Баканович Юлія Віталіївна Синтез та дослідження пептидів, задіяних у транспорті наночастинок та біологічно активних сполук через ліпідні мембрани

Краткое описание

Баканович Юлія Віталіївна, старший лаборант, Інститут високих технологій, Київський національний університет імені Тараса Шевченка. Назва дисертації: «Синтез та дослідження пептидів, задіяних у транспорті наночастинок та біологічно активних сполук через ліпідні мембрани». Шифр та назва спеціальності 02.00.03 органічна хімія. Спецрада Д26.001.25 Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Інститут високих технологій
Київський національний університет імені Тараса Шевченка
Міністерство освіти і науки України
Київський національний університет імені Тараса Шевченка
Міністерство освіти і науки України
Кваліфікаційна наукова
праця на правах рукопису
БАКАНОВИЧ ЮЛІЯ ВІТАЛІЇВНА
УДК547.97+547.8+547-32+543.48+
577.152.27+535.343+543.062
ДИСЕРТАЦІЯ
Синтез та дослідження пептидів, задіяних у транспорті наночастинок та
біологічно активних сполук через ліпідні мембрани
02.00.03 – органічна хімія
Подається на здобуття наукового ступеня
кандидата хімічних наук
Дисертація містить результати власних досліджень. Використання ідей,
результатів і текстів інших авторів мають посилання на відповідне джерело
(підпис, ініціали та прізвище здобувача)
Науковий керівник:
КОМАРОВ ІГОР ВОЛОДИМИРОВИЧ
доктор хімічних наук, професор
Київ – 2021

ЗМІСТ
АНОТАЦІЯ…………………………………………...…………….. 2
ЗМІСТ……………………………………………………………….. 11
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ ТА ПОЗНАЧЕНЬ………… 13
ВСТУП………………………………………………………………. 17
РОЗДІЛ 1. СИНТЕЗ ПЕПТИДІВ ТА ЇХ ПОДАЛЬШЕ
ВИКОРИСТАННЯ У ТРАНСПОРТІ ВАНТАЖІВ ЧЕРЕЗ ЛІПІДНІ
МЕМБРАНИ………………………………………………………… 23
1.1 Твердофазний синтез пептидів (SPPS)……………………. 23
1.2 Клітинопроникні пептиди (CPPs)………………………….. 36
1.3 Механізми клітинного проникнення……………………… 38
1.4 Три стратегії поліпшення проникнення пептидів в клітини…. 39
1.5 Методи вимірювання клітинної проникності………. 46
РОЗДІЛ 2. ДОСЛІДЖЕННЯ БУДОВИ ПРИРОДНОГО
ТРАНСПОРТНОГО ПРОТЕЇНУ БІЛІТРАНСЛОКАЗИ ТА
МЕХАНІЗМУ ТРАНСПОРТУ БІЛІРУБІНУ ЗА ЙОГО УЧАСТЮ...
52
2.1 Літературна довідка……………………………….. 52
2.2 Синтез фрагменту ТМ4 протеїна білітранслокази та
визначення його 3D структури……………………….
54
2.3 Структурний аналіз та динамічні процеси сегмента TM4
всередині різних міцелярних середовищ……………………
58
РОЗДІЛ 3. ТРАНСПОРТ НАНОЧАСТИНОК, ОТРИМАНИХ З
КАРБІДУ КРЕМНІЮ В КЛІТИНИ ЗА ДОПОМОГОЮ
КЛІТИНОПРОНИКНИХ ПЕПТИДІВ SAP і SAP-E……….. 65
3.1 Літературна довідка………………………………... 65
3.2 Отримання кон'югатів з SiC-NPs та вивчення їх проникаючих
властивостей у клітини……………………….
69
12
РОЗДІЛ 4. ГІБРИДНІ ПЕПТИДОМІМЕТИКИ, ЩО МІСТЯТЬ
КЛІТИНОПРОНИКНИЙ, БІОЛОГІЧНО АКТИВНИЙ ТА
ФОТОЧУТЛИВИЙ ФРАГМЕНТИ…………………….. 73
4.1 Літературна довідка……………………….. 73
4.2 Вибір мішені та дизайн пептидоміметиків………….. 76
4.3 Розробка дизайну та синтез світлочутливих «степлених»
пептидів, здатних інгібувати взаємодію р53-MDM2………….
78
РОЗДІЛ 5. ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА……………... 93
Експериментальна частина до Розділу 2………………………. 93
Експериментальна частина до Розділу 3………………………. 94
Експериментальна частина до Розділу 4………………………. 98
ВИСНОВКИ……………………………………………………… 102
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ……………………….. 104
Додаток А.
13
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ
ДМСО/DMSO диметилсульфоксид
ДМФА/DMF диметилформамід
DMEM Dulbecco's Modified Eagle's medium
DTT дітіотрейтол
DIPEA діізопропілетиламін
PyBOP бензотріазол-1-іл-оксіекипіролідінофосфоній
гексафторфосфат
PS полістирол
PEG поліетиленгліколь
NMP N-метил-2-піролідон
ЯМР ядерний магнітний резонанс
DMAP 4-диметиламінопіридин (4-dimethylaminopyridine)
Fmoc флуоренілметилоксикарбонільна захисна група
Boc трет-бутоксикарбонільна захисна група
Pbf 2,2,4,6,7-пентаметилдигілробензофуран-5-сульфоніл
Trt тритільна захисна група
Ac ацетильна захисна група
DAE діарилетен
GCMS газова хроматографія з мас-спектрометричною детекцією
14
LC-MS рідинна хроматографія з мас-спектрометричною
детекцією
FTIR інфрачервона спектроскопія Фур'є-перетворення
TIS триізопропілсілан
DTT дітіотрейтол
ТФА/TFA трифлуороацетатна кислота (тrifluoroacetic acid)
PDB Банк даних білків (Protein Data Bank)
TFE трифлороетанол
SPPS твердофазний пептидний синтез
HEPES 4-(2-гідроксиетил)-1-піперазинетансульфонова кислота
SDS додецилсульфат натрію
DPC додецилфосфохолін
РНК/RNA Рибонуклеїнова кислота / Ribonucleic acid
mRNA матрична рибонуклеїнова кислота
cDNA комплементарна ДНК
PCR полімеразна ланцюгова реакція
Arg/R Аргінін
Gly/G Гліцин
Leu/L Лейцин
Tyr/Y Тирозин
Ser/S Серін
15
Glu/E Глутамінова кислота
Gln/Q Глутамін
Asp/D Аспарагінова кислота
Asn/N Аспаргін
Phe/F Фенілаланін
Ala/A Аланін
Lys/K Лізин
His/H Гістидин
Cys/C Цистеїн
Val/V
Валін
Pro/P Пролін
Trp/W Триптофан
Ile/I
Ізолейцин
Met/M
Метіонін
Thr/T Треонін
Orn Орнітин
HPLC Високоефективна рідинна хроматографія
16
MALDI Матрично-активована лазерна десорбція / іонізація
CD Circular dichroism (круговий дихроїзм)
BTL Білітранслоказа
PPI Protein–protein interaction (протеїн-протеїнова взаємодія)
CPP Cell-penetrating peptide (клітинно-проникний пептид)
QD Quantum dot (квантові точки)
NP Nanoparticle (наночастинки)
AFM Atomic Force Microscopy (Атомно-силова мікроскопія)
NOESY ядерна спектроскопія з ефектом Оверхаузера
17
ВСТУП
Актуальність теми.
Захист клітини від проникнення всередину неї чужорідних біомолекул
удосконалювався протягом мільярдів років еволюції. Подолання цього
захисту є складним завданням, проте давно було відомо, що деякі білки та
пептиди все ж здатні надходити всередину клітин. Відкриття все більшої
кількості внутрішньоклітинних мішеней лікарських засобів було поштовхом
до пошуку пептидів чи їх кон’югатів з малими біологічно активними
молекулами, здатними блокувати ці мішені, і разом з тим проникати до
цитозолю. Ще одним стимулом досліджень у цій галузі був пошук
ефективних методів візуалізації клітин та їх органел, що вимагало подолання
клітинних мембран агентами візуалізації і проникнення їх всередину клітин.
Фундаментальні роботи в цій сфері фокусуються на вивченні
механізмів клітинної проникності коротких, так званих клітинопроникних
пептидів (Cell-Penetrating Peptides, CPP). Перспективним є застосування СРР
для доставки вантажів всередину клітин, що важливо, насамперед, для
розробки нових лікарських засобів, ефективних по відношенню до
внутрішньоклітинних мішеней, та створення засобів візуалізації клітин та їх
компонентів. Незважаючи на відносну вивченість CPP-опосередкованого
транспорту, наразі невирішеною проблемою є створення кон’югатів
біологічно активних сполук та наночастинок з клітинопроникними
пептидами, придатних для використання як діагностичних так і лікарських
засобів. Однак, до цих пір відкритим і актуальним залишається питання, чи
існують загальні принципи покращення процесів транспорту вантажів за
допомогою СРР в клітини. Актуальним є також знаходження принципів
покращення клітинної проникності біологічно активних пептидів шляхом їх
хімічної модифікації. Вивченню цих принципів і присвячена дана робота.
18
Окрім використання пептидів як транспорту для біологічно активних
малих молекул та наночасток, актуальним є їх використання для
безпосередньої дії на мішені у якості лікарських засобів. Слід відмітити, що
довгий час прості пептиди мали дуже обмежене застосування як ліки, що
обумовлено їх нездатністю проникати у клітини, нестабільністю in vivo та
поганими фармакокінетичними властивостями. Проте останнім часом дуже
актуальними стало використання модифікованих пептидів –
«пептидомиметиків» як лікарських засобів, при чому важливими мішенями
для пептидомиметиків є взаємодії протеїн-протеїн, які вважалися
«невиліковними» для традиційних ліків на основі малих молекул. Для цього
було розроблено декілька методів, зокрема «степлення» пептиду, тобто
ковалентне з’єднання бічних ланцюгів амінокислот. Дана робота присвячена
синтезу нових «степлених» пептидів – інгібіторів взаємодії протеїнів
p53/MDM2, яка вважається важливою для лікування 50% онкозахворювань.
Введення фотоактивного фрагменту – «фотоперемикача» у степлений пептид
дозволяє здійснювати тонку настройку біологічних властивостей ліків на
основі пептидоміметиків, що зараз є дуже актуальним напрямком –
фотофармакологією. У даній роботі описаний степлений пептид з
диарилетеновим фотоперемикачем та досліджена різниця біологічних
властивостей різних фотоформ одержаних сполук, що є актуальним для
подальшої розробки «розумних» ліків для використання у фотодинамічній
терапії онкозахворювань.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота
виконувалась у межах досліджень, що проводились на кафедрі
супрамолекулярної хімії Інституту високих технологій Київського
національного університету імені Тараса Шевченка в рамках держбюджетних
тем №11БФ07-04П, 14БП07-02, 16БП07-04, 18БП07-01.
19
Мета і задачі дослідження. Метою роботи є дослідження
транспортних білків та клітинопроникних пептидів та розробка принципів їх
використання для транспорту неорганічних наночастинок та біологічно
активних пептидів всередину еукаріотичних клітин, що може
застосовуватися, відповідно, для візуалізації клітин методом флуоресцентної
мікроскопії та в медичній хімії, а також синтез і дослідження степлених
пептидів у якості інгібіторів взаємодії протеїнів p53/MDM2. Для досягнення
поставленої мети потрібно було вирішити наступні задачі:
- дослідити механізм функціонування природних транспортних
протеїнів на прикладі білітранслокази;
- вивчити ефективність транспорту флуоресцентних вуглецевих
наночастинок відомими клітинопроникними пептидами SAP і SAP-E та
вивчити залежності клітинної проникності від заряду пептидів і наночатинок;
- отримати степлені пептиди – аналоги відомих пептидів,
інгібіторів взаємодії p53/MDM2, що містять фоточутливий фрагмент
диарилетену для пошуку оптимальних, з точки зору фармакологічних
властивостей, структур;
- модифікувати отримані оптимальні інгібітори взаємодії
p53/MDM2 залишками аргініну для підвищення їх клітинної проникності.
Об’єкти дослідження – клітинопроникні та степлені пептиди,
трансмембранні протеїни, диарилетенові фотоперемикачі.
Предмет дослідження – транспортні білки та клітинопроникні
пептиди як ефективні транспортні протеїни біологічно активних сполук через
мембрани еукаріотичних клітин, синтез та фотохімічні перетворення
степлених пептидів на основі діарилетену.
Методи дослідження - органічний синтез, комп’ютерне молекулярне
моделювання, спектроскопія ЯМР, УФ-, ІЧ-спектроскопія, мас-
20
спектрометрія, елементний аналіз, високоефективна рідинна та флешхроматографія.
Наукова новизна одержаних результатів.
Експериментально підтверджено α-спіральну будову фрагменту ТМ4
протеїну BTL в міцелярному середовищі. Показано, що ТМ4 бере активну
участь у транспорті йонних органічних молекул через ліпідні мембрани.
Вперше запропоновано гіпотезу про те, що ТМ4, разом з іншими
трансмембранними сегментами, утворює зовнішню стінку каналу
білітранслокази і виступає важливим фактором стабілізації всього
трансмембранного каналу.
Встановлено, що проникаючі в клітини пептиди SAP і SAP-E є
ефективними інструментами для контрольованого флуоресцентного
маркування клітин за допомогою SiC-NP. Розроблено новий простий і
практичний підхід до маркування клітин, який не залежить від стану клітин,
тому може бути рекомендований для застосування біовізуалізаціі культур
живих клітин в дослідженнях по отриманню оптимальних пептидів, що
проникають в клітини-носії («узгоджені пари») для інших відомих типів
наночастинок.
Вперше розроблено дизайн та проведено синтез світлочутливих
«степлених» пептидів, здатних інгібувати взаємодію р53-MDM2. Показано,
що реакція макроциклізаціі лінійного попередника за допомогою «клік»-
реакції може бути використана для ефективного отримання фоточутливих
пептидів, здатних до фоторегуляції інгібування протеїн-протеїнової
взаємодії. Продемонстровано, що приєднання до отриманих біологічно
активних пептидів аргінінвмісних фрагментів може значно підвищити їх
клітинопроникність, а отже – біологічну активність по відношенню до живих
клітин.
Практичне значення одержаних результатів. Отримано результати,
21
що підтверджують активну участь ТМ4 у транспорті органічних молекул
через ліпідні мембрани; що є важливим результатом для розуміння на
механістичному рівні особливостей цього потенційного транспортера, і
відповідно, для дизайну потенційних кандидатів у лікарські засоби.
Розроблено простий і практичний підхід до маркування і
флуоресцентної візуалізації клітин, що не залежить від стану клітин, тому він
значно розширює можливості вивчення культур живих клітин в біологічних
дослідженнях.
Розроблено дизайн та проведено синтез світлочутливих «степлених»
пептидів, здатних інгібувати, у тому числі, у живих клітинах взаємодію р53-
MDM2. Встановлено закономірності їх застосування, що дозволить
стимулювати подальшу розробку модуляторів цієї протеїн-протеїнової
взаємодії, в якості можливих кандидатів у лікарські засоби для
фотофармакології.
Особистий внесок здобувача. Основний обсяг експериментальної
роботи, аналіз спектральних даних та доведення будови одержаних сполук
було здійснено особисто здобувачем. Постановку завдання дослідження,
систематизацію літературних даних, обговорення, узагальнення та
оформлення результатів проведено спільно з науковим керівником, д.х.н.,
Комаровим І.В.
Апробація результатів дисертації. Результати роботи представлені на
українських та міжнародних конференціях та симпозіумах: Poland
International Conference & Exhibition, June 22-25 2016, Poznan, Poland;
European congress on magnetic resonance Euromar, July 2-6 2017, Warsaw,
Poland; XХI Міжнародна конференція студентів, аспірантів та молодих
вчених «Сучасні проблеми хімії», 20–22 травня, 2020, Київ, Україна.
22
Публікації. За темою дисертації опубліковано 5 статей у міжнародних
фахових журналах, та 3 тези доповідей у збірках матеріалів міжнародних та
українських конференцій.
Структура і обсяг роботи. Дисертаційна робота складається з анотації,
вступу, літературного огляду (розділ 1), обговорення одержаних результатів
(розділ 2, 3, 4), експериментальної частини (розділ 5), висновків, переліку
використаних джерел (221 посилання). Зміст дисертації викладений на 131
сторінці машинописного тексту і містить 29 рисунка та 6 таблиць. Перший
розділ (літературний огляд) присвячений деяким аспектам синтезу пептидів
та їх подальшому використанні в транспорті вантажів через ліпідні
мембрани. В другому розділі розглядаються дослідження будови природного
транспортного протеїну білітранслокази. Предметом третього розділу є
дослідження транспорту наночастинок, отриманих з карбіду кремнію, за
допомогою клітинопроникних пептидів. В четвертому розділі описуються
підходи до синтезу гібридних пептидоміметиків, що містять
клітинопроникний, біологічно активний та фоточутливий фрагменти. П’ятий
розділ є експериментальною частиною роботи

Список литературы

ВИСНОВКИ
1. Синтезовано пептид, що відповідає сегменту TM4
білітранслокази та проведено дослідження його будови і поведінки у
модельних розчинах методом ЯМР та молекулярної динаміки.
Експериментально підтверджено наявність a-спіральної структури
фрагменту ТМ4 протеїну BTL в міцелярному середовищі. Отримані дані
дозволяють зробити висновок, що ТМ4 може брати активну участь у
транспорті органічних молекул через ліпідні мембрани; та, ймовірно,
утворює зовнішню стінку каналу BTL і виступає важливим фактором
стабілізації всього трансмембранного каналу.
2. Показано, що клітинопроникні пептиди SAP і SAP-E утворюють
нековалентні кон’югати з наночастинками, отриманими анодним травленням
з карбіду кремнію та здійснюють їх транспорт через мембрани. Такий
транспорт не залежить від стану клітин (проліферативний чи конфлюентний),
що значно розширює можливості використання отриманих кон’югатів для
візуалізації клітин.
3. Знайдено, що для ефективної інтерналізації наночастинок
клітинопроникними пептидами бажано використовувати «узгоджені пари», а
саме, заряд молекули пептиду має бути протилежним заряду поверхні
наночастинок.
4. Проведено дизайн та синтез фоточутливих пептидних інгібіторів
протеїн-протеїнової взаємодії р53-MDM2. Отримані інгібітори є
«степленими» пептидами, у яких лінкер містить диарилетеновий фрагмент.
Знайдені сполуки, які проявляють значну активність як інгібітори р53-MDM2
взаємодії у «відкритій» формі та понижену активність у «закритій» формі –
кандидати для подальшої оптимізації.
5. Методом рентгеноструктурного аналізу та розрахунковими
методами досліджено будову комплексу MDM2 з найактивнішим пептидним
103
інгібітором р53-MDM2 взаємодії. Показано, що цей інгібітор у «відкритій»
формі додатково зв’язується з MDM2 своїм диарилетеновим фрагментом, а у
«закритій» формі цей фрагмент не задіяний у взаємодії з білком. Отже,
диарилетеновий фрагмент не тільки забезпечує контроль біологічної
активності у синтезованих сполуках, а ще й може додатково зв’язуватися з
мішенню в одній із фотоформ, підвищуючи афінність до мішені і
ефективність фотоперемикання.
6. Один з найактивніших фотоконтрольованих інгібіторів р53-
MDM2 взаємодії був модифікований залишками аргініну з метою
підвищення його клітинопроникності. Отримано інгібітор, який
продемонстрував фотоконтрольовану активність у клітинному тесті, а отже,
може бути використаний для досліджень in vivo.