Вологин, Семен Германович. Диагностика Y-вируса картофеля и штаммовый состав патогена в Среднем Поволжье : Вологін, Семен Германович. Діагностика Y-вірусу картоплі та штамовий склад патогену в Середньому Поволжі

Краткое описание

Вологин, Семен Германович. Диагностика Y-вируса картофеля и штаммовый состав патогена в Среднем Поволжье : диссертация ... кандидата биологических наук : 06.01.07 / Вологин Семен Германович; [Место защиты: Моск. с.-х. акад. им. К.А. Тимирязева].- Москва, 2013.- 138 с.: ил. РГБ ОД, 61 13-3/981

ТАТАРСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
На правах рукописи

04201365355
Вологин Семен Германович
ДИАГНОСТИКА Y-ВИРУСЛ КАРТОФЕЛЯ И ШТАММОВЫИ СОСТАВ ПАТОГЕНА В СРЕДНЕМ ПОВОЛЖЬЕ
06.01.07 - защита растений
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Научный руководитель д. с-х. н. Замалиева Ф.Ф.
Казань-2013

2
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1 Вирусные болезни картофеля 11
1.2 Характеристика вирусов картофеля 13

1.2.1 Х-вирус картофеля 14
1.2.2 М-вирус картофеля 15
1.2.3 Вирус скручивания листьев картофеля 16
1.2.4 Y-вирус картофеля 17
1.3 Диагностика вирусных патогенов 26
1.3.1 Визуальное выявление вирусов 26
1.3.2 Метод биологического тестирования 28
1.3.3 Электронная микроскопия 29
1.3.4 Иммунобиологические методы диагностики 30
1.3.5 Молекулярно-генетические методы исследования 33
ГЛАВА П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 36
2.1 Объект исследования 36
2.2 Учетные точки исследований 36
2.3 Способы разрушения растительного материала 37
2.4 Преаналитическая подготовка растительного материала 37
2.5 Условия выращивания растений в защищенном грунте 38
2.6 Идентификация штаммовой принадлежности YBK 38
2.7 Искусственное заражение растений картофеля и табака 40
2.8 Методика проведения ИФА 40
2.9 Перечень реактивов использовавшихся
при проведении ИФА 42
2.10 Методика проведения ОТ-ПЦР 42

І

з
2.11 Конструирование олигонуклеотидных праймеров и определение нуклеотидной последовательности ДНК 46
2.12 Математическая обработка результатов 47
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 48
3.1 Преаналитическая подготовка растительного материала для
проведения диагностических исследований 48
3.1.1 Анализ структуры листовых и клубневых проб
картофеля 48
3.1.2 Влияние состава биоматериала и условий температурного хранения 53
3.1.3 Влияние буферных соединений 58
3.1.4 Действие антисептических соединений 60
3.1.5 Алгоритм преаналитической подготовки
биоматериала 67
3.2 Мониторинг вирусных патогенов в условиях
открытого грунта 71
3.3 Диагностика вирусов в меристемных линиях картофеля 72
3.4 Биометрический анализ данных ИФА 77

3.4.1 Анализ неинфицированных образцов 77
3.4.2 Расчет величины порогового значения 77
3.4.3 Анализ У2ЭДГ-инфицированных образцов 79
3.5 Структура популяции YBK в Среднем Поволжье 86
3.5.1 Оценка частоты распространения серотипов вируса 86
3.5.2 Идентификация изолятов YBK 89
3.5.3 Идентификация возбудителя кольцевого некроза
клубней картофеля 92
3.5.4 Поиск сайтов рекомбинации в геноме изолятов YBK 100

4
3.5.5 Анализ нуклеотиднои последовательности СР-гена и
белка оболочки YBK 105
ВЫВОДЫ 112
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 114
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 115
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 137
ПРИЛОЖЕНИЕ 138

5
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Растения картофеля (Solarium tuberosum L.) в силу своих биологических особенностей подвержены инфицированию различными вирусами. В естественных условиях возделывания картофель поражается 37 видами вирусных патогенов [Salazar, 1996]. Y-eupyc картофеля (YBK) относится к роду Potyvirus семейства Potyviridae. Патоген широко распространен во всем мире и относится к числу наиболее вредоносных агентов поражающих картофель, а также других культурных представителей семейства пасленовых: томат, перец и табак. Согласно оценкам, инфицирование YBK приводит к снижению урожайности картофеля на 30-90% [Struik, Wiersema, 1999]. Основной путь передачи YBK связан со сложным пищевым поведением насекомых - крылатых тлей, осуществляющих неперсистентный перенос патогена. В инфицированных растениях картофеля вирус проникает в клубни, с помощью которых в условиях аграрного производства может распространяться на обширные территории. К причинам широкого распространения YBK в настоящее время относят: нарушение агротехнических приемов возделывания картофеля, использование зараженного семенного материала, а также несовершенство методов обнаружения патогена [Иванюк и др., 2005].
Область диагностики и идентификации вирусов является важным элементом в сфере защиты растений от болезней. Современные системы ведения семеноводства картофеля на оздоровленной безвирусной основе предусматривают применение диагностического контроля вирусного поражения на различных этапах семеноводческого процесса с целью своевременного удаления инфицированных партий посадочного материала из агропромышленного производства [Замалиева, 2009]. Также методы лабораторной диагностики применяются в ходе селекционного процесса при создании сортов картофеля устойчивых к YBK [Салихова и др., 2012].

6
В последние годы в России разработаны тест-системы для обнаружения вирусов картофеля, основанные на методах иммуноферментного анализа [Бобкова и др., 2003; Комаров и др., 2013], иммунохроматографического анализа [Вызова и др., 2009], полимеразной цепной реакции [Рязанцев, Завриев, 2009], а также гибридизации нуклеиновых кислот [Drygin et al, 2007]. Данные работы, в основном, посвящены аналитическому этапу исследований: разработке новых или усовершенствованию существующих протоколов проведения сложных биохимических реакций, лежащих в основе диагностики. При этом, остаются не достаточно исследованными аспекты, связанные с преаналитическим состоянием исследуемого биологического материала: условиями его обработки и хранения, а также особенностями накопления вирусных патогенов в различных растительных тканях. Несомненно, что все перечисленные факторы оказывают значительное влияние на результаты лабораторной диагностики. Кроме того, в настоящее время практически не уделяется внимание вопросам, связанным с постаналитическим этапом диагностических исследований фитопатогенов. Публикации на эту тему немногочисленны [Sutula et al, 1986; Козлов и др., 1993; Обручков, Васильев, 1993]. В тоже время, статистическая обработка данных вносит большой вклад в процесс интерпретации результатов лабораторной диагностики [Свежова и др., 2008].
В настоящее время большую значимость приобретает фитосанитарный мониторинг, предусматривающий оценку видового и штаммового состава вирусов растений. Известно, что YBK обладает сложной популяционной структурой. Описано несколько штаммов вируса [Smith, Dennis, 1940; De Bokx, Huttinga, 1981; BeczneretaL, 1984; Chrzanowska, 1987; Le Romancer et al., 1994; Blanco-Urgoiti et al., 1998; Chikh AH et al., 2008; Chikh Ali et al, 2010], индуцирующих образование различных симптомов на растениях картофеля, а также различающихся по серологическим и молекулярно-

7
генетическим свойствам. Наибольшую угрозу для агропромышленного производства представляют штаммы, индуцирующие некротическое поражение клубней картофеля, приводящие к значительному снижению их товарного вида и пищевой ценности [Вайдеманн и др., 1999; Иванюк и др., 2005]. Также серьезную опасность несут рекомбинантные формы YBK, характеризующиеся высокой эффективностью переноса с помощью насекомых [Verbeek et ah, 2010]. В результате быстрого распространения рекомбинантных штаммов, способных к индукции некрозообразования, многие сорта картофеля потеряли свою привлекательность для сельскохозяйственного производства [Basky, 2002].
В Средневолжском регионе России сосредоточены значительные площади посадок семенного и товарного картофеля. Кроме того, здесь функционирует ряд крупных селекционных и семеноводческих учреждений. В связи с этим, исследование аспектов связанных с лабораторной диагностикой и фитосанитарным мониторингом популяционного состава YBK на территории данного региона является актуальным.
Цель и задачи исследования. Целью работы явилось установление особенностей диагностического выявления YBK и штаммового состава патогена в Среднем Поволжье.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Усовершенствовать процесс подготовки растительного материала для диагностического обнаружения YBK.
2. Изучить уровень распространения YBK и других вирусных патогенов в растениях картофеля открытого грунта, а также в меристемных линиях in vitro.
3. Осуществить биометрический анализ данных ИФА, полученных при диагностике YBK.
4. Исследовать штаммовый состав вируса на территории Среднего Поволжья.

8
Научная новизна. Впервые установлен эффект повышения достоверности результатов лабораторной диагностики при использовании комплекса преаналитических факторов: однократного цикла замораживания-оттаивания разрушенной листовой ткани растений, а также внесения в состав листовых и клубневых проб картофеля мертиолята натрия и тиосалициловой кислоты. С помощью биометрического анализа выявлено существование взаимосвязи между результатами ИФА и процессом распространения патогена в вегетативных поколениях картофеля. Впервые на территории Среднего Поволжья обнаружена циркуляция штаммов YBff™ и YBB^'W индуцирующих развитие симптомов кольцевого некроза клубней картофеля. На территории европейской части России показано распространение изолятов YBK, обладающих рекомбинантной формой генома.
Практическая значимость работы. Полученные результаты могут быть применены в испытательных лабораториях системы Россельхознадзора и Россельхозцентра, а также в учреждениях, связанных с семеноводством и селекцией картофеля. Разработанный алгоритм преаналитической подготовки исследуемого материала используется в ГНУ ТатНИИСХ при диагностическом выявлении вирусов в системе семеноводства картофеля на оздоровленной основе.
Охарактеризованные изоляты YBK могут быть использованы в селекционных исследованиях при создании форм растений устойчивых к патогену, а также могут быть применены при создании диагностикумов и контрольной панели образцов, предназначенной для оценки качества работы диагностических тест-систем.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора. Работа проводилась в соответствие с темами 04.15.01 и 04.15.02 Программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению агропромышленного комплекса Российской

9
Федерации на период 2006-2010 и 2011-2015 гг. Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора, проводившихся на протяжении 2005-2013 гг. Положения выносимые на защиту.
1. Алгоритм пробоподготовки растительного материала, повышающий эффективность диагностических исследований методом ИФА.
2. Зависимость данных ИФА от продолжительности распространения YBK в ряду вегетативных поколений картофеля.
3. Структура патогена на территории Среднего Поволжья, представленная изолятами, проявляющими свойства штаммов YBK°, YBB?, YBF?m, YBBf'm и обладающими рекомбинантной формой генома.
Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на XI Международной школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2007), IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro» (Зеленоград, 2008), научно-практической конференции «Картофелеводство: результаты, инновации, практический опыт» (Москва, 2008), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы сельскохозяйственной науки и практики в современных условиях и пути их решения» (Казань, 2009), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Инновационные разработки молодых ученых - АПК России» (Казань, 2010), Международной научно-практической конференции «Состояние и перспективы научных исследований по картофелеводству, овощеводству и бахчеводству» (Алматы, 2011), III международного симпозиума «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2011), Международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Вклад молодых ученых в инновационное развитие АПК России» (Екатеринбург, 2012), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Проблемы и перспективы аграрной науки в России» (Саратов, 2012), Всероссийской научно-

10
практической конференции «Научное обеспечение агропромышленного комплекса России» (Казань, 2012), VI Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2012), I международного симпозиума «Молекулярные аспекты редокс-метаболизма растений» (Казань, 2013), научной конференции «Молекулярно-генетические подходы в таксономии и экологии» (Ростов-на-Дону, 2013), Всероссийской научной конференции с международным участием «Биотехнологии: наука и практика, инновации и бизнес» (Астрахань, 2013)
Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 20 научных работ, из них 2 статьи в ведущих рецензируемых изданиях.

Список литературы

ВЫВОДЫ
1. Применение усовершенствованного алгоритма преаналитической подготовки, включающего: а) внесение в состав разрушенного растительного материала 0,01 М тиосалициловой кислоты и 0,1 М Tris-HCl буфера, б) однократного цикла замораживания-оттаивания, в) удаления разрушенных растительных компонентов с помощью центрифугирования, позволило повысить уровень выявления YBK в листовых пробах на 6,6%, в клубневых этиолированных ростках на 9,8%, в биоматериале меристемных растений in vitro на 13,8%.
2. В условиях открытого грунта северной части Среднего Поволжья наибольшей частотой распространения характеризовался YBK, обнаруженный в 16,8% исследованных образцов. Другие патогены диагностировались реже: МВК - 1,9%, ХВК - 1,4% и ВСЯК - 0,05% изученных образцов.
3. Меристемные растения сортов и гибридов картофеля характеризовались различным количественным и видовым составом вирусных патогенов. Поражение меристемных линии сортов картофеля составило: YBK - 31,9%, МВК - 26,2%, ХВК - 9,7% и ВСЛК - 2,9%. Линии перспективных гибридов содержали МВК в 55,6%, а УВКв 15,3% исследованных случаев.
4. Результаты ИФА, отражающие уровень содержания YBK в биоматериале, характеризуются проявлениями асимметрии и эксцесса. Выявлен переход от одновершинной к двухвершинной форме вариационного ряда изучаемого признака, происходящий при распространении YBK в ряду вегетативных репродукций картофеля.

из
5. На территории Среднего Поволжья патоген представлен изолятами,
проявляющими свойства штаммов а также штаммов YBP?m и
YBB^'m, индуцирующих развитие кольцевого некроза клубней картофеля. У изолятов обнаружены сайты рекомбинационных переходов в генах PI, НС-Рго и VPg. Нуклеотидная последовательность СР-гена и аминокислотная последовательность белка оболочки соответствуют типичным штаммам патогена.