БИОЛОГО-ВИРУСОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ АНТИПРОТЕАЗНОЙ ТЕРАПИИ ГРИППА (экспериментальное исследование) : БІОЛОГО – ВІРУСОЛОГІЧНЕ ОБҐРУНТУВАННЯ АНТИПРОТЕАЗНОЇ ТЕРАПІЇ ГРИПУ

ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ

Бесплатное скачивание авторефератов
СКИДКА НА ДОСТАВКУ РАБОТ!
ВНИМАНИЕ АКЦИЯ! ДОСТАВКА ОТДЕЛЬНЫХ РАЗДЕЛОВ ДИССЕРТАЦИЙ!
Авторские отчисления 70%
Снижение цен на доставку работ 2002-2008 годов

 

ПОСЛЕДНИЕ ОТЗЫВЫ

Порядочные люди. Приятно работать. Хороший сайт.
Спасибо Сергей! Файлы получил. Отличная работа!!! Все быстро как всегда. Мне нравиться с Вами работать!!! Скоро снова буду обращаться.
Отличный сервис mydisser.com. Тут работают честные люди, быстро отвечают, и в случае ошибки, как это случилось со мной, возвращают деньги. В общем все четко и предельно просто. Если еще буду заказывать работы, то только на mydisser.com.
Мне рекомендовали этот сайт, теперь я также советую этот ресурс! Заказывала работу из каталога сайта, доставка осуществилась действительно оперативно, кроме того, ночью, менее чем через час после оплаты! Благодарю за честный профессионализм!
Здравствуйте! Благодарю за качественную и оперативную работу! Особенно поразило, что доставка работ из каталога сайта осуществляется даже в выходные дни. Рекомендую этот ресурс!



  • Название:
  • БИОЛОГО-ВИРУСОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ АНТИПРОТЕАЗНОЙ ТЕРАПИИ ГРИППА (экспериментальное исследование)
  • Альтернативное название:
  • БІОЛОГО – ВІРУСОЛОГІЧНЕ ОБҐРУНТУВАННЯ АНТИПРОТЕАЗНОЇ ТЕРАПІЇ ГРИПУ
  • Кол-во страниц:
  • 244
  • ВУЗ:
  • Одесский государственный медицинский университет
  • Год защиты:
  • 2009
  • Краткое описание:
  • Министерство здравоохранения Украины
    Одесский государственный медицинский университет
    На правах рукописи УДК 613.22:517.156:576.858/8.0947
    Дивоча Валентина Афанасьевна
    БИОЛОГО-ВИРУСОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ АНТИПРОТЕАЗНОЙ ТЕРАПИИ ГРИППА
    (экспериментальное исследование) 14.01.32-медицинская биохимия

    ДИССЕРТАЦИЯ
    на соискание ученой степени доктора медицинских наук
    Научный консультант Заслуженный деятель науки и техники Украины, доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедрой клинической и патологической физиологии ОГМУ ГОЖЕНКО Анатолий Иванович



    Одесса 2009








    Содержание

    ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 6
    ВВЕДЕНИЕ ...... 8
    РАЗДЕЛ 1. Обзор литературы и выбор направлений исследований . 18
    1.1. Клеточные компоненты, ассоциированные
    с вирусом гриппа 19
    1.2 Роль протеолитической системы клетки-хозяина
    в физиологии и на ранних стадиях развития
    вирусной инфекции ... 31
    РАЗДЕЛ 2. Материалы и методы исследований . 37
    2.1. Материалы исследования ... 37
    2.2. Методы исследования . 37
    2.2.1. Концентрирование и очистка вируса гриппа . 38
    2.2.2. Метод определения протеиназной активности . 38
    2.2.3. Очистка вируса гриппа на формалинизированных
    эритроцитах .. 40
    2.2.4. Изучение роли трипсиноподобных протеиназ
    при развитии вирусной инфекции у мышей .. 42
    2.2.5. Изучение влияния вируса на протеиназно-
    антипротеиназную активность . 43
    2.2.6. Метод определения ингибиторной активности .. 43
    2.2.7. Выделение и очистка трипсиноподобных протеиназ 45
    2.2.8. Получение меченых препаратов вирусов ... 47
    2.2.9. Очистка меченого вируса . 47
    2.2.10. Очистка и концентрирование меченого вируса
    на куриных эритроцитах . 48
    2.2.11. Электрофоретические методы исследования 48
    2.2.12. Электрофорез белков 51
    2.2.13. Выделение и очистка ингибитора трипсина
    из легких мышей 52
    2.2.14. Получение гипериммунных антипротеиназных
    сывороток . 53
    РАЗДЕЛ 3. Протеолитическая активность, ассоциированная
    с вирусом гриппа .. 54
    3.1. Изучение природы протеолитической активности, ассоциированной с вирусом гриппа . 54
    3.2. Изучение природы протеолитической активности
    ассоциированной с вирусом гриппа 71
    РАЗДЕЛ 4. Изучение динамики активности трипсиноподобной
    протеиназы и ее ингибиторов в процессе развития
    вируса гриппа А и В . 76
    4.1. Изучение протеиназной активности в динамике
    инфекционного процесса у мышей, зараженных
    вирусом гриппа А . 76
    4.2. Динамика изменения ингибиторов протеиназ в процессе
    развития вируса гриппа А 82
    4.3. Изменение протеиназной активности в легких и сыворотке
    крови мышей, зараженных вирусом гриппа В . 86
    4.4. Динамика изменения ингибиторов протеиназ в процессе
    развития вируса гриппа В 91
    4.5. Влияние различных доз вируса гриппа на динамику
    изменения протеиназной и ингибиторной активности в
    процессе размножения вируса гриппа в куриных эмбрионах... 96
    РАЗДЕЛ 5. Выделение и очистка трипсиноподобной протеиназы из
    легких здоровых и зараженных вирусом гриппа белых
    мышей . 102
    5.1. Выделение и очистка трипсиноподобной протеиназы и
    легких здоровых мышей 102
    5.2. Выделение и очистка трипсиноподобной протеиназы из
    легких белых мышей, зараженных вирусом гриппа А 107
    5.3. Определения оптимума pH изоформ трипсиноподобной протеиназы . 111
    5.4. Определение молекулярной массы изоформ
    трипсиноподобной протеиназы 114
    5.5. Влияние ингибиторов трипсина на протеолитическую
    активность изоформ трипсиноподобной протеиназы 116
    5.6. Изучение влияния изоформ трипсиноподобной протеиназы, выделеных из легких здоровых мышей, на размножение
    вируса гриппа в клетках МДСК и на его инфекционную
    активность ..... 118
    5.7. Изучение влияния изоформ трипсиноподобной протеиназы, выделенных из легких мышей, зараженных вирусом
    гриппа A/Aich, на размножение вируса гриппа в клетках
    МДСК и его инфекционную активность . 120
    5.8. Получение вируса гриппа с нерасщепленным
    гемагглютинином .. 123
    5.9. Изучение влияния изоформ протеазы на расщепление гемагглютинина вируса гриппа 128
    РАЗДЕЛ 6. Получение специфических гипериммунных
    антипротеазных сывороток к изоформам, выделенным
    из легких здоровых мышей . 135
    6.1. Действие антипротеазных сывороток, полученных из
    легких инфицированных животных .. 144
    РАЗДЕЛ 7. Выделение и очистка ингибиторов трипсиноподобных
    протеиназ 149
    7.1. Изучение действия ингибиторов протеаз на развитие
    вируса гриппа в куриных эмбрионах .. 154
    7.2. Действие клеточного ингибитора на выживание белых
    мышей, зараженных смертельной дозой вируса
    гриппа А 159
    7.3. Влияние иных ингибиторов трипсина на протеоличическую активность изоформ трипсиноподобной протеиназы . 161
    7.4. Влияние ингибиторов трипсина на выживаемость мышей, зараженных летальной дозой вируса гриппа ... 163
    РАЗДЕЛ 8. Наличие ингибиторов трипсиноподобных протеиназ в
    отходах при производстве гамма-глобулина из плазмы
    донорской крови .. 175
    РАЗДЕЛ 9. Обсуждение полученных результатов .. 179
    ВЫВОДЫ .. ... 197
    РЕКОМЕНДАЦИИ ... 202
    СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 204







    ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

    АКГТ - кортикотропил
    БАПНА - N-аргинин- пара-нитроанилид
    БСА -бычий сывороточный альбумин
    β-ЛПГ - β-липопротеин
    ВСЖ - вирусосодержащая жидкость
    ГА - гемагглютинирующая активность
    НА - гемагглютинин вируса гриппа
    HN - гликопротеид спайков вируса Сендай:нейраминидаза, гемагглютинин
    Да - дальтон
    ДЭАЭ целлюлоза - диэтил-амино-этил-целлюлоза
    ∆Е750 - разница оптической плотности белка между контрольной и опытной пробами
    ∆Е508 - разница оптической плотности продуктов гидролиза протеиназы между контрольной и опытной пробами
    ЭИД - эмбриональная инфекционная доза

    ИА - инфекционная активность

    ЛД50 - летальная доза
    МДСК - перевиваемая культура клеток из почки собаки

    мкг - микрограмм

    М (ММБВГ) - мембранный матриксный белок вируса гриппа

    НАЖ - нормальная аллантоисная жидкость
    НОЖ - надосадочная жидкость
    NXAO - нормальная хорионаллантоисная оболочка
    NA - нейраминидаза вируса гриппа
    NP - гликопротеид вируса гриппа
    NS - неструктурный белок вируса гриппа
    Овомукоид - ингибитор трипсина, выделенный из утиных яиц
    ПААГ - полиакриламидный гель
    п/з - после заражения
    ПОМК - пропиомеланокортин
    РНП - рибонуклеопротеид (внутренняя часть вируса)
    РДПА - реакция пассивной агглютинации с тканевыми
    антигенами
    РСК - реакция связывания комплемента
    РВИЭФ - реакция встречного иммунноэлектрофореза
    STE - буфер для очистки на формалинизированных
    эритроцитах
    Триэлин - ингибитор трипсина, выделенный из подчелюстных
    желез собаки
    ТХУ - трихлоруксусная кислота
    ТНЕ - буфер (ЭДТА, NaCl, ТРИС)
    Э-АКК - эпсилон-амино-капроновая кислота
    ХАЖ - хорионаллантоисная жидкость
    ХАО - хорионаллантоисные оболочки
    F - фактор слияния
    ЦПД - цитопатическое действие
    ЦЛР - центрифуга лабораторная рефрижераторная
    ЦВР - центрифуга вакуумная рефрижераторная









    ВВЕДЕНИЕ

    Актуальность темы. Грипп является одной из важнейших медико-социальных проблем в мире, при этом трудопотери на каждый случай гриппа составляют 6-14 дней, а материальный ущерб 272-544 гривни (50-100 долларов) [1, 2, 3]. Ежегодно гриппом болеет каждый шестой житель Украины [4, 5].
    Однако, по существующим оценкам, грипп, как непосредственная причина смерти, регистрируется лишь в 25% случаев [6, 7]. Это связано с тем, что причиной смерти при гриппе становятся осложнения или обострение фоновой патологии (заболевания сердечно-сосудистой, дыхательной, эндокринной систем) [8]. Указанные причины формируют скрытую смертность и недооценку смертности от гриппа в группах повышенного риска, к которым относятся грудные дети, пожилые люди, которые имеют хронические заболевания.
    На протяжении последних 30-40 лет в арсенале медработников для лечения гриппа были, в основном, ремантадин и его аналоги, противогриппозные вакцины, противогриппозный донорский иммуноглобулин, интерферон, оксолин [9, 10]. Однако, вследствие формирования резистентных штаммов вируса гриппа к ремантадину и его производным [11, 12], эти препараты оказались недостаточно эффективными как для лечения гриппа, так и для его профилактики [13, 14]. Используемые противогриппозные вакцины, в условиях постоянного изменения антигенного состава вируса гриппа, не позволяют полностью защитить население от гриппа [15].
    В настоящее время за рубежом прошли клинические испытания два принципиально новых препарата Занамивир /Relenza/ и Осельтамивир /Tamyflu/ [16,17,18]. Они являются ингибиторами нейраминидазы вируса гриппа, которые получены путем генной инженерии и кристаллографии [19, 20]. В свете сказанного актуальность поиска новых методов борьбы с гриппозной инфекцией не вызывает сомнений. К решению этой проблемы мы подходили на основе «протеолитической теории» действия вируса гриппа на организм человека и животных. В свою очередь, отсутствие исследований о механизме активации вируса гриппа протеиназами препятствует разработке антипротеазной терапии гриппа.
    Нарушение функций протеолитических ферментов и их регуляции лежит в основе многих патологических состояний. К их числу относятся нарушения сердечно-сосудистой деятельности, острые и хронические воспалительные процессы, онкологические и эндокринные заболевания, нервные и мышечные дистрофия, вирусные заболевания, психические и нервные расстройства. Установлено, что большинство вирусов человека и животных используют на этапах своего развития протеолитическую активацию, которая заключается в расщеплении белков-предшественников на функционально-активные группы. По этому действию протеиназ все вирусы американский ученый Брюс Корант в 1981 году условно разделил на две группы [21, 22]:
    1 группа ортомиксовирусы, парамиксовирусы, коронавирусы, ретровирусы и другие, активация которых проводится клеточными протеиназами;
    2 группа пикорнавирусы, альфавирусы, флавивирусы, комовирусы, потивирусы, тимовирусы и другие, которые продуцируют свои собственные протеиназы.
    Мы изучали на модели вируса гриппа, относящегося к первой группе вирусов, механизмы протеолитической активации вируса гриппа и роль этого механизма в развитии гриппозной инфекции, которые до настоящего времени не исследованы.
    В качестве обоснования нового подхода к терапии и профилактике гриппа нами предложена гипотеза о возможной блокировке фермента, отвечающего за расщепления гемагглютинина вируса гриппа на две субъединицы за счет специфических антител межклеточного пространства или за счет клеточных ингибиторов протеиназ.


    Связь работы с научными программами, планами и темами. Выбранное направление исследования осуществлялось в соответствии с планами научно-исследовательских работ (НИР) Центральной научно-исследовательской лаборатории (ЦНИЛ) Одесского государственного медицинского университета в 1992-2004 г.г. Фрагменты работы выполнялись в рамках следующих проектов:
    1. Изучение молекулярно-биологических механизмов направленного подавления клеточных трипсиноподобных протеиназ ассоциируемых с вирусом гриппа. ФК 91-74 МЗ Украины 1992-1994 г.г. (Научный руководитель и ответственный исполнитель вед. науч. сотр., к.б.н. В.А. Дивоча). Номер госрегистрации ГР UA011001962Р. Инв. № 0294U001653.
    2. Клеточные протеиназы мишень для создания противовирусных препаратов. ФК 1995-1998 г.г. (Научный руководитель и ответственный исполнитель вед. науч. сотр., к.б.н. В.А. Дивоча). Номер госрегистрации ГР 0195U0022683. Инв № 0298U001545.
    3. Ингибиторы протеиназ клеток в роли противовирусных факторов. ФК на 1999-2001 г.г. (Научный руководитель и ответственный исполнителей вед. науч. сотр., к.б.н. В.А. Дивоча). Номер госрегистрации ГР 0198U007840. Инв. № 0201U005941.
    4. Разработка биотехнологии получения противовирусного препарата из отходов гамма-глобулинового производства 2002-2004г.г. (Научный руководитель и ответственный исполнитель вед. науч. сотр., к.б.н. В.А. Дивоча). Номер госрегистрации ГР 0101U007760.
    Все темы финансировались Министерством здравоохранения Украины в рамках конкурсных научных программ в 1992-2004 г.г. Автор диссертации была ответственным исполнителем названных тем.


    Цель настоящей работы. Изучить состояние и роль антипротеиназных систем вируса и реципиента в развитии гриппозной инфекции для обоснования получения и использования принципиально новых лечебных препаратов на основе ингибиторов трипсиноподобных протеиназ.
    Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
    1. Изучить природу протеиназы, ассоциированной с вирусом гриппа.
    2. Изучить роль протеиназ и ингибиторов клетки-хозяина на разных, особенно ранних, стадиях развития гриппозной инфекции.
    3. Выделить и очистить изоформы трипсиноподобной протеиназы из легких здоровых и зараженных вирусом гриппа мышей .
    4.Изучить физико-химические свойства выделенных изоформ трипсиноподобной протеиназы.
    5. Изучить влияние изоформ трипсиноподобных протеиназ на расщепление гемагглютинина вируса гриппа.
    6. Получить специфические антитела к изоформам трипсиноподобной протеиназы и изучить защитное действие антител к ним на модели экспериментальной гриппозной инфекции.
    7. Выделить ингибитор трипсиноподобных протеиназ и изучить его защитное действие при заражении животных смертельными дозами вируса гриппа.
    Объекты исследования. Вирусы гриппа, трипсиноподобные протеиназы и их ингибиторы, куриные эмбрионы, легкие и кровь белых мышей и белых крыс, природные и синтетические ингибиторы трипсина, кровь человека.
    Предмет исследования. Выделение и максимальная очистка вируса гриппа от трипсиноподобных протеиназ. Выяснение роли трипсиноподобных протеиназ и их ингибиторов в процессе развития вируса гриппа и максимальная очистка их от клеточных компонентов. Выделение трипсиноподобных протеиназ и получение к ним специфических антител, которые блокировали бы развитие гриппозной инфекции у животных. Второе направление - это получение клеточного ингибитора, который блокировал бы собственную протеиназу, отвечающую за расщепление гемагглютинина вируса гриппа.
    Методы исследования. В работе использовали вирусологические, биохимические, иммунологические, молекулярно-биологические и радиоизотопные методы исследования.
    Так, механизм проникновения вирусов в клетку и роль при этом протеиназ и их ингибиторов были изучены путем использования радиоизотопных препаратов и определения активности протеиназ по гидролизу протамина.
    Очистка ферментов и их ингибитора проводилось методами ионообменной и афинной хроматографии, а очистка вируса градиентным ультраценрифугированием.
    Анализ белков ферментов и вирусных белков проводился с помощью электрофореза в ПААГ.
    Динамика инфекции изучалась с помощью метода определения инфекционной и гемагглютинирующей активности вируса, ингибиторов протеиназ по методу торможения гидролиза казеина кристаллическим трипсином.
    Научная новизна. Впервые выяснена роль клеточных трипсиноподобных протеиназ и их ингибиторов в динамике обнаружено взаимодействие вируса гриппа А и В с клеткой.
    Впервые выделены трипсиноподобные протеиназы из легких здоровых и инфицированных вирусом гриппа белых мышей и изучены их физико-химические свойства.
    Впервые найдена изоформа трипсиноподобной протеиназы, которая отвечает за расщепление белка - предшественника гемагглютинина вируса гриппа.
    Впервые изучена антиферментная система клетки, которая отвечает за блокировку расщепления гемагглютинина вируса гриппа на ранних стадиях взаимодействия вируса с клеткой.
    Впервые получены специфические антитела строго направленного действия против изоформ трипсиноподобной протеиназы, обладающие защитным действием против вирусной инфекции и рекомендованные нами для лечения гриппозной инфекции (защищено авторскими свидетельствами на изобретение).
    Впервые обоснован принципиально новый подход к иммунотерапии вирусных заболеваний путем блокировки фермента, который отвечает за расщепление гемагглютинина вируса гриппа (защищена авторским свидетельством на изобретение).
    Впервые выделен ингибитор трипсиноподобных протеиназ и установлено его блокирующее действие на гриппозную инфекцию (защищено авторским свидетельством на изобретение).
    Впервые установлено, что трипсиноподобная протеиназа, которая имеет клеточное происхождение, прочно ассоциирована с вирусом гриппа, что следует учитывать при изготовлении противогриппозных вакцин.
    Научно-практическая значимость работы. Выявлено, что с вирусом гриппа ассоциирована трипсиноподобная протеиназа клеточного происхождения и ее не возможно отделить при очистке и концентрации вируса гриппа методами ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы и электрофорезом в полиакриламидном геле, которые используются для приготовления противогрипп
  • Список литературы:
  • ВЫВОДЫ

    В работе теоретически обоснована и экспериментально подтверждена новая методология и методика антивирусной терапии гриппа.
    1. Очистка и концентрация вируса гриппа методами центрифугирования не освобождали вирус гриппа от белков с протеиназной активностью. Доочистка вируса гриппа в ступенчатом градиенте сахарозы показало, что в зоне 38-43% концентрации сахарозы локализовалось основное количество вируса гриппа и большая часть протеолитической активности. Первоначально ассоциированная с вирусом гриппа протеиназа в градиенте сахарозы разделяется на четыре изоформы, а протеиназа из нормальных хорионаллантоисных оболочек на три изоформы, которые в 345 раз были ниже, чем вирусиндуцированные.
    Элюция и адсорбция вируса гриппа на формалинизированных эритроцитах показали, что протеолитическая активность не связана с V- антигеном, а, скорее, связанная с РНП.
    Метод электрофореза в ПААГе вируса гриппа в невосстанавливающих условиях показал четкое разделение протеиназы на 7-9 фракций, которые имели высокую протеолитическую активность и разный электрический заряд. Похожий ферментный профиль в элюатах ПААГ был обнаружен и в нормальной аллантоисной жидкости, но ее протеолитическая активность была значительно ниже, и эта протеаза быстрее генерировалась.
    2. Протеиназа, ассоциируемая с вирусом гриппа, является клеточным ферментом, поскольку иммунные сыворотки к нормальным хорионаллантоисным оболочкам куриного эмбриона нейтрализовали протеиназу в зоне 35-45% сахарозы, где локализовался очищенный вирус гриппа, а гемаглютинирующая активность сохранялась.
    3. Уровень трипсиноподобной протеиназы и ингибитора в легких и сыворотке крови незараженных мышей и в хорионаллантоисной жидкости (2-х дневных) куриных эмбрионов находились в равновесии на достаточно высоком уровне и не поддавались значительным изменениям в течение всего периода наблюдения (6 суток). При заражении белых мышей вирусом гриппа А происходило нарушение ферментно-ингибиторного баланса. Самые глубокие изменения происходили в первые часы после заражения, снижение протеиназной активности в это время после заражения сопровождается увеличением ингибирующей протеиназу активности.
    4. При заражении куриных эмбрионов вирусом гриппа А в первые часы происходит увеличение как протеиназной, так и ингибирующей активности. В легких зараженных мышей и в куриных эмбрионах есть соответствие между накоплением инфекционного потомства и наступающим снижением протеиназной и ингибирующей активности. При заражении мышей вирусом гриппа В профиль протеиназной активности не был так резко выраженным в легких и имел отличия по сравнению с вирусом гриппа А. Схожими были только первые часы после заражения.
    5. Вирусиндуцированный клеточный ингибитор в первые часы после заражения играет важную роль в блокировке протеиназы. После его истощения главную роль в развитии инфекции берут на себя трипсиноподобные протеиназы, которые начинают расщеплять гемагглютинин, в связи с чем происходит рост инфекционного титра.
    6. Большие и малые заражающие дозы вируса гриппа А вызывают неодинаковые изменения протеиназной и ингибирующей активности. Большие дозы в период максимального накопления инфекционной и гемагглютинирующей активности полностью подавляют протеиназную и ингибирующую активность, малые дозы, повышают протеиназную и мало изменяют ингибирующую активности. Высота накопления инфекционного вируса не зависит от дозы вируса, но при малой дозе продлевается время накопления инфекционного потомства.
    Изучение динамики для выделения трипсиноподобной протеиназы из легких мышей, дает основание для вывода, что зараженных вирусом гриппа А/PR/8/34, нужно брать животных через 72 часа после заражения.
    7. Из легких незараженных мышей выделены шесть изоформ трипсиноподобной протеиназы, из зараженных вирусом гриппа восемь изоформ, которые имеют высокую протеолитическую активность. При изучении физико-химических свойств изоформ трипсиноподобных протеиназ установлено, что ингибиторы трипсина: триэлин, овомукоид, ингибитор из ячменя и Е-АКК не одинаково ингибируют протеиназную активность.
    Оптимальный рН изоформ, выделенных из легких незараженных мышей, находится в 7,0-8,0, тогда как рН изоформ, выделенных из зараженных легких, отклоняется в кислую сторону (4,0-5,0). При определении молекулярной массы изоформ клеточной трипсиноподобной протеиназы было установлено, что они не гомогенны и содержат низкомолекулярные белки; II и IV изоформы содержали по два белка, III и VI изоформы отличались только одним белком массой 31000 Да, который регистрировался в III изоформе. I, II и III изоформы, выделенные из зараженных легких, на электрофореграмме не выявлялись, а в IV, V и VI изоформах происходила замена белков с другой молекулярной массой.
    8. Установлено, что расщепление гемагглютинина вируса гриппа на две субъединицы происходит под воздействием VI изоформы трипсиноподобной протеиназы, выделенной из легких здоровых мышей (в наших условиях), а нарастание инфекционной активности происходит под действием III изоформы трипсиноподобной протеиназы, выделенной из легких здоровых мышей. Изоформы выделенные из легких мышей, зараженных вирусом гриппа А через 72 часа после заражения, не обладали способностью повышать инфекционный титр вируса.
    9. Антипротеиназные иммунные сыворотки к изоформам, выделенным из легких незараженных мышей, блокировали активность трипсина, и вирус гриппа не размножался в культуре клеток МДСК. In vivo обнаружено снижение летальности мышей на 60% только при действии антисывороток к III изоформе.
    10. Из легких здоровых мышей выделен ингибитор трипсиноподобных протеиназ с молекулярной массой 47500Да, который подавлял развитие инфекционной и гемагглютинирующей активности вируса гриппа на куриных эмбрионах, а также блокировал развитие гриппозной инфекции у белых мышей в общей дозе 0,126 мкг/мышь.
    11. Обоснованная нами новая методология антивирусной терапии гриппа поставила проблему поиска биоматериала, из которого можно получать антивирусный препарат. Таким сырьем, по нашим данным, могут быть промышленные отходы гамма-глобулинового производства.







    Рекомендации


    Результаты работы являются теоретической базой нового патогенетического направления в лечении гриппа на основе модуляции активности трипсиноподобных протеиназ.
    В лабораторных условиях получено противовирусное вещество -ингибитор трипсиноподобных протеиназ, который блокирует развитие гриппозной инфекции как в куриных эмбрионах, так и у белых мышей.
    На основе фундаментальных исследований разработаны подходы к получению нового противовирусного препарата для человека. Материалом могут служить отходы иммуно-глобулинового производства, так как, по нашим предварительным данным, они содержат большое количество ингибиторов трипсиноподобных протеиназ. Этот препарат может быть менее аллергенным и уменьшит финансовые расходы на его получение и лечение больных.







    Патенты
    1. Пат. 23548 А Україна, МПК6 А 61 К 35/00. Спосіб одержання інгібітору трипсіноподібних протеїназ / Дівоча В. А. ; заявник та патентодержатель Дівоча В. А. № 97052520; заява 30.05.97; опубл. 02.06.98, Бюл. № 4. 3 с.
    2. Дек. пат. 340884 А Україна, А 61 К 35/00. Спосіб визначення захисних можливостей організму в експерименті / Дівоча В. А. № 97052520; заява 30.05.97; опубл. 02.06.98. 3 с.
    3. Дек. пат. 34700 А Україна, МПК6 А 61 N 5/06, А 61 N 5/02. Спосіб лікування грипу в експерименті / Дівоча В. А. ; заявник та патентовласник Одеський державний медичний університет № 99042013; заява 09.04.99; опубл. 15.03.01; Бюл. № 2. 3 с.
    4. Дек. пат. 37324 А Україна, МПК6 А 61 К 31/14. Інгібітор трипсіноподібних протеїназ як антивірусний засіб / Дівоча В. А. ; заявник та патентодержатель Дівоча В. А. № 97115416; заява 12.11.97; опубл. 15.05.01; Бюл. № 4. 3 с.
    5. Пат. 215999 Україна, МПК (2006) А 61 К 36/00. Спосіб виділення інгібітору трипсиноподібних протеїназ із відходів одержання гаммаглобуліну иа альбуміну донорської крові людини / Дівоча В. А., Міхальчук В. М., Гоженко А. І.; заявник та патентодержатель Дівоча В. А., Міхальчук В. М., Гоженко А. І. - № u 2006 11233; заява 25.10.06; опубл. 15.03.07; Бюл. № 3. 4 с.







    Список использованных источников

    1. Проблема інфекційної захворюваності залишається актуальною проблемою системи охорони здоров'я та держави / О. О. Бобильова, С. П. Бережнов, Л. М. Мухарська [та ін.] // Сучасні інфекції. 2001. - № 1. - С. 4-10.
    2. Міроненко А. П. Стратегії та стадії контролю грипу / А. П. Міроненко, В. О. Мухопад // Інфекційні хвороби. - 2001. - № 2.- С. 55-58.
    3. Карпухин Г. И. Грипп / Карпухин Г. И. СПб. : Гиппократ, 2001.- 259 с.
    4. Возіанова Ж. І. Грипп / Ж. І. Возіанова, А. М. Печінка // Лікування та діагностика. 2002. - № 2. - С. 23-30.
    5. Карпухин Г. И. Диагностика, профилактика и лечение острых респираторных заболеваний / Г. И. Карпухин, О. Г. Карпухина. СПб. : Гиппократ, 2000. 180 с.
    6. Москалюк В. Д. Практичні підходи до лікування грипу та інших ГРВІ / В. Д. Москалюк // Інфекційні хвороби. - 2003. - № 2. - С. 100-103.
    7. Возианова Ж. И. Грипп / Ж. И. Возианова // Инфекционные и паразитарные болезни: в 3-х т. - К. : Здоров'я, 2000. - С. 60-95.
    8. Losben N. Reducing influenza risks: new treatment options / N. Losben, P. Peters, P. Drinka // Presented at the American Society of Consultant Pharmacists - Senior Care : Pharmacy ’99 Annual Meeting, November 10-13, 1999, st. Louis, U.S.A. : plenary session. Missouri, 1999. Р. 312-316.
    9. Спектр чувствительности к ремантадину вирусов группы А, циркулировавших в эпидемических сезонах 2002-2004 г.г. / Е. С. Шевченко, Е. И. Бурцева, А. Н. Слепушкин [и др.] // Вопросы вирусологии. 2005. Т. 50, № 5. С. 32-35.
    10. Жданов В. М. Нетрадиционная химиотерапия вирусных инфекций / В. М. Жданов // Вестник АМН СССР. - 1984. - № 8. - C. 5-9.
    11. Immunogenicity of a monovalent aluminum adjuvanted influenza whole virus vaccine for pandemic use / N. Hehme, H. Engelman, W. Kuenzel [et al.] // Virus res. 2004. Vol. 103. P. 163-171.
    12. Incidence of adamantаne resistance among influenza A (H3N2) virus isolated word-wide from 1994 to 2005; a case for concern / R. Brigth, M. Medina, X. Xu [et al.] // Lancet. 2005. Vol. 366. P. 1175-1181.
    13. Adamantane resistance among influenza A viruses isolated early during the 2005-2006 influenza season in the United States / R. Brigth, B. Schu, D. Shay [et al.] // J.A.M.A. 2006. Vol . 295. P. E1-E4.
    14. Гендон Ю. З. Преимущества и недостатки инактивированной и живой вакцин против гриппа / Ю. З. Гендон // Вопросы вирусологии. 2004. - № 4. С. 4-12.
    15. Гендон Ю. З. Вакцины и химиопрепараты для профилактики гриппа / Ю. З. Гендон // Вопросы вирусологии. 2007. - № 1. С. 4-10.
    16. Тетравакцина новый принципиальный подход к предотвращению пандемии гриппа / В. В. Онищенко, В. В. Зверев, А. В. Катлинский [и др.] // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2007. - № 4. С. 15-16.
    17. Hayden F. G. Neuraminidase inhibitors: assessment of limitations to greater therapeutic use / F. G. Hayden // Options for the Control of Influenza V/ Ed. Y. Kawaoka. - Amserdam, 2004. - Р. 29-37.
    18. Ferraris O. Sensitivity of influenza viruses to zanamivir and oseltamivir: study performed on viruses circulating in France prior the introduction of neuraminidase inhibitors in clinical practice / O. Ferraris, N. Kessler, B. Lina // Antivirical Res. 2005. V. 68. P. 43-48.
    19. Cass L. M. Pharmakinltics of Zanamivir after intravenous, oral, inhaled or intranasal administration to healthy volunteers / L. M. Cass, C. Efthymiopoulos, A. Byc // Clin. pharmacokinet. 1999. 36 supple 1. - Р. 1-11.
    20. Laurent Kaizer The role of neuraminidase inhibitors in influenza / Laurent Kaizer // Second international symposium on influenza and other respiratory viruses, Day 3, December 12-1999. USA, 1999. P. 123-127.
    21. Korant B. D. Design of inhibitor of viral function / B. D. Korant // J. Antiviral chemotherapy : Academic Press. - 1981. - № 1. Р. 37.
    22. Korant B. D. Proteolysis in virus infected cells / B. D. Korant // Biochem. Sos. Fran. - 1981. V. 9, № 2. Р. 90.
    23. Жирнов О. П. Модификация протеолитического процессинга вирусных белков как основа конструирования антивирусных вакцин / О. П. Жирнов // Сборник научных трудов. Ч. 1. - М., 1985. C. 61-66.
    24. Garten W. A. Inhibition of proteolytic activation of influenza virus hemagglutinin by specific peptides chloroalkye ketones / W. A. Garten, E. Shaw, P. Wikstrom, H. Klenk // Virology. - 1989. V. 172. - Р. 25-31.
    25. Viral Therapy: Prospects for protease inhibitors / B. D. Korant, Takae Towatary, Lucy Ivanoff [et al.] // J. of Cellular Biochemistry. 1986. V. 32. Р. 91-95.
    26. Korant B. D. Viral protein cleavages as a drug design target / B. D. Korant // Mechanism and Regulation of Intracellular Рrotein Сatabolism : Symposium to the 20th Meeting of FEBS, August 1990. 1990. Р. 26-29.
    27. Слепушкин А. Н. Всемирная программа ВОЗ по эпидемиологическому надзору и борьбе с гриппом / А. Н. Слепушкин // Вопросы вирусологии. 2003. - № 1. C. 46-48.
    28. Centers for Disease Control and Prevention of Influenza. Recommendations of Advisory comittee on Immunization Practices // Morb. Mortae Wkly Rep. - 2000. Р. 1-38.
    29. The impact of influenza epidemics on mortally introducing a severity index / L. Simonsen, M. J. Clarke, G. D. Williamson [et al.] // Am. J. Publ. Health. 1997. V. 87. Р. 1944-1950.
    30. Жирнов О. П. Новый подход к лечению гриппа: блокирование протеолитической активации / О. П. Жирнов, А. В. Овчаренко // Вопросы вирусологии. - 1983. - № 4. C. 83-89.
    31. Жирнов О. П. Феномен протеолитической активации микровирусов и новая стратегия лечения вирусных заболеваний / О. П. Жирнов // Вопросы вирусологии. - 1983. - № 4. C. 9-21.
    32. Защитное действие циклоферона при экспериментальной гриппозной инфекции / В. П. Сухинин, В. В. Зарубаев, В. Г. Платонов, А. Л. Коваленко [и др.] // Вопросы вирусологии. - 2000. - № 5. C. 96-30.
    33. Вотяков В. И. Современные проблемы химиотерапии вирусных инфекций в свете эволюционных взаимоотношений вируса и клетки / В. И. Вотяков, Н. В. Грибкова // Антивирусные вещества при экспериментальной терапии вирусных инфекций. Минск, 1986. C. 3-8.
    34. Скрипченко Г. С. Концепція боротьби з грипом в сучасних умовах на території України / Г. С. Скрипченко // Наукові та практичні аспекти боротьби з інфекціями в Україні на межі сторіччя : матеріали пленуму УНМТМЕП ім. Д. К. Заболотного, 7-9 червня 2000 р. К., 2000. C. 42-43.
    35. Ингибиторы протеолиза как перспективные антивирусные препараты / В. П. Лозицкий, А. С. Федчук, Ю. И. Гирля, Т. Л. Гридина // Наукові та практичні аспекти боротьби з інфекціями в Україні на межі сторіччя : матеріали пленуму УНМТМЕП ім. Д. К. Заболотного, 7-9 червня 2000 р. К., 2000. C. 61-62.
    36. Эффективность нового украинского препарата Амизона в профилактике и лечении гриппозной инфекции / А. Ф. Фролов, В. М. Фролов, Ю. Г. Пустовой [и др.] // Наукові та практичні аспекти боротьби з інфекціями в Україні на межі сторіччя : матеріали пленуму УНМТМЕП ім. Д. К. Заболотного, 7-9 червня 2000 р. К., 2000. C. 68-70.
    37. Кильбурн Э. Д. Вирусы гриппа и грипп / Э. Д. Кильбурн // Вирусы гриппа и грипп. М., 1978. C. 17-32.
    38. Жданов В. М. Почему так трудно победить грипп? / В. М. Жданов // Современные проблемы иммунотерапии. Семинар. М., 1983. - С. 7-23.
    39. Rott R. Molecular basis of infectivity and patogenicity of mixoviruses / R. Rott // Arch. Virol. 1979. V. 59. Р. 285-299.
    40. Шоппин Л. В. Структура вируса гриппа / Л. В. Шоппин, Р. В. Компанс // Вирусы гриппа и грипп. 1978. С. 33-74.
    41. Шолтиссек К. Репликация вируса гриппа / К. Шолтиссек, Х.-Д. Кленк // Вирусы гриппа и грипп. 1978. C. 252-280.
    42. Вебстер Р. Г. Антигенная изменчивость вируса гриппа / Р. Г. Вебстер, У. Г. Лейвер // Вирусы гриппа и грипп. 1978. C. 309-354.
    43. Lamb R. A. Mapping of the two overlapping genes for polypeptides NS1 and NS2 on RNA segments 8 of influenza virus genome / R. A. Lamb, P. W. Choppin, R. M. Chanoek // A Proc. Nat. Acad. Sci., USA. - 1980. - V. 77, № 4. - Р. 1857-1861.
    44. Жданов В. М. Семейство Orthomyxoviridae / В. М. Жданов, С. Я. Гайдамович // Частная вирусология : Руководство. М., 1982. - Т. 2. - С. 139-185.
    45. Ritchney M. B. Differences in protein patters of influenza A viruses / M. B. Ritchney, P. Paltsc, S. L. Schulman // Virologу. - 1977. - V. 76, № 1. Р. 122-128.
    46. Mapping of the influenza virus genome. II. Identification of the P1, P2 and P3 genes / Ritctxy, Palese, Pons, Р. Palese, M. B. Ritechey [et al.] // Virology. 1977. V. 76, № 1. - P. 114-121.
    47. Pons M. W. A reexamination of influeza signale and bouble stranded RN AS by gee electrophoresis / M. W. Pons // Virologу. - 1976. - V. 69, № 2. - Р. 789 792.
    48. Proteolysis activation of the influenza hemagglutinin: The structure of the cleavage site and the enzymes involved in cleavage / W. Garten, F. X. Bosch, D. Linder, R. Rotl [et al.] // Virology. 1981. V. 115. Р. 361-374.
    49. Жирнов О. П. Клеточно-зависимые и штаммовые вариации нуклеокапсидного белка Р2 (РА) вируса гриппа / О. П. Жирнов // Вопросы вирусологии. - 1987. - № 2. C. 164-167.
    50. Жирнов О. П. Две формы нуклеокапсидного белка (NP) вируса гриппа в вирионах и зараженных клетках / О. П. Жирнов // Вопросы вирусологии. - 1980. - № 5. C. 546-552.
    51. Рыбакова А. М. Включение антигенов клетки хозяина в структуру вирусов / А. М. Рыбакова, П. А. Косяков, Т. А. Посевая // Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии. Ч. 1. М., 1967. С. 150-151.
    52. Нarboе A. The influenza virus hemagglutination inhibition by antibody to host material / A. Нarboе // Acta path. Microbial. Scand. 1963. V. 57. Р. 317.
    53. Hankenes G. Influenza virus host antigen in chicken tissue / G. Hankenes. // Acta path. Microbiоl. Scand. 1967. V. 71, N 2. Р. 307.
    54. Бохневич Г. М. Влияние смены хозяина на некоторые биологические свойства вируса А2/Гонконг/68 / Г. М. Бохневич, Э. А. Фридман // Тр. ин-та Пастера. - Л., 1973. - Т. 42. - C. 12-16.
    55. Поляк Р. Я. Особенности свойств поверхностных компонентов вируса гриппа / Р. Я. Поляк, М. И. Ремизова, В. А. Орлов // Тр. ин-та им. Пастера.- Л., 1973. - Т. 42. - С. 17.
    56. Ровнова З. И. Значение антигенных компонентов хозяина в составе вируса гриппа для инфекции и иммунитета / З. И. Ровнова, П. Н. Косяков // Вопросы вирусологии. - 1967. - № 2. C. 146-150.
    57. Косяков П. Н. Антигенные компоненты хозяина в структуре вируса / П. Н. Косяков, З. И. Ровнова // Вопросы вирусологии. - 1965. - № 1. C. 17-23.
    58. Горбунова А. С. Выявление вирусного и хозяинного антигенов, содержащихся в аллантоисной культуре вируса гриппа, с помощью РПГА / А. С. Горбунова, А. И. Соколовых, В. А. Исаченко // Вопросы вирусологии. - 1966. - № 3. C. 318-322.
    59. Ровнова З. И. Исследование свойств антигенов хозяина в структуре микровирусов / З. И. Ровнова, П. Н. Косяков // Вопросы вирусологии. - 1966. - № 4. C. 413-417.
    60. Чепулис Г.- К. С. К вопросу о биологической роли компонентов хозяина в структуре парамиксовирусов / Г.- К. С. Чепулис, В. М. Жданов // Доклады Академии наук СССР. - М., 1967. - № 5. - C. 1157-1158.
    61. Чепулис Г.- К. С. Биологическая роль антигенов хозяина у миксовирусов / Г.-К. С. Чепулис, В. М. Жданов // Вопросы вирусологии. - 1968. - № 2. C. 151-162.
    62. Антигены хозяина в составе вируса гриппа / Т. А. Посевая, А. П. Старовойтова, П. Н. Косяков [и др.] // Вопросы вирусологии. - 1968. - № 6. C. 659-663.
    63. Выявление и идентификация антигенов клетки хозяина в составе вируса гриппа В / А. Л. Платонова, Т. А. Рогачева, Е. И. Исаева [и др.] // Вопросы вирусологии. - 1987. - № 2. C. 159-164.
    64. Фридман Э. А. Антигены хозяина в структуре вирусов гриппа / Э. А. Фридман, Г. М. Бохневич // Убитая гриппозная вакцина : тр. ин-та им. Пастера. Л., 1976. С. 163-173.
    65. Рыбакова А. М. Антигенные компоненты хозяина в структуре вирусов : автореф. дис. на соиск. уч. ст. канд. мед. наук. / А. М. Рыбакова. - М., 1969 16 с.
    66. Рыбакова А. М. Антигенные компоненты хозяина в составе вирусов миксогруппы / А. М. Рыбакова, Т. А. Посевая, П. Н. Косяков // Материалы науч. конф. института вирусологии им. Д. И. Ивановского АМН СССР. Вып. 7. - М., 1967. - С. 100-101.
    67. Рыбакова А. М. Включение антигенов клетки хозяина в структуру вирусов / А. М. Рыбакова, Т. А. Посевая, П. Н. Косяков // Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии. Ч. 1. - М., 1967. - С. 150-151.
    68. Поляк Р. Я. Взаимодействие вирус-хозяин: новые аспекты изучения молекулярных и клеточных механизмов патогенеза инфекции / Р. Я. Поляк // Стратегия возбудителя в организме хозяина : сб. науч. трудов. - Л., 1987. - С. 3-6.
    69. Четверикова Л. К. Теоретические и прикладные аспекты молекулярно-биологического анализа структуры вируса гриппа / Л. К. Четверикова, А. А. Смородинцев // Проблемы медицинской вирусологии : тр. ин-та им. Пастера. - Л., 1982. Т. 58 - С. 94-107.
    70. Дяченко С. С. Патогенные вирусы человека / Дяченко С. С., Синяк К. М., Дяченко Н. С. - К. : Здоровье, 1980. 448 с.
    71. Glycopeptides derived from viral glycoproteins after labeling with radioactive sugar / R. T. Schwarz, M. E. C. Schmidt, U. Anwer [et al.] // S. Virol. 1977. V. 23, № 2. - Р. 217-226.
    72. Laver W. G. Separation of two polypeptide chains from the hemagglution subunits of influenza virus / W. G. Laver // Virology. 1977. V. 45. Р. 275-280.
    73. Webster R. Q. Antigenic variations of influenza viruses / R. Q. Webster, W. Q. Zaver // The influenza viruses and influenza. (E. D. Kilbourneed). -Academic Ress. New-York, 1975. - Р. 209-314.
    74. Knight C. A. A sedimentable component of allantoic fluid and its relationship to influenza viruses / C. A. Knight // J. Exp. Med. 1944. Vol. 80. P. 83-99.
    75. Косяков П. Н. Актуальные проблемы вирусных инфекций / П. Н. Косяков, З. Н. Ровнова. М., 1965.- 430 с.
    76. Protease activity in purified anima viruses / Y. Y. Holland, M. Dayle, D. Perraultf, T. Kungsbury [et al.] // Biochem. and Biophys., Res. Comm. 1972. V. 46, № 2.
  • Стоимость доставки:
  • 150.00 грн


ПОИСК ДИССЕРТАЦИИ, АВТОРЕФЕРАТА ИЛИ СТАТЬИ


Доставка любой диссертации из России и Украины