КЛИНИКО-БИОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ УРОВНЯ АПОПТОЗА В ДИАГНОСТИКЕ УЗЛОВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ : КЛІНІКО-БІОХІМІЧНИЙ АНАЛІЗ РІВНЯ АПОПТОЗУ ТА ЙОГО РЕГУЛЯТОРІВ У ДІАГНОСТИЦІ ВУЗЛОВИХ ЗАХВОРЮВАНЬ ЩИТОПОДІБНОЇ ЗАЛОЗИ

Краткое описание

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ УКРАИНЫ
ЛУГАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

КОМАРЕВЦЕВА ЕКАТЕРИНА ВИТАЛЬЕВНА

УДК 616.441-006-089

КЛИНИКО-БИОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ УРОВНЯ АПОПТОЗА В ДИАГНОСТИКЕ УЗЛОВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

14.01.32- медицинская биохимия

Диссертация на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук

Научный руководитель
кандидат медицинских наук
А.С. ЛАРИН

Луганск-2009

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

Перечень условных обозначений

4

Введение

5

Глава 1.

1.1.

1.2.

1.3.
1.4.

Апоптоз и заболевания щитовидной железы (Обзор литературы)
Апоптоз, его регуляторы, промоторы и супрессоры
Индукторы рецептор-независимого апоптоза оксид азота и сфингомиелиновый каскад
Апоптотическая альтерация клеточного объема
Характеристика апоптоза при заболеваниях щитовидной железы

12

Глава 2.
2.1.

2.2.

2.3.
2.4.
2.5.

2.6.

2.7.

2.8.

2.9.

Материалы и методы исследования.
Клиническая характеристика больных узловыми заболеваниями щитовидной железы
Определение ДНК-фрагментации, активности пролиферации и маркеров апоптоза в резецированной ненодуллярной и нодуллярной ткани щитовидной железы
Хехст-типирование (Hoechst Staining Assay)
ДНК-электрофорез
Методика определения стабильных метаболитов оксида азота и сосудистого эндотелиального фактора роста в гомогенатах ткани щитовидной железы
Методика определения содержания свободного сфингозина в гомогенатах ткани щитовидной железы
Ядерно-магнитно-резонансная релаксация протонов тканевой воды биологических тканей и жидкостей
Ультразвуковая диагностика щитовидной железы
Магнитно-резонансная томография щитовидной железы

40
40

40

42
43
43

46

48

50

50

Глава 3.

Клинико-биохимический анализ апоптоза, его промоторов при узловых заболеваниях щитовидной железы

54

Глава 4.

Биохимические индукторы и супрессоры апоптоза: оксид азота, сосудистый эндотелиальный фактор роста и сфингомиелиновый каскад в генезе узловой тиреоидной патологии

88

Глава 5.

Роль альтерации клеточного объема в развитии апоптоза при узловых заболеваниях щитовидной железы (по данным МР-томографии и ЯМР-релаксометрии)

110

Глава 6.

Заключительное обсуждение результатов

124

Выводы

146

Практические рекомендации

150

Список использованной литературы

152

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
AVD апоптотическое уменьшение объема клетки
Bcl-2- онкопротеин
cNOS конститутивная NO-синтаза
FAS (CD95) трансмембранный белок, стимулирующий апоптоз
iNOS индуцибельная NO-синтаза
NO. оксид азота
NO2- - нитрит-анион
NO3- - нитрат-анион
NOS синтаза оксида азота
NOх суммарное содержание метаболитов оксида азота
ONOO- - пероксинитрит
PCNA - антиген ядер пролиферирующих клеток
RVD - регулирующий уменьшением объема клетки
RVI - регулирующий увеличением объема клетки
TNF-a фактор опухоли
VEGF - сосудистый эндотелиальный фактор роста
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
О2- - супероксид анион
ОС- окислительный стресс
ПКГ- программируемая клеточная гибель
ПКс протеинкиназа С
цГМФ (сGMP) циклический гуанидин-монофосфат
цАМФ (сАМР) циклический аденозин-монофосфат
СМ сфингомиелин
СФЗ сфингозин
Т1- спин-решеточная или продольная релаксация
Т2 спин-спиновая или поперечная релаксация
УЗИ ультразвуковое исследование
ЯМР ядерно-магнитный резонанс

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы.
Среди современных медико-социальных проблем одной из важнейших являются заболевания щитовидной железы. По данным ВОЗ на Земном шаре зарегистрировано около 300 миллионов больных зобом [ 1, 2 ]. Суммарная частота различных форм тиреопатий составляет не менее 20%, а в эндемичных по зобу областях эта цифра превышает 50% [ 3, 4 ].
Узловые образования щитовидной железы (ЩЖ) в клинической практике принято объединять в групповое понятие "узловой зоб" [ 5, 6 ]. Уточнение природы узлов, прежде всего, морфологическими методами, позволяет выделить в этой группе различные формы узлового коллоидного или паренхиматозного зоба (гипер-, гипо- или эутиреоидного), а также тиреоидиты, реже — опухоли и некоторые другие заболевания ЩЖ, которые могут сопровождаться формированием узлов в ее ткани [ 7, 8 ].
Рост числа больных в значительной степени происходит за счет узловых форм зоба и дифференцированного рака [ 9, 10 ]. Многие исследователи сообщают о 4 - 5 - кратном увеличении за последние годы числа больных с узловыми заболеваниями щитовидной железы [ 5, 11 ]. Всплеск заболеваемости, прежде всего, связан с вновь появившейся в нашей стране проблемой йодного дефицита [ 12, 13 ].
В Луганской области имеются мозаично расположенные йоддефицитные регионы ( частота зоба по данным УЗИ -12-15%) [ 14 ].
Узловой зоб представляет собой одно из наиболее часто диагностируемых изменений ЩЖ, которое может являться проявлением ее разнообразных заболеваний, что диктует необходимость ясного понимания этиологии, пато- и морфогенеза узловых образований ЩЖ [ 15, 16, 17 ].
В здоровом взрослом организме клеточный гомеостаз поддерживается за счет баланса между клеточной гибелью и пролиферацией [ 18, 19 ]. Установлено, что нарушение процесса клеточной гибели является важным звеном патогенеза многих заболеваний человека. Супрессия, гиперэкспрессия или мутации генов, контролирующих апоптоз, приводят к активации или ингибированию этого процесса [ 20, 21, 22 ].
Особое значение при изучении апоптоза в настоящее время придается возможностям использования в целях терапии ингибирования или активации этого вида клеточной гибели [ 23, 24 ]. Для заболеваний, связанных с замедлением апоптоза (опухоли), разрабатываются методы, способные ускорить этот процесс, а в случаях ускоренного апоптоза (пролиферативные процессы) ингибировать его. Идеальным решением проблемы была бы возможность модулировать уровень апоптоза.
Феномен апоптоза является результатом действия различных факторов, приводящих к гибели клетки. Поскольку апоптоз физиологическое явление, то в организме должны быть факторы, приводящие, как к апоптозу клетки, так и к его активации или подавлению [25 - 28 ].
Необходимым условием пролиферации является увеличение объема клетки, но в то же время это создает предпосылки для активации апоптоза [ 29, 30 ]. Объем регулирующие механизмы клетки запускаются множеством внутриклеточных сигнальных факторов, включая изменения потенциала мембраны клетки и внутриклеточного состава ионов, различные каскады вторичных посредников, фосфорилирование протеинов, и изменение экспрессии генов [ 31- 35 ].
Иначе говоря, уровень апоптоза в тканях, в данном случае, щитовидной железы вполне может служить диагностическим маркером узловых образований и прогностическим фактором их возможной малигнизации или рецидива, что определяет хирургическую стратегию в выборе объема оперативного вмешательства.
Связь работы с научными программами, планами, темами. Диссертационная работа выполнялась в рамках научной программы МОЗ Украины «Механизмы апоптоза в культурах клеток и репарационные процессы в тканях» (№ государственной регистрации 0107U001159), согласно плану научных работ Луганского государственного медицинского университета.
Цель работы: изучить биохимические признаки апоптоза, его маркеров и модуляторов в тканях щитовидной железы у больных узловыми заболеваниями щитовидной железы для разработки диагностического алгоритма очаговой тиреоидной патологии.
Задачи исследования:
1. Проанализировать структуру очаговой тиреоидной патологии: узлового зоба, многоузлового зоба, узловой формы хронического аутоиммунного тиреоидита Хашимото, рака щитовидной железы в сопоставлении с уровнем апоптоза по биохимической детекции ДНК-фрагментации, ДНК-электрофорезу, Хехст-типированию.
2. Исследовать генетические маркеры апоптоза (p53, bcl-2) и антиген ядер пролиферирующих клеток (PCNA) у больных узловыми заболеваниями щитовидной железы.
3. Изучить метаболизм оксида азота, экспрессию сосудистого эндотелиального фактора роста и сфингозина в резецированной ненодуллярной и нодуллярной ткани щитовидной железы у больных очаговой тиреоидной патологией.
4. Установить роль альтерации клеточного объема в развитии апоптоза при узловых заболеваниях щитовидной железы (по данным МР-томографии и ЯМР-релаксометрии).
5. Разработать диагностический алгоритм нозологических форм узловых заболеваний щитовидной железы по активности апоптоза, его маркеров, модуляторов и показателям ЯМР-релаксометрии.
Объект исследования: узловые заболевания щитовидной железы человека (узловой зоб, многоузловой зоб, узловая форма аутоиммунного тиреоидита Хашимото, рак щитовидной железы).
Предмет исследования: биохимические показатели апоптоза, его индукторов и модуляторов; факторы пролиферации и ангиогенеза узловой ткани.
Методы исследования: спектрофотометрический, электрофорез, иммуноферментный, дифференцированное центрифугирование, тонкослойная хроматография, ЯМР-релаксометрия, МР-томография, флуоресцентная микроскопия та статистические методы.
Научная новизна работы.
Впервые достоверно доказано, что очаговая патология щитовидной железы и неопухолевого, и опухолевого генеза с биохимической точки зрения характе­ризуется угнетением апоптоза в узлах на фоне повышенного уровня апоптоза в окружающей ткани щитовидной железы, что создает патогенетические предпосылки для рецидива и малигнизации в оставшейся после оперативного лечения ткани железы.
На обширном клиническом материале получены биохимические признаки измененного соотношения уровня апоптоза в пределах узел-окружающая ткань, коррелирующее с уровнем фрагментированной ДНК (количественные показатели, данные ДНК-фореза и Хехст-типирования).
Впервые изучена экспрессия промотора апоптоза р53 и его супрессора bcl-2 в нодуллярной и ненодуллярной ткани щитовидной железы. Установлено, что блокирование процесса апоптоза, происходящее на разных стадиях зобогенеза, приводит к снижению способности трансформированных клеток активировать программу клеточной гибели, что определяет прогрессию зобообразования, перспективу рецидива зоба и вероятность злокачественного перерождения.
Данные об экспрессии антигена ядер пролиферирующих клеток (PCNA) и сосудистого эндотелиального фактора у больных узловыми заболеваниями щитовидной железы доказали, что в генезе формирования узлового зоба щитовидной железы активная пролиферация тиреоидных фолликулярных клеток сопровождается васкуляризацией узла.
Впервые установлено, что нарушение баланса апоптоза и пролиферации, которое лежит в генезе формирования узла при узловой патологии щитовидной железы NO-опосредованное и реализуется через сфинголипидный сигнальный путь.
На основании данных ЯМР-релаксометрии получены достоверные результаты о том, что в условиях узловой трансформации тканей щитовидной железы клетки не способны к регуляции объема и подвергаются постоянному набуханию или сжатию. Такая дисрегуляция клеточного объема, является инициацией апоптотической смерти клетки. При этом, изменение клеточного объема в узлах и окружающей узел ткани обусловлено регуляторными механизмами, таким как метаболизмом оксида азота, экспрессией антигена ядер пролиферирующих клеток (PCNA), сосудистого эндотелиального фактора и тесно взаимосвязана со сфинголипидным сигнальным внутриклеточными путем.
Практическая значимость работы.
Методика детекции апоптоза по ДНК-фрагментации в ткани щитовидной железы доступна и воспроизводима, что делает возможность применение данного метода при тонкоигольной аспирационной биопсии у больных узловыми заболеваниями щитовидной железы в диагностико-прогностических целях и выборе хирургической стратегии. При этом, выявленные в работе показатели уровня ДНК-фрагментации в тканях щитовидной железы могут служить прогностическими маркерами в клинической оценке послеоперационного периода и профилактики рецидива и малигнизации узлового процесса.
Индекс соотношения ДНК-фрагментации в клетках узла и окружающей ткани является классификационным критерием нозологической принадлежности узлового процесса, что может рассматриваться не только как диагностический критерий, но и как надежный показатель прогнозирования рецидива.
Установленный спектр метаболитов оксида азота в нодуллярной и ненодуллярной ткани щитовидной железы является обоснованием для применения в терапии узловой патологии щитовидной железы блокаторов или предшественников их синтеза в зависимости от нозологии.
Выявленный нами при тиреотоксикозе высокий уровень апоптоза в окружающей узел ткани при всех нозологиях, дает возможность разработать новые подходы к коррегирующей тиреоидный статус терапии.
Высокий уровень экспрессии антигена ядер пролиферирующих клеток (PCNA) и сосудистого эндотелиального фактора у больных узловыми заболеваниями щитовидной железы относит больных с узловыми заболеваниями в группы риска на онкозаболевания, что является основанием для углубленного обследования больного на предмет выявления онкопроцесса. Более того, существующие современные методы таргетной терапии направлены именно на эти факторы роста, в связи с чем, полученные нами результаты позволяют разработать новые терапевтические подходы очаговых заболеваний щитовидной железы.
Разработанный методический подход, измерения времен протонной релаксации представляется перспективным для изучения структурного состояния воды в предоперационной диагностике in vitro при различных узловых патологиях щитовидной железы.
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа является самостоятельным научным исследованием. Автором проведен патентно-информационный поиск, сделан обзор литературы с обоснованием актуальности темы и необходимости этого научно-практического исследования, отработаны методы исследования. Самостоятельно проведены лабораторные исследования уровня апоптоза, его индукторов, супрессоров, показателей ЯМР-релаксации. Автором лично отобраны и обследованы все тематические больные, спланированы и проведены клинико-биохимические исследования. Соискатель непосредственно брала участие в операциях больных узловыми заболеваниями щитовидной железы, собирала операционный материал. Автор самостоятельно проанализировала полученные результаты, провела статистический анализ и интерпретацию полученных результатов, написал все разделы диссертации и сделал выводы.
Апробация результатов диссертации. Основные положения и результаты диссертации были доложены и обсуждены Международной конференции «Патофизиология и современная медицина» (г.Москва, 2004г.), 15-й Европейской конференции студентов-медиков и молодых ученых (г.Берлин, 2004г.), 5-м Международном конгрессе студентов-медиков (Польша, г.Катовицы, 2000г.), Всеукраинской конференции студентов-медиков (г.Одесса, 1999г.), 4-м Международном конгрессе студентов-медиков (Польша, г.Катовицы, 1998г.), заседаниях Восточного отделения Украинского Биохимического общества (г.Луганск, 2000г., 2004г., 2009г.), межкафедральных заседаниях сотрудников кафедры медицинской химии, хирургии и урологии, научно-исследовательского центра Луганского государственного медицинского института (г.Луганск, 2005г., 2008г., 2009г.).
Публикации. По результатам диссертационной работы опубликовано 13 научных работ. Среди них них: 7 статей в профильных изданиях (5 без соавторов), 6 тезисов докладов в материалах 6 научных конгрессов и конференций (5 в зарубежных).

Список литературы

ВЫВОДЫ

В диссертационной работе представлено новое решение научной проблемы, которая заключается в изучении биохимических признаков апоптоза, его маркеров и модуляторов в тканях щитовидной железы у больных узловыми заболеваниями щитовидной железы для разработки диагностического алгоритма очаговой тиреоидной патологии.

1. На обширном клиническом материале по данным биохимической детекции апоптоза (фрагментированной ДНК, ДНК-фореза) и Хехст-типированию получены признаки измененного соотношения уровня апоптоза в пределах узел-окружающая ткань у больных узловыми заболеваниями щитовидной железы. Минимальный уровень ДНК-фрагментации наблюдался в гомогенатах узлов полученных у больных раком щитовидной железы: рак щитовидной железы < хронический аутоиммунный тиреоидит < многоузловой эутиреоидный зоб < узловой эутиреоидный зоб. В окружающих тканях показатели ДНК-фрагментации имели другую направленность, при этом, показатели ДНК-фрагментации в гомогенатах окружающей ткани у больных хроническим аутоиммунным тиреоидитом и раком щитовидной железы превосходили таковые в других клинических группах в 1,5 раза: рак щитовидной железы > хронический аутоиммунный тиреоидит > многоузловой эутиреоидный зоб > узловой эутиреоидный зоб.
2. При тиреотоксикозе уровень апоптоза в окружающей ткани при всех нозологиях был значительно выше, чем в узле, что, связано с более высокой концентрацией йода в окружающей ткани, который стимулирует апоптоз через экспрессию р-53.
3. Угнетение апоптоза в узловой ткани больных раком щитовидной железы связано с высокой экспрессией bcl-2, которая блокировала экспрессию р-53 (соотношение р-53/bcl-2 = 0,01). У больных узловой формой хронического аутоиммунного тиреоидита Хашимото количество р-53-позитивных клеток почти равно количеству bcl-2-позитивных клеток (соотношение = 1), что является патогенетическим ответом на р-53-экспрессию. Экспрессия р-53 в тироцитах больных узловым и многоузловым зобом зобом также сопровождается экспрессией bcl-2. У больных многоузловым зобом соотношение р-53/bcl-2 = 0,9, т.е. высокая экспрессия р-53 адекватно контролируется bcl-2. А вот у больных узловым эутиреоидным зобом соотношение р-53/bcl-2 = 0,59, иначе говоря, экспрессия антиапоптозного гена bcl-2 преобладает над экспрессией проапоптозного гена р-53, что создает патогенетические предпосылки для рецидива и малигнизации в оставшейся после оперативного лечения ткани железы.
4. Показано, что экспрессия bcl-2 в тиреоцитах обеспечивает выживание активно пролиферирующим клеткам. Экспрессия антигена ядер пролиферирующих клеток (PCNA) в клетках резецированной нодуллярной ткани щитовидной железы у больных раком щитовидной железы была максимальной в нашей группе исследования, а индекс пролиферация/апоптоз 10. Активность пролиферации у больных многоузловым эутиреоидным зобом, судя по уровню экспрессии PCNA, была также высокой, но индекс пролиферация/апоптоз, при этом, был 2,87 (для сравнения, у больных узловым зобом 1,2). У больных хроническим аутоиммунным тиреоидитом в узлах пролиферация почти в 3 раза преобладала над апоптозом, т.е. узловая гиперплазия при очаговой патологии щитовидной железы обусловлены дисбалансом в процессах пролиферации и апоптоза в сторону уменьшения уровня апоптоза.
5. Установлен бифункциональный характер оксида азота в генезе узловой патологии щитовидной железы. Проапоптозное эффект NO оказался в узлах больных многоузловым зобом и рецидивом узлового зоба, а также в ненодуллярной ткани у больных хроническим аутоиммунным тиреоидитом и раком щитовидной железы. Антиапоптотическое действие NO выявлен в узлах рака щитовидной железы и узлового зоба. В узле больных хроническим аутоиммунным тиреоидитом и в окружающей узел ткани у больных узловым, многоузловым и рецидивом узлового зоба активация апоптоз носила NO-независимый характер.
6. Экспрессия сосудистого эндотелиального фактора имела место у больных раком щитовидной железы и в тканях узла, и в окружающей узел ткани, что отражает активный ангиогенез и пролиферацию в этих тканях. У больных узловым, многоузловым и рецидивом узлового зоба экспрессия сосудистого эндотелиального фактора наблюдалась только в узлах а у больных хроническим аутоиммунным тиреоидитом только в окружающей узел ткани.
7. Установлена активация сфингомиелинового метаболического пути с накоплением свободных сфингоидных оснований сфингозина - в условиях стимулированного апоптоза в узле больных многоузловым и рецидивом узлового зоба и у больных узлового, многоузлового, рецидива узлового зоба щитовидной железы, особенно у больных хроническим аутоиммунным тиреоидитом и раком щитовидной железы, в окружающей узел ткани.
8. Проапоптозный эффект NO в узлах больных многоузловым зобом и рецидивом узлового зоба, а также в ненодуллярной ткани у больных хроническим аутоиммунным тиреоидитом и раком щитовидной железы реализуется через сфингомиелиновый сигнальный путь. Антиапоптозное действие NO в узлах рака и узлового зоба щитовидной железы оказался сфингозин-независимым.
9. У больных узловыми заболеваниями щитовидной железы апоптоз и пролиферация оказались объем-зависимыми. В тканях узла у больных раком щитовидной железы и в окружающей узел ткани больных узловым, многоузловым, рецидивом узлового зоба щитовидной железы, хроническим аутоиммунным тиреоидитом выявлено ускорение ЯМР-показателей, что свидетельствует об увеличении клеточного объема. Уменьшение клеточного объема (укорочение продольной и поперечной ЯМР-релаксации) наблюдалось в узлах всех клинических групп наблюдения, кроме рака щитовидной железы. У больных раком щитовидной железы выявлено уменьшение клеточного объема в окружающей узел ткани.
10. У больных раком щитовидной железы увеличение клеточного объема в узловой ткани и уменьшение клеточного объема в окружающей узел ткани оказались NO-зависимыми. Противоположная картина была у больных неопухолевыми узловыми заболеваниями: NO-зависимая гидратация в окружающей узел ткани и NO-зависимая дегидратация в узле.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. При выполнении тонкоигольной аспирационной биопсии у больных узловыми заболеваниями щитовидной железы предлагаем применять дополнительно к стандартному протоколу обследования методику детекции ДНК-фрагментации в тканях щитовидной железы. При этом, выявленные в работе показатели уровня ДНК-фрагментации в тканях щитовидной железы могут служить прогностическими маркерами в клинической оценке послеоперационного периода и профилактики рецидива и малигнизации узлового процесса.
2. Индекс соотношения ДНК-фрагментации в клетках узла и окружающей ткани является классификационным критерием нозологической принадлежности узлового процесса, что может рассматриваться не только как диагностический критерий, но и как надежный показатель прогнозирования рецидива.
3. Установленный спектр метаболитов оксида азота в нодуллярной и ненодуллярной ткани щитовидной железы является обоснованием для применения в терапии узловой патологии щитовидной железы блокаторов или предшественников их синтеза в зависимости от нозологии.
4. Высокий уровень экспрессии антигена ядер пролиферирующих клеток (PCNA) и сосудистого эндотелиального фактора у больных узловыми заболеваниями щитовидной железы относит больных с узловыми заболеваниями в группы риска на онкозаболевания, что является основанием для углубленного обследования больного на предмет выявления онкопроцесса.
5. Выявленный нами при тиреотоксикозе высокий уровень апоптоза в окружающей узел ткани при всех нозологиях, дает возможность разработать новые подходы к коррегирующей тиреоидный статус терапии.
6. Измерения ЯМР-показателей протонной релаксации, которые дают быструю информацию о структурном состоянии тканевой воды и тем самым позволяют диагностировать онкопроцесс в тканях узла, следует внедрить в предоперационную диагностику in vitro при узловой патологи щитовидной железы.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Thyroid nodular disease: an emerging problem / [De Martino E., Pirola I, Gandossi E, Delbarba A, Cappelli C.] // Minerva Endocrinol. 2008. - Vol. 33. - № 1. P. 15-25.
2. Dal Maso L. Risk factors for thyroid cancer: an epidemiological review focused on nutritional factors / Dal Maso L., Bosetti C., La Vecchia C. // Cancer Causes Control. 2009. Vol. 20. - № 1. P. 75-86.
3. Kasagi K. Epidemiology of thyroid tumors: effect of environmental iodine intake / Kasagi K. // Nippon Rinsho.- 2007. - Vol. 65. - № 11. P. 1953-1958.
4. Zimmermann M.B. Iodine requirements and the risks and benefits of correcting iodine deficiency in populations / Zimmermann M.B. // J. Trace. Elem. Med. Biol. 2008. - Vol. 22. - № 2. P. 81-92.
5. Kameyama K. Pathology of benign thyroid tumor / Kameyama K., Ito K., Takami H. // Nippon Rinsho. 2007. - Vol. 65. - № 11. P. 1973-1978.
6. Klein M. Goiter and thyroid nodules / Klein M., Brunaud L. // Rev. Prat. 2008. - Vol. 58. - № 11. P. 1249-1259.
7. Uchino S.. Examination strategy for thyroid nodules / Uchino S., Noguchi S. // Nippon Rinsho. 2007. - Vol. 65. -№ 11. P. 2016-2020.
8. Leenhardt L. Management of thyroid nodule / Leenhardt L. // J. Radiol. - 2009. - Vol. 90. - № 3 Pt 2. P. 354-361.
9. Stöckli R. Subclinical thyroid disease / Stöckli R. // Praxis. 2007. - Vol. 96. - № 51-52. P. 2047-2050.
10. Reiners C. Malignant goiter - thyroid cancer / [Reiners C., Dietlein M., Luster M.] // Dtsch. Med. Wochenschr. 2008. - Vol. 133. - № 43. P. 2215-2228.
11. Moalem J. Treatment and prevention of recurrence of multinodular goiter: an evidence-based review of the literature / [Moalem J., Suh I., Duh Q.Y. ] // World J. Surg. 2008. - Vol. 32. - № 7. P. 1301-1312.
12. Kopp P. Pendred syndrome and iodide transport in the thyroid / [Kopp P., Pesce L., Solis-S J.C. ] // Trends Endocrinol. Metab. 2008. - Vol. 19. - № 7. P. 260-268.
13. Zimmermann M.B. Iodine deficiency / Zimmermann M.B. // Endocr. Rev. 2009. - Vol. 30. - № 4. P. 376-408.
14. Комаревцева Е.В. Апоптоз и узловые формы заболеваний щитовидной железы / Комаревцева Е.В. // Патофизиология и современная медицина: Сборник научных работ. Москва. - 2004. Вып. 2. С. 207-209.
15. Montone K.T. The thyroid Hürthle (oncocytic) cell and its associated pathologic conditions: a surgical pathology and cytopathology review / [Montone K.T., Baloch Z.W., LiVolsi V.A.] // Arch. Pathol. Lab. Med. 2008. - Vol. 132. - № 8. P. 1241-1250.
16. Intrathyroidal hematopoiesis: a rare histological finding in an otherwise healthy patient and review of the literature / [Westhoff C.C., Karakas E., Dietz C., Barth P.J. ] // Langenbecks Arch. Surg. 2008. - Vol. 393. - № 5. P. 745-749.
17. Fiore E. Papillary thyroid cancer, although strongly associated with lymphocytic infiltration on histology, is only weakly predicted by serum thyroid auto-antibodies in patients with nodular thyroid diseases / Fiore E., Rago T., Scutari M. // J. Endocrinol. Invest. 2009. - Vol. 32. - № 4. P. 344-351.
18. Nagata S. Apoptotic DNA fragmentation / Nagata S. // Exp.Cell Res.- 2000.- Vol. 256.- P. 12-18.
19. Cvejic D. Changes in the balance between proliferation and apoptosis during the progression of malignancy in thyroid tumours / Cvejic D., Selemetjev S., Savin S. // Eur. J. Histochem. 2009. - Vol. 53. - № 2. P. 65-72.
20. Белушкина Н.Н. Молекулярные основы апоптоза / Белушкина Н.Н., Хасан Хамад Али, Северин С.Е. // Вопросы биол. мед. и фарм.химии.-1998.- № 4.- С.15-23.
21. Белушкина Н.Н. Молекулярные основы патологии апоптоза / Белушкина Н.Н., Северин С.Е. // Архив патологии.- 2001.- № 1.- С.51-60.
22. Subramanian M. Knockdown of IG20 gene expression renders thyroid cancer cells susceptible to apoptosis / Subramanian M., Pilli T., Bhattacharya P. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2009. - Vol. 94. - № 4. P. 1467-1471.
23. Цыган В.Н. Роль апоптоза в патогенезе и лечении заболеваний / Цыган В.Н., Булавин Д.В., Марьянович А.Т. // В кн. Программированная клеточная гибель ( Под ред. В. С. Новикова ) С-Пб.: Наука. - 1996.- С.120-136.
24. Stojanović J. Role of apoptosis in pathogenesis of thyroiditis / Stojanović J., Srefanović D., Vulović D. // Med. Pregl. 2009. - Vol. 62. - № 1-2. P. 49-52.
25. Plotkin J.B. The Different Effects of Apoptosis and DNA Repair on Tumorigenesis / Plotkin J.B., Nowak M.A. // J. Theor. Biol.- 2002.- Vol. 214. - № 3. P. 453-467.
26. Комаревцев В.М. Визначення молекулярно-генетичних маркерів апоптозу в уротелії у хворих на рак сечового міхура/ [Комаревцев В.М., Рамі Мухам мед Салім Юсеф, Комаревцева К.В., Заїка О.В. ] // Лікарська справа.- 2007.- № 4.- С.25-27.
27. Molecular mechanisms of death-receptor-mediated apoptosis / Sartorius U., Schmitz I., Krammer P.H. // Chembiochem. Europ. J. Chem. Biol.- 2001.- Vol. 2. - № 1. P. 20-29.
28. Park S.Y. Hypoxia Inhibition of Apoptosis Induced by Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand (TRAIL) / Park S.Y., Biliar T.R., Seol D.W. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. Vol. 291.- № 1. P.150-153.
29. Gulbins E. Physiology of apoptosis / Gulbins E., Jekle A., Ferlinz K. // A.J.P.-Renal Physiology. 2000. - Vol. 279. - № 4. P. F605-F615
30. Bortner C. D. Apoptotic volume decrease and the incredible shrinking cell / Bortner C. D., Cidlowski J. A. // Cell Death and Differentiation. - 2002. - Vol. 9. - № 12. P. 1307-1310.
31. Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) in multinodular goiters: a possible pathogenetic factor/ [Maiorano E., Ambrosi A., Giorgino R. et al.] // Path. Res. Pract. 1994. Vol. 190. P.10121016.
32. Bortner C.D. Cell shrinkage and monovalent cation fluxes: role in apoptosis / Bortner C.D., Cidlowski J.A. // Arch. Biochem. Biophys. 2007. Vol. 462. - № 2. P. 176-188.
33. Lan L. Stem Cells Derived from Goiters in Adults Form Spheres in Response to Intense Growth Stimulation and Require Thyrotropin for Differentiation into Thyrocytes / Lan L., Cui D., Nowka K. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2007. - Vol. 92. № 9. P. 3681 - 3688.
34. Signaling pathways involved in the antiproliferative effect of molecular iodine in normal and tumoral breast cells: evidence that 6-iodolactone mediates apoptotic effects / [Arroyo-Helguera O., Rojas E., Delgado G., Aceves C.] // Endocr. Relat. Cancer. 2008. - Vol. 15. - № 4. P. 1003-1011.
35. Chiloeches A. Thyroid hormone-mediated activation of the ERK/dual specificity phosphatase 1 pathway augments the apoptosis of GH4C1 cells by down-regulating nuclear factor-kappaB activity / Chiloeches A., Sánchez-Pacheco A., Gil-Araujo B. // Mol. Endocrinol. 2008. - Vol. 22. - № 11. P. 2466-2480.
36. Кеrr J.F.R. Apoptosis: A basic bi­ological phenomenon with wide-ranging implications in tis­sue kinetics / Кеrr J.F.R., Wyllie A.H., Currie A.R. // Br. J. Cancer. 1972. Vol. 26. P. 239-257.
37. Searle J. Necrosis and apoptosis: Distinct modes of cell death with fundamentally different sig­nificance / Searle J., Kerr J.F., Bishop C.J. // Pathol. Annu. 1982. - Vol. 17. P 229-259.
38. Saikumar P. Apoptosis: Definition, mechanism and relevance to disease / Saikumar P., Dong Z., Mikhailov V. // Am. J. Med. 1999. Vol. 107. P. 489-506.
39. Jacobson M.D. Programmed cell death in animal development / Jacobson M.D., Weil M., Raff M.C. // Cell. - 1997. Vol. 88. P. 347-354.
40. Steller H. Mechanism and genes of cellular suicide / Steller H. // Sci­ence. 1995. - Vol. 267. P. 1445-1449.
41. Evan G. A matter of life and cell death / Evan G., Littlewood T. // Science. 1998. Vol. 281. P. 1317-1321.
42. Carson D.A. Apoptosis and disease /Carson D.A., Ribeiro J.M. // Lancet. 1993. Vol. 341. P. 1251-1254.
43. Thompson C.B. Apoptosis in the pathogenesis and treat­ment of disease / Thompson C.B. // Science. 1995. Vol. 267 . P. 1456-1462.
44. Mountz J.D. The role of programmed cell death as an emerging new concept for the pathogenesis of autoimmune disease / Mountz J.D., Zhou T., Su X. // Clin. Immunol. Immunopathol. 1996. Vol. 80. P. S2-S14.
45. Новиков B.C. Программированная клеточная гибель / Новиков B.C. - Санкт-Петербург: "Наука", 1996. 276с.
46. Белушкина Н.Н. Молекулярные основы апоптоза / Н.Н. Белушкина // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 1998. - № 4. С. 15-23.
47. Жижина Г.П. Роль апоптоза в нормальном онтогенезе, патогенезе и старении / Г.П. Жижина // Клиническая герантология. 2002. - №4. С. 10.
48. Фильченков А.А. Каспазы: регуляторы апоптоза и других клеточных функций / А.А. Фильченков // Биохимия. 2003. Т. 68. - №4. С. 453-466.
49. Москалева Е.Ю. Возможные механизмы адаптации клетки к повреждениям, индуцирующим программированную гибель. Связь с патологией / Е.Ю. Москалева, С.Е. Северин // Патологическая физиология. 2006. - № 2. С. 2-16.
50. Залесский В.Н. Апоптотический и аутотрофический пути гибели клетки при гипертрофии и ремоделировании миокарда (обзор литературы и собственных исследований) / Залесский В.Н., Стаднюк Л.А., Великая Н.В. // Журнал АМН України. 2003. - Т. 9. - №4. С. 699-712.
51. Thornberry N.A. Caspases: Enemies within / Thornberry N.A., Lazebnik Y. // Science. 1998. - Vol. 281. P. 1312-1316.
52. Ashkenazi A. Apoptosis control by death and decoy receptors / Ashkenazi A., Dixit V.M. // Curr. Opin. Cell Biol. 1999. Vol. 11. P. 255-260.
53. Nagata S. Apoptosis by death factor / Nagata S. // Cell. 1997. Vol. 88. P. 355-365.
54. Sheikh M.S. Death and decoy receptors and p53-mediated apoptosis / Sheikh M.S., Fornace A.J. // Leukemia. 2000. Vol. 14. P. 1509-1513.
55. Hengartner M. Death by crowd control / Hengartner M. // Science. 1998. Vol. 281. P. 1298-1299.
56. Leach A.P. Apoptosis: Molecular mechanism for physi­ologic cell death in health and disease / Leach A.P. // Clin. Lab. Sci. 1998. Vol. 11. P. 346— 349.
57. Vermes I. Molecu­lar biology of apoptosis and programmed cell death / Vermes I., Haanen C., Reutelingsperger C. // In: Aruoma O, Halliwell В (eds) Free radicals and molecular bi­ology of human diseases. Harwood Academic Publishers, Berkshire. 1998. - P. 225-286.
58. Tsujimoto Y. Role of Bcl-2 family of proteins in apop­tosis: apoptosomes or mitochondria? / Tsujimoto Y. // Genes Cell. 1998. Vol. 3. P. 697-707.
59. Taneja N. Irra­diation of mitochondria initiates apoptosis in a free cell sys­tem / Taneja N., Tjalkens R., Philbert M.A. // Oncogene. 2001. Vol. 20. P. 167-177.
60. Miyashita T. Tumor suppressor p53 is regulator of bcl-2 and bax gene expression in vitro and in vivo / Miyashita T., Krajewski S., Krawjewski M. // Oncogene. 1994. Vol. 9. P. 1799-1805.
61. Gottlieb R.A. Role of mitochondria in apoptosis / Gottlieb R.A. // Crit. Rev. Eukaryot/ Gene Exp. 2000. Vol. 10. P. 231-239.
62. Shi Y. A structural view of mitochondria-mediated apoptosis / Shi Y. // Nat. Struct. Biol. 2001. Vol. 8. P. 394-401.
63. Joza N. Essen­tial role of the mitochondrial apoptosis inducing factor in programmed cell death / Joza N., Susin S.A., Dangas E. // Nature. 2001. Vol. 41. P. 549—554.
64. Liu Y. p53 protein at the hub of cel­lular DNA response pathways though sequence-specific and non-sequence-specific DNA binding / Liu Y., Kulesz-Martin M. // Carcinogenesis. 2001. Vol. 22. P. 851-860.
65. Moll U.M. Nuclear and mitochondrial apop-totic pathways of p53 / Moll U.M., Zaika A. // FEBS Lett. 2001. Vol. 493. P. 65-69.
66. Hofmann J. Modulation of protein Kinase С in antitumor treatment / Hofmann J. // Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 2001. Vol. 142. P. 1—96.
67. Cell type specific involvement of death receptors and mitochondrial pathways in drug-induced apoptosis / [Fulda S., Meyer E., Friesen C. et al.] // Oncogene. 2001. - Vol. 20. P. 1063-1075.
68. Wu G.S. Apoptotic death of tumor cells correlates with chemosensitivity, independent of p53 or Bcl-2 / Wu G.S., El-Deiry W.S. // Clin. Cancer Res. 1996. - Vol. 2. P. 623-633.
69. Fisher D.E. Apoptosis in cancer therapy: Crossing the threshold / Fisher D.E. // Cell. 1994. - Vol. 78. P. 539-542.
70. Beroud C. p53 gene mutation: Software and database / Beroud C., Soussi T. // Nucleic Acid Res. 1998. - Vol. 26. P. 200-204.
71. Soussi T. The p53 tumor suppressor gene: from molec­ular biology to clinical investigation / Soussi T. // Ann. NY Acad. Sci. 2000. - Vol. 910. P. 121-139.
72. Topological control of p21 WAF1/CIP1 expression in normal and neoplastic tissue / [El-Deiry W.S., Tokino T., Waldman T. et al.] // Cancer Res. 1995. - Vol. 55. P. 2910-2919.
73. Levine A.J. p53, the cellular gatekeeper for growth and division / Levine A.J. // Cell. 1997. - Vol. 88. P. 323-331.
74. Harris C.C. Structure and function of the p53 tumor sup­pressor gene: Clues for rational cancer therapeutic strate­gies /Harris C.C. // J. Natl. Cancer Inst. 1996. - Vol. 88. P. 1442-1455.
75. Soussi T. The humoral response to the tumor-suppres­sor gene-product p53 in human cancer: implications for di­agnosis and therapy / Soussi T. // Immunol. Today. 1996. - Vol. 17. P. 354-356.
76. Lowe S.W. p53-Dependent apoptosis modulates the cytotoxicity of anticancer agents / Lowe S.W., Ruley H.E., Jacks T. // Cell. 1993. -Vol. 74. P. 957-968.
77. Lutzker S. A functionally inactive p53 pro­tein in embryonal carcinoma cells is activated by DNA dam­age or cellular differentiation / Lutzker S., Levine A.J. // Nat. Med. 1996. - Vol. 2. P. 804-810.
78. Kastan M.B. Participation of p53 protein in the cellular response to DNA damage / Kastan M.B., Onyekwere O. // Cancer Res. 1991. - Vol. 51. P. 6304-6311.
79. Lane D. p53, guardian of the genome / Lane D. // Nature. 1992. - Vol. 358. P.15-16.
80. Kuerbitz S.J. Wild-type p53 is a cell cycle checkpoint determinant following ir­radiation / Kuerbitz S.J., Plunkett B.S., Walsh W.V. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1992. - Vol. 89. P. 7491-7495.
81. Kaeilin W.G. The emerging p53 gene family / Kaeilin W.G. // J. Natl. Can­cer Inst. 1999. - Vol. 91. P. 594-598.
82. Dowell S.P. Clinical utility of the immunocytochemical detection of p53 protein in cytological specimens / Dowell S.P., Wilson P., Derias N.W. // Cancer Res. 1994. - Vol. 54. P. 2914-2918.
83. Cawley H.M. Anti-p53 antibodies in patients with Barrett's esophageal carcinoma can predate a diagnosis of cancer / Cawley H.M., Meltzer S.J. // Gastroenterology. 1998. - Vol. 115. P. 19-27.
84. Malkin D. Germ line p53 mutations in a familial syndrome of breast cancer, sarcomas and other neoplasms / Malkin D. // Science. 1990. - Vol. 250. P. 1233-1238.
85. Kim Y.-M. Nitric Oxide as a Bifunctional Regulator of Apoptosis / Kim Y.-M., Bombeck C. A., Billiar T.R. // Circulation Research. 1999. Vol.84. P. 253-256.
86. Nitric oxide-mediated apoptosis in murine peritoneal macrophages / [Albina J.E., Cui S., Mateo R. B., Reichner J.S.] // J.lImmuno . 1993. Vol. 150. P. 5080-5085.
87. Nitric oxide induced poly(ADP-ribose) polymerase cleavage in RAW 264.7 macrophage apoptosis is blocked by Bcl-2 / [Messmer, U. K, Reimer, D. M., Reed, J. C., Brune, B. ] // FEBS Lett. 1996. Vol. 384. P. 162-166.
88. Nitric oxide induces apoptosis in mouse thymocytes / [ Fehsel K., Kroncke K., Meyer K. et al.] // J. lmmunol. 1995. Vol. 155. P. 2858-2865.
89. A role for nitric oxide and other inflammatory mediators in cytokine-induced pancreatic beta-cell dysfunction and destruction / [McDaniel M.L., Corbett J.A, Kwon G., Hill, J.R. ] // Adv. Exp. Med. Biol. 1997. Vol. 426. P. 313-319.
90. Induction of nitric oxide synthase and nitric oxide-media