тривалого часу і забезпечувати диференційовані клітини крові та імунної системи, які виконують в організмі специфічні функції [15]. Біологічна значимість стовбурових клітин полягає в тому, що вони відіграють провідну роль в організації багатоклітинних організмів і є центральним елементом структурно-функціональних одиниць тканин і органів [16, 17, 18]. Проліферативний потенціал ГСК дуже високий і тривалість життя їх популяції може значно перевищувати тривалість життя організму [19]. Це дозволяє ставити питання про вивчення геронтологічних аспектів застосування гемопоетичних стовбурових клітин [20, 21, 22, 23, 24].
Дослідження, присвячені використанню стовбурових клітин з терапевтичною метою, займають провідні позиції в сучасній регенеративній медицині [25, 26, 27, 28, 29]. За останні роки розроблено численні методики ізолювання, культивування, модифікації різних типів стовбурових клітин, що дозволило розвивати як фундаментальні наукові, так практичні дослідження. Трансплантація клітин перетворилася в новий спосіб вивчення раннього ембріо- і органогенезу, з’ясування долі спеціалізованих клонів клітин в ембріонах та фетальних тканинах, аналізу їх взаємодії в розвитку організму [30, 31, 32, 33, 34, 35]. Пересадження клітин, направлено диференційованих в певний спеціалізований тип, планується використовувати у вигляді замісної клітинної, тканинної або генної терапії у випадку фатальних імунодефіцитів, спадкових дефектів клітинного метаболізму, а також гострої функціональної недостатності органів, або втрати тканин [36, 37, 38, 39, 40].
Розробка підходів до терапевтичного застосування стовбурових клітин має ґрунтуватись на розумінні їх клітинної біології, механізмів диференціювання і функціонування в нормі та в умовах патологічних змін в організмі. Тому актуальним завданням для сучасної науки стає глибоке вивчення фундаментальних властивостей стовбурових клітин, як відповідальний крок на шляху до їх клінічного застосування.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно з планом науково-дослідної теми 40.07 лабораторії патофізіології та імунології Інституту геронтології АМН України Регенераційні властивості стовбурових клітин кісткового мозку при пошкодженні тканин у мишей різного віку”, номер державної реєстрації 0107u002582, в якій дисертант приймав участь як виконавець окремих фрагментів.
Мета дослідження. Метою роботи було оцінити вплив трансплантації гемопоетичних стовбурових клітин на функцію імунної системи в молодому та старому організмі та виявити особливості їх розселення і диференціювання.
Задачі дослідження.
1. Оцінити ефекти впливу гемопоетичних стовбурових клітин на кількісні та якісні показники функціонування імунної системи в умовах її пошкодження.
2. Вивчити зміни клітинних та функціональних показників органів імунної системи при трансплантації гемопоетичних стовбурових клітин різного ступеня зрілості в нормальному молодому та старому організмі.
3. Порівняти показники імунологічної реактивності при введенні гемопоетичних стовбурових клітин залежно від ступеня їх зрілості та віку реципієнта.
4. Виявити особливості розселення та диференціювання трансплантованих гемопоетичних стовбурових клітин різного ступеня зрілості в кістковому мозку реципієнтів.
Об’єкт дослідження. Особливості функціонального стану імунної системи у мишей ліній СВА/Са та FVB різного віку після летального опромінення та без опромінення в умовах трансплантації ГСК кісткового мозку молодих донорів або ГСК фетальної печінки плодів мишей 13,5 дня гестаційного періоду.
Предмет дослідження. Показники імунної відповіді, субпопуляції клітин кісткового мозку, тимуса, селезінки, клітини-попередники кісткового мозку, тимус, селезінка, сироватка крові мишей.
Методи дослідження. Визначення субпопуляцій клітин кісткового мозку, тимуса, селезінки і фетальної печінки з використанням моноклональних антитіл до поверхневих мембранних маркерів; дослідження здатності стовбурових клітин кісткового мозку утворювати in vitro колонії клітин-попередників гранулоцитів і макрофагів (КУК-ГМ) та колонії стромальних клітин-попередників фібробластів (КУК-Ф) за допомогою культурального методу; визначення проліферативної активності спленоцитів під впливом Т-клітинних (фітогемаглютинін - ФГА) та В-клітинних (ліпополісахарид E.coli - ЛПС) мітогенів в реакції бласттрансформації лімфоцитів; оцінка показників фагоцитарної активності перитонеальних макрофагів в реакції поглинання латексу; визначення рівня аглютинінів та гемолізинів в сироватці крові мишей; визначення кількості антитілоутворюючих клітин (АУК) в селезінці; виявлення нащадків трансплантованих клітин в кістковому мозку реципієнтів ГСК по флуоресценції зеленого флуоресцентного білка (GFP) методом люмінесцентної мікроскопії та проточної цитометрії; виявлення трансплантованих ГСК в головному мозку імуногістохімічним методом з використанням моноклональних антитіл проти GFP за допомогою лазерної скануючої мікроскопії; визначення маси тіла, тимуса, селезінки та індексу маси тимуса і селезінки; визначення загальної кількості ядровмісних клітин кісткового мозку, тимуса, селезінки, перитонеального ексудату.
Наукова новизна отриманих результатів. Показано особливості впливу ГСК кісткового мозку та фетальної печінки на імунологічні процеси в різні вікові періоди в умовах радіаційного пошкодження та в інтактному організмі. Визначені особливості відновлювальної дії ГСК, залежно від ступеня їх зрілості та віку реципієнта. Отримано докази розселення та диференціювання трансплантованих ГСК в організмі та показано здатність ГСК мігрувати в осередок ішемічного пошкодження гіпокампа в головному мозку. Отримані результати розкривають додаткові механізми функціонування стовбурових клітин, вивчення яких є основою розуміння ряду як фізіологічних, так і патологічних процесів для імунології, гематології та геронтології.
Практичне значення отриманих результатів. Одержані важливі дані, які є складовою для встановлення механізмів розвитку і старіння організму та дозволяють оцінити оптимальні варіанти та умови виділення і трансплантації ГСК з метою більш ефективного відновлювального або корегуючого впливу на імунну систему, що є одним з ключових завдань регенеративної медицини та трансплантології.
Особистий внесок здобувача. Автором особисто виконані дослідження та аналіз наукової інформації за темою дисертації, визначена мета та поставлені задачі дослідження, розроблено протоколи реєстрації результатів дослідження, проведений відбір тварин, відпрацьовано модель летального опромінення мишей, виділено ГСК різного ступеня зрілості та трансплантовано їх опроміненим і неопроміненим мишам, проведена статистична обробка, аналіз та інтерпретація результатів, сформульовані висновки, розроблено дизайн рукопису дисертації, а також підготовлені матеріали до друку.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи оприлюднені на Х Українській науково-практичній конференції з актуальних питань клінічної та лабораторної імунології, алергології та імунореабілітації, (Київ, 2008); на V національному Конгресі патофізіологів України Сучасні проблеми патофізіології: від молекулярно-генетичних до інтегративних аспектів” (Запоріжжя, 2008); на науковій конференції молодих вчених з міжнародною участю Актуальні проблеми геронтології та геріатрії”, присвяченій пам’яті академіка В. В. Фролькіса (Київ, 2009); на XIII Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В. И. Иоффе Дни иммунологии в Санкт-Петербурге” (Санкт-Петербург, Российская Федерация, 2009); будуть представлені на World Conference on Regenerative Medicine (Leipzig, Germany, 2009).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 наукових праць, з них - 3 журнальних статті у фахових наукових виданнях, затверджених ВАК України, 3 патенти на корисну модель, 5 тез доповідей; до друку подано 1 статтю та тези доповідей.
Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 171 сторінці друкарського тексту та включає вступ, огляд літератури, опис матеріалів і методів досліджень, 3 розділи власних досліджень, узагальнення одержаних результатів, висновки, список використаної літератури, який містить 275 джерел, з них 36 кирилицею та 239 латиницею. Робота ілюстрована 20 таблицями, 32 рисунками та 13 фотографіями.

Список литературы

ВИСНОВКИ

В дисертаційній роботі здійснено теоретичне узагальнення та наведено вирішення наукового завдання щодо виявлення впливу трансплантації гемопоетичних стовбурових клітин різного ступеня зрілості на функцію імунної системи в нормі та при її пошкодженні в молодому і старому віці. Показано, що зміни більшості імунологічних показників у мишей-реципієнтів гемопоетичних стовбурових клітин в основному визначаються віком реципієнта та пов’язаними з ним особливостями диференціювання трансплантованих клітин, і в меншій мірі - ступенем їх зрілості та походженням.
1. Трансплантація гемопоетичних стовбурових клітин кісткового мозку та фетальної печінки дозволяє компенсувати пошкодження імунної системи та впливає на перебудову імунної відповіді у молодих та старих мишей.
2. У опромінених та неопромінених мишей в ранні терміни після трансплантації гемопоетичних стовбурових клітин кісткового мозку або фетальної печінки субпопуляції клітин в тимусі перерозподіляються в бік зростання ранніх недиференційованих CD4-8- тимоцитів та диференційованих CD4+8- і CD4-8+ клітин, при відносному зниженні кількості проміжних малодиференційованих CD4+8+ тимоцитів, що вказує на прискорення дозрівання цих клітин в тимусі.
3. Виявлено збільшення кількості CD4+8+ клітин в кістковому мозку та селезінці після опромінення та трансплантації гемопоетичних стовбурових клітин фетальної печінки у старих мишей, а у молодих після трансплантації гемопоетичних стовбурових клітин кісткового мозку. Трансплантація фетальних клітин в старому опроміненому організмі сприяє міграції недиференційованих попередників лімфоцитів з тимуса в кістковий мозок та селезінку в ранні періоди після опромінення більш виражено, ніж трансплантація кістково-мозкових клітин.
4. В ранні терміни після трансплантації гемопоетичних стовбурових клітин кісткового мозку або фетальної печінки у опромінених молодих та старих мишей зростають показники фагоцитарної активності перитонеальних макрофагів, при зменшенні їх загального числа, що свідчить про стимуляцію захисних механізмів на фоні дисфункції адаптивної імунної системи.
5. Через 3 тижні після опромінення виявлено зростання числа ядровмісних клітин кісткового мозку у молодих та старих мишей-реципієнтів гемопоетичних стовбурових клітин фетальної печінки; зростання маси тимуса і селезінки у молодих тварин обох груп, зменшення кількості ядровмісних клітин селезінки; зростання титрів гемаглютинінів та гемолізинів у всіх експериментальних групах. Ці зміни виявились тимчасовими і на 12-му тижні вказані показники повернулись до вихідних значень у інтактних тварин.
6. При трансплантації гемопоетичних стовбурових клітин кісткового мозку та фетальної печінки у неопромінених молодих та старих мишей співвідношення в кістковому мозку стромальних клітин-попередників до гемопоетичних попередників зменшується, що вказує на перерозподіл основних класів стовбурових клітин на рівні мікрооточення.
7. У молодих неопромінених реципієнтів гемопоетичних стовбурових клітин фетальної печінки зростає здатність спленоцитів до бласттрансформації як під дією Т-клітинних, так і В-клітинних мітогенів. В молодому неопроміненому організмі трансплантація фетального матеріалу викликає більш виражену проліферацію та міграцію клітин, ніж в старому.
8. В ранні терміни після трансплантації гемопоетичних стовбурових клітин в кістковому мозку молодих неопромінених мишей відносна кількість нащадків трансплантованих клітин з потенціалом утворення колоній гранулоцитарно-макрофагального ряду є більшою, ніж відносна кількість усіх нащадків трансплантованих клітин. Трансплантовані стовбурові клітини та клітини-прогенітори кісткового мозку і фетальної печінки мають вищу проліферативну активність, ніж прогенітори кісткового мозку реципієнта.
9. Гемопоетичні стовбурові клітини фетальної печінки здатні мігрувати в осередок ішемічного пошкодження головного мозку миші при їх субокципітальному інтравентрикулярному введенні та зберігати свою життєздатність в перші 14 діб після трансплантації.

СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ

1. Дранник Г. Н. Kлиническая иммунология и аллергология. — 3-е изд., доп. / Г. Н. Дранник. — К.: Полиграф плюс, 2006. — 482 c.
2. Игнатов П. Е. Иммунитет и инфекция / Игнатов П. Е. — Москва: Время, 2002. — 352 с.
3. Abbas A. Basic immunology: functions and disorders of the immune system. 2nd ed. / Abbas A., Lichtman A. — Philadelphia: Elsevier Inc., 2004. — 322 p.
4. Чернишов А. В. Субпопуляції лімфоцитів і дія на організм іонізуючого випромінювання / Чернишов А. В. // Український медичний часопис. — 2004. — № 5. — С. 120—123.
5. Geiger H. The aging of lympho-hematopoietic stem cells / Geiger H., Van Zant G. // Nat. Immunol. — 2002. — Vol. 3, № 4. — P. 329—333.
6. Бутенко Г. М. Старение иммунной системы / Бутенко Г. М. // Проблемы старения и долголетия. — 1998. — Т. 4, № 3. — С. 251—258.
7. Ярилин А. А. Старение иммунной системы и тимус / Ярилин А. А. // Клиническая геронтология. — 2003. — № 3. — С. 8—17.
8. de Haan G. Mouse strain-dependent changes in frequency and proliferation of hematopoietic stem cells during aging: correlation between lifespan and cycling activity / de Haan G., Nijhof W., Van Zant G. // Blood. — Vol. 89, № 5. — 1997. — P. 1543—1550.
9. Ogawa T. Age-related changes of human bone marrow: a histometric estimation of proliferative cells, apoptotic cells, T cells, B cells and macrophages / Ogawa T., Kitagawa M., Hirokawa K. // Mech. of Ageing and Devel. — 2000. — Vol. 117. — P. 57—68.
10. Age-dependent increase in side population distribution within hematopoiesis: implications for our understanding of the mechanism of aging / Pearce D. J., Anjos-Afonso F., Ridler C. [et al.] // Stem Cells. — 2007. — Vol. 25. — P. 828—835.
11. de Haan G. Dynamic changes in mouse hematopoietic stem cell numbers during aging / de Haan G., Van Zant G. // Blood. — 1999. — Vol. 93, № 10. — P. 3294—3301.
12. Rao M. Stem cells and aging: expanding the possibilities / Rao M., Mattson M. // Mech. Ageing Dev. — 2001. — Vol. 122. —P. 713—734.
13. Schlessinger D. Does functional depletion of stem cells drive aging? / Schlessinger D., Van Zant G. // Mech. Ageing Dev. — 2001. — Vol. 30, № 122. — P. 1537—1553.
14. Van Zant G. The role of stem cells in aging / Van Zant G., Liang Y. // Exp. Hematol. — 2003. — Vol. 31, № 8. — P. 659—672.
15. Атлас клеток крови и костного мозга / Под ред. Г. И. Козинца. — Москва: Триада—Х, 1998. — 160 с.
16. Bryder D. Hematopoietic stem cells. The paradigmatic tissue-specific stem cell / Bryder D., Rossi D. J., Weissman I. L. // The American Journal of Pathology. — 2006. — Vol. 169, № 2. — P. 338—346.
17. Hematopoietic fingerprints: an expression database of stem cells and their progeny / Chambers S. M., Boles N. C., Lin K. K. [et al.] // Cell Stem Cell. — 2007. — Vol. 1. — P. 578—591.
18. Stem cells handbook / Ed. by S. Sell. — Totowa: Humana Press Inc., 2004. — 526 p.
19. Proliferative capacity of murine hematopoietic stem cells / Hellman S., Botnick L. E., Hannon E. C., Vigneulle R. M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1978. — Vol. 75, № 1. — P. 490—494.
20. Бутенко Г. М. Применение стволовых клеток в геронтологических исследованиях / Бутенко Г. М. // Пробл. старения и долголетия. — 2008. — T. 17, № 2. — С. 144—149.
21. Butenko G. M. Ageing of the immune system and diseases / Butenko G. M. // Age-related factors in cancerogenesis. IARC scientific publication. — 1986. — Vol. 58. — P. 71—83.
22. Butenko G. Functional properties of hematopoietic cells in aging / Butenko G., Andrianova L. // Arch. Biol. — 1985. — Vol. 96. — P. 246—251.
23. Chen J. Development and aging of primitive hematopoietic stem cells in BALB/cBy mice / Chen J., Astle C. M., Harrison D. E. // Exp. Hematol. — 1999. — Vol. 27. — P. 928—935.
24. Liang Y. Effect of aging on the homing and engraftment of murine hematopoietic and progenitor cells / Liang Y., Van Zant G., Szilvassy S. J. // Blood. — 2005. — Vol. 106. — P. 1479—1487.
25. Gurtner G. C. Progress and potential for regenerative medicine / Gurtner G. C., Callaghan M. J., Longaker M. T. // Annu. Rev. Med. — 2007. — Vol. 58. — P. 299—312.
26. Serke S. A European reference protocol for quality assessment and clinical validation of autologous haematopoietic blood progenitor and stem cell grafts / Serke S., Johnsen H. // Bone Marrow Transplantation. — 2001. — Vol. 27. — P. 463—470.
27. Stem cells and regenerative medicine / Ed. by Low W. C., Verfaillie C. M. — Singapore: World Scientific Publishing Co, 2008. — 571 p.
28. Stem cells and the future of regenerative medicine // Committee on the Biological and Biomedical Applications of Stem Cell Research, Commission on Life Sciences National Research Council. — Washington: National Academy Press, 2003. — 94 р.
29. Weissman I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution / Weissman I. L. // Cell. — 2000. — Vol. 100. — P. 157—168.
30. Clinical bone marrow and blood stem cell transplantation / Ed. by Atkinson K., Champlin R., Ritz J. [et al.]. — [3rd ed.] . — Cambridge: Cambridge University Press, 2004. — 2000 p.
31. Ikehara S. A novel strategy for allogeneic stem cell transplantation: perfusion method plus intra-bone marrow injection of stem cells / Ikehara S. // Experimental Hematology. — 2003. — Vol. 31. — P. 1142—1146.
32. Immune recovery after bone marrow and peripheral blood stem cells transplantation / Marin G.H., Mendez M.C., Menna M.E. [et al.] // Transplantation Proceedings. — 1999. — Vol. 31. — P. 2582—2584.
33. Roccanova L. The role of stem cells in the evolution of longevity and its application to tissue therapy / Roccanova L., Ramphal P. // Tissue Cell. — 2003. — Vol. 35, № 1. — P. 79—81.
34. Rafii S. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration / Rafii S., Lyden D. // Nat Med. — 2003. — Vol. 9, № 6. — P. 702—712.
35. Yamanaka S. Strategies and new developments in the generation of patient-specific pluripotent stem cells / Yamanaka S. // Cell Stem Cell. — 2007. — Vol. 1. — P. 39—49.
36. Роль трансплантации стволовых гемопоэтических клеток в регенерации поврежденных тканей / Ватутин Н. Т., Гринь В. К., Калинкина Н. В. [и др.] // Укр. мед. часопис. — 2003. — № 3. — С.42—49.
37. Carlson B. Regeneration yesterday and today. Principles of regenerative biology / Carlson B. — London: Academic Press, 2007. — 379 p.
38. Dunbar C. E. Gene transfer to hematopoietic stem cells: implications for gene therapy of human disease / Dunbar C. E. // Annu. Rev. Med. — 1996. — Vol. 47. — P. 11—20.
39. Greenberger J. Gene therapy approaches for stem cell protection / Greenberger J. // Gene Therapy. — 2008. — Vol. 15. — P. 100—108.
40. Yannas I. V. Tissue and organ regeneration in adults. — New York: Springer—Verlag, Inc., 2001. — 402 p.
41. Orkin S. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology / Stuart H. Orkin, Leonard I. Zon // Cell. — 2008. — Vol. 132. — P. 631—644.
42. Репин В. С. Эмбриональные стволовые клетки: фундаментальная биология и медицина / Репин В. С., Ржанинова А. А., Шаменков Д. А. — Москва: Реметэкс, 2002. — 176 c.
43. Tetraploid embryonic stem cells contribute to the inner cell mass of mouse blastocysts / Pralong D., Lim M., Vassiliev I., Mrozik K. // Cloning and stem cells. — 2005. — Vol. 7, № 4. — P. 272—278.
44. A novel method for somatic cell nuclear transfer to mouse embryonic stem cells / Pralong D., Mrozik K., Occhiodoro F. [et al.] // Сloning and stem cells. — 2005. — Vol. 7, № 4. — P. 265—271.
45. Nuclear reprogramming - the experiment and mechanism / Chen D., Li F., Fang Z. [et al.] // Cell Res. — 2007. — Vol. 17, № 2. — Р. 135—150.
46. Maherali N. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells / Nimet Maherali, Konrad Hochedlin // Cell Stem Cell. — 2008. — Vol 3. — P. 595—605.
47. Бутенко Г. М. Современное состояние проблемы стволовых клеток / Бутенко Г. М. // Наука та наукознавство. — 2003. — №4. — C. 60—64.
48. Methods in enzymology, Vol. 365: Differentiation of embryonic stem cells / Ed. by Wassarman P., Keller G. — New York: Elsevier Inc., 2003. — 574 p.
49. Nakano T. Hematopoietic stem cells: generation and manipulation / Nakano T. // Trends in Immunology. — 2003. — Vol. 24, № 11. — P. 589—594.
50. Стромальные клетки, ответственные за перенос микроокружения в кроветворной и лимфоидной ткани / Фриденштейн А. Я., Чайлахян Р. К., Лациник Н. В. [и др.] // Пробл. гемат. перелив. крови. — 1973. — № 10. — С. 14—23.
51. Micklem H. Heterogenity and ageing of haematopoietic stem cells / Micklem H., Ross E. // Ann. Immunol. — 1978. — Vol. 129. — P. 367—376.
52. Ройт А. Иммунология / Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д.; пер с англ. В. И. Кандрора [и др.] — Москва: Мир. — 2000. — 592 с.
53. Harrison D. Effects of transplantation on the primitive immunohematopoietic stem cell / Harrison D., Stone M., Astle C. // J. Exp. Med. — 1990. — Vol. 172. — Р. 431—437.
54. Moore M. The role of cell migration in the ontogeny of the lymphoid system / Moore M. // Stem Cells and Devel. — 2004. — Vol. 13. — P. 1—21.
55. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications / Bianco P., Riminucci M., Gronthos S., Robey P. G. // Stem Cells. — 2001. — Vol. 19. — P. 180—192.
56. Vacek A. Proliferation activity and number of stromal (CFU-F) and haemopoietic (CFUS) stem cells in bone marrow and spleen of rats of different ages / Vacek A. // Acta Vet. — 2000. — Vol. 69. — P. 25—31.
57. Schroeder T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals / Schroeder T. // Nature 2008. — Vol. 453. — P. 345—351.
58. Shi Y. Stem cell research and therapeutics / Shi Y., Clegg D. O. — New York: Springer Science, 2008. — 336 p.
59. Shizuru J. Hematopoietic stem and progenitor cells: Clinical and preclinical regeneration of the hematolymphoid system / Shizuru J. A., Negrin R. S., Weissman I. L. // Annu. Rev. Med. — 2005. — Vol. 56. — P. 509—538.
60. Zandstra P. Stem cell bioengineering / Zandstra P., Nagy A. // Annu. Rev. Biomed. Eng. — 2001. — Vol. 3. — P. 275—305.
61. Effect of the nuclear—donor cell lineage, type, and cell donor on development of somatic cell / Batchelder C., Hoffert K., Bertolini M. [et al.] // Cloning and stem cells. — 2005. — Vol. 7, № 4. — P. 238—254.
62. Chapman A. Stem cell research and applications. Monitoring the frontiers of biomedical research / Chapman A., Frankel M., Garfinkel M. — New York: American Association for the Advancement of Science and Institute for Civil Society, 1999. — 51 p.
63. Marzilli A. Stem cell research and cloning / Marzilli A. — New York: Chelsea House, 2007. — 144 p.
64. Methods in molecular medicine, Vol. 18: Tissue engineering methods and protocols / Ed. by J. Morgan, M. Yarmush. — Totowa: Humana Press Inc., 2003. — 595 p.
65. Subpopulations of normal peripheral blood and bone marrow cells express a functional multidrug resistant phenotype / Drach D., Zhao S., Drach J. [et al.] // Blood. — 1992. — Vol. 80, № 11. — P. 2729—2734.
66. Stem cells / Ed. by Wobus A., Boheler K. — Berlin: Springer-Verlag, 2006. — 424 p.
67. Tosh D. How cells change their phenotype / Tosh D., Slack J. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. — 2002. — Vol. 3. — P. 187—194.
68. Weissman I. Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations / Weissman I., Anderson D., Gage F. // Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. — 2001. — Vol. 17. — P. 387—403
69. Characterization of murine CD34, a marker for hematopoietic progenitor and stem cells / Krause D. S., Ito T., Fackler M. J. [et al.] // Blood. — 1994. — Vol. 84, № 3. — P. 691—701.
70. Correlation of CD34 cell counts with volume of bone marrow collected for allogeneic bone marrow harvests / Shaughnessy P. J., Kissack B., Bickford D. J. [et al.] // Journal of Hematotherapy & Stem Cell Research. — 2000. — Vol. 9. — P. 891—894.
71. Transplantable hematopoietic stem cells in human fetal liver have a CD34+ side population (SP) phenotype / Uchida N., Fujisaki T., Eaves A. C., Eaves C. J. // J. Clin. Invest. — 2001. — Vol. 108. — P. 1071—1077.
72. Sato T. Reversible expression of CD34 by murine hematopoietic stem cells / Sato T., Laver J. H., Ogawa M. // Blood. — 1999. — Vol. 94, № 8. — P. 2548—2554.
73. Глузман Д. Ф. Современные представления о клеточных основах гемо- и лимфопоэза / Глузман Д. Ф., Скляренко Л. М., Надгорная В. А. // Здоровье Украины. — 2008. — № 2/1. — C. 55—57.
74. CD34 expression by murine hematopoietic stem cells mobilized by granulocyte colony-stimulating factor / Tajima F., Sato T., Laver J. H., Ogawa M. // Blood. — 2000. — Vol. 96. — P. 1989—1993.
75. Андреева Л. Ю. Субпопуляции периферических стволовых гемопоэтических клеток: характеристика фракции ранних стволовых клеток по экспрессии Thy-1 (CD 90)-антигена / Андреева Л. Ю., Тупицын Н. Н. // Клиническая геронтология. — 2005. — 10. — с. 44—47.
76. Human CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells express high levels of FLIP and are resistant to fas-mediated apoptosis / Kim H., Whartenby K. A., Georgantas R. W. [et al.] // Stem Cells. — 2002. — Vol. 20. — P. 174—182.
77. Expression of murine CD38 defines a population of long—term reconstituting hematopoietic stem cells / Randall T. D., Lund F. E., Howard M. C., Weissman I. L. // Blood. — 1996. — Vol. 87, № 10. — P. 4057—4067.
78. Hematopoietic recovery after transplantation CD117+b220-(lacz+) bone marrow cells in lethally irradiated mice / Hodek M., Vavrova J., Sinkorova Z. [et al.] // Acta Medica — 2008 — Vol. 51, № 1. — P. 37—41.
79. CD133-Positive hematopoietic stem cell "Stemness" genes contain many genes mutated or abnormally expressed in leukemia / Torena A., Bieloraia B., Jacob-Hirscha J. [et al.] // Stem Cells. — 2005. — Vol. 23, № 8. — P. 1142—1153.
80. Shortman K. Different subpopulations of developing thymocytes are associated with adherent (macrophage) or nonadherent (dendritic) thymic rosettes / Shortman K., Vremect D. // Developmental Immunology. — 1991. — Vol. 1. — P. 225—235.
81. Muench M. O. Isolation, growth and identification of colony-forming cells with erythroid, myeloid, dendritic cell and NK-cell potential from human fetal liver / Muench M. O., Suskind D. L., Barcena A. // Biol. Proced. Online. — 2002. — Vol. 4. — P. 10—23.
82. The marrow homing efficiency of murine hematopoietic stem cells remains constant during ontogeny / Szilvassy S. J., Ragland P. L., Miller C. L., Eaves C. J. // Exp. Hematol. — 2003. — Vol. 31. — P. 331—338.
83. Hematopoietic supportive functions of mouse bone marrow and fetal liver microenvironment: dissection of granulocyte, B-lymphocyte, and hematopoietic progenitor support at the stroma cell clone level / Friedrich C., Zausch E., Sugrue S. P., Gutierrez-Ramos J. // Blood. — 1996. — Vol. 87, № 11. — P. 4596—4606.
84. Li C. Murine hematopoietic stem and progenitor cells: enrichment and biologic characterization / Li C., Johnson G. // Blood. — 1995. — Vol. 85. — P. 1472—1479.
85. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice / Chena J., Ellisona F., Keyvanfara K. [et al.] // Experimental Hematology. — 2008. — Vol. 36. — P. 1236—1243.
86. Randall T. D. Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population? / Randall T. D., Weissman I. L. // Stem Cells. — 1998. — Vol. 16. — P. 38—48.
87. CD150 side-population cells represent a functionally distinct population of long-term hematopoietic stem cells / Weksberg D., Chambers S., Boles N., Goodell M. // Blood. — 2008. — Vol. 111, № 4. — P. 2444—2451.
88. Upregulation of Flt3 expression within the bone marrow Lin(-)Sca1(+)c-kit(+) stem cell compartment is accompanied by loss of self-renewal capacity / Adolfsson J., Borge O., Bryder D. [et al.] // Immunity. — 2001. — Vol. 15. — P. 659—669.
89. Identification of Lin-Sca1+kit+CD34+Flt3- short-term hematopoietic stem cells capable of rapidly reconstituting and rescuing myeloablated transplant recipients / Yang L., Bryder D., Adolfsson J. [et al.] // Blood. — 2005. — Vol. 105, № 7. — P. 1472—1479.
90. Luc S. Biological and molecular evidence for existence of lymphoid-primed multipotent progenitors / Luc S., Buza-Vidas N., Jacobsen S. E. // Ann. NY Acad. Sci. — 2007. — Vol. 1106. — P. 89—94.
91. Faubert A. Are genetic determinants of asymmetric stem cell division active in hematopoietic stem cells? / Faubert A., Lessard J., Sauvageau G. // Oncogene. — 2004. — Vol. 23. — P. 7247—7255.
92. Schroeder T. Asymmetric cell division in normal and malignant hematopoietic precursor cells / Schroeder T. // Cell Stem Cell. — 2007. — Vol. 1. — P. 479—481.
93. Zon L. I. Intrinsic and extrinsic control of haematopoietic stem-cell self-renewal / Zon L. I. // Nature. — 2008. — Vol. 453. — P. 306—313.
94. Boehm T. Thymus-homing precursors and the thymic microenvironment / Boehm T., Bleul C. C. // Trends in Immunology. — 2006. — Vol. 27, № 10. — P. 477—484.
95. Kraft D. L. Differentiation of CD3-4-8- human fetal thymocytes in vivo: characterization of a CD3-4+8- intermediate / Kraft D. L., Weissman I. L., Waller E. K. // J. Exp. Med. 1993. — Vol. 178. — P. 265—277.
96. Differentiation of CD3-4-8- thymocytes in short-term thymic stromal cell culture / Sen-Majumdar A., Lieberman M., Alpert S. [et al.] // J. Exp. Med. — 1992. — Vol. 176. — P. 543—551.
97. Age-related changes in the occurrence and characteristics of thymic CD4+CD25+ T cells in mice / Kozlowska E., Biernacka M., Ciechomska M., Drela N. // Immunology. — 2007. — Vol. 122. — P. 445—453.
98. Lineage relationships and developmental kinetics of immature thymocytes: CD3, CD4, and CD8 acquisition in vivo and in vitro / Petrie H. T., Hugo P., Scollay R., Shortman K. // J. Exp. Med. — 1990. — Vol. 172. — P. 1583—1588.
99. Commitment of immature CD4 thymocytes to the CD4 lineage requires CD3 signaling but does not require expression of clonotypic T cell receptor (TCR) chains / Suzuki H., Shinkai Y., Granger L. G. [et al.] // J. Exp. Med. — 1997 — Vol. 186, № 1. — P. 17—23.
100. Studies of CD4-CD8- alpha beta bone marrow T cells with suppressor activity / Palathumpat V., Dejbakhsh-Jones S., Holm B. [et al.] // The J. Immunol. — 1992. — Vol. 148, № 2. — P. 373—380.
101. Characterization of immature CD4+CD8-CD3- thymocytes / Hugo P., Waanders G., Boyd R. [et al.] // European Journal of Immunology. — 2005. —Vol. 21, № 3. — P. 835—838.
102. The proline-rich sequence of CD3e controls T-cell antigen receptor expression on and signaling potency in preselection CD4+CD8+ thymocytes / Mingueneau M., Sansoni A., Gregoire C. [et al.] // Nature Immunology. — 2008. — Vol. 9, № 5. — P. 522—532.
103. Almeida A. T cell homeostasis: thymus regeneration and peripheral T-cell restoration in mice with a reduced fraction of competent precursors / Almeida A., Borghans J., Freitas A. // J. Exp. Med. — 2001 — Vol. 194, № 5 — P. 591—599.
104. Egerton M. Kinetics of mature T-cell development in the thymus / Egerton M., Scollay R., Shortman K. // Proc. Nati. Acad. Sci. — 1990. — Vol. 87. — P. 2579—2582.
105. Thymic stem cells in mouse bone marrow / Antica M., Wu L., Shortman K., Scollay R. // Blood. — 1994. — Vol. 84. — P. 111—117.
106. Golunski E. Fetal liver and bone marrow JORO 75+ lymphocyte progenitors are precursors of CD4+8- TCR/CD3- early thymocytes / Golunski E., Palacios R. // J. Exp. Med. — 1994. — Vol. 179. — P. 721—725.
107. Age-dependent incidence, time course, and consequences of thymic renewal in adults / Hakim F., Memon S., Cepeda R. [et al.] // J. Clin. Invest. — 2005. — Vol. 115. — P. 930—939.
108. Linkage analysis of variations in CD4:CD8 T cell subsets between C57BL/6 and DBA/2 / Myrick C., DiGuisto R., DeWolfe J. [et al.] // Genes and Immunity — 2002 — Vol. 3 — P. 144—150.
109. Celso C. Stem cells remember their grade / Celso C., Scadden D. // Cell Stem Cell. — 2007. — Vol. 1. — P. 132—134.
110. Di Rosa F. The bone marrow: a nest for migratory memory T cells / Di Rosa F., Pabst R. // Trends in Immunology. — 2005. — Vol. 26 № 7. — P. 360—366.
111. T-lymphoid differentiation in human bone marrow / Klein F., Feldhahn N., Lee S. [et al.] // PNAS. — 2003. — Vol. 100, № 11. — P. 6747—6752.
112. Development of immature thymocytes: initiation of CD3, CD4, and CD8 acquisition parallels down-regulation of the interleukin 2 receptor chain / Petrie H. T., Pearse M., Scollay R., Shortman K. // European Journal of Immunology. — 1990. — Vol. 20, № 12. — P. 2813—2815.
113. Naujokat C. Concise review: role and function of the ubiquitin-proteasome system in mammalian stem and progenitor cells / Naujokat C., Saric T. // Stem Cells. — 2007. — Vol. 25. — P. 2408—2418.
114. Transplanted human bone marrow contributes to vascular endothelium / Jiang S., Walker L., Afentoulis M. [et al.] // PNAS. — 2004. — Vol. 101, № 48. — P. 16891—16896.
115. Манько В. М. Лимфоцитарный контроль дифференциовки кроветворных стволовых клеток. / Манько В. М. Петров Р. В. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. — 2006. — № 2. — С. 63—75.
116. Stem cell engraftment at the endosteal niche is specified by the calcium—sensing receptor / Adams G., Chabner K., Alley I. [et al.] // Nature. — 2006. — Vol. 439. — P. 599—603.
117. Baba Y. Relationships between hematopoietic stem cells and lymphocyte progenitors / Baba Y., Pelayo R., Kincade P. W. // Trends in Immunology. — 2004. — Vol. 25, № 12. — P. 645—650.
118. Suda T. Hematopoietic stem cells and their niche / Suda T., Arai F., Hirao A. // Trends in Immunology. — 2005. — Vol. 26, № 8. — P. 426—433.
119. Ballen K. Targeting the stem cell niche: squeezing blood from bones / Ballen K. // Bone Marrow Transplantation. — 2007. — Vol. 39. — Р. 655—660.
120. Osteopontin, a key component of the hematopoietic stem cell niche and regulator of primitive hematopoietic progenitor cells / Nilsson S., Johnston H., Whitty G. [et al.] // Blood. — 2005. — Vol. 106. — P. 1232—1239.
121. Osteopontin is a hematopoietic stem cell niche component that negatively regulates stem cell pool size / Stier S., Ko Y., Forkert R. [et al.] // J. Exp. Med. — 2005. — Vol. 201. — P. 1781—1791.
122. Taichman R. Human osteoblasts support human hematopoietic progenitor cells in vitro bone marrow cultures / Taichman R., Reilly M., Emerson S. // Blood. — 1996. — Vol. 87. — P. 518—524.
123. Haylock D. N. Hemopoietic stem cells with higher hemopoietic potential reside at the bone marrow endosteum / Haylock D. N., Williams B., Johnston H. // Stem Cells. — 2007. — Vol. 25. — P. 1062—1069.
124. Genetic regulation of hematopoietic stem cell exhaustion during development and growth / Yuan R., Astle C. M., Chen J., Harrison D. E. // Exp. Hematol. — 2005. — Vol. 33. — P. 243—