Селезнева Ирина Ивановна. Разработка и исследование термочувствительных биоматериалов на основе поли-N-изопропилакриламида

Краткое описание

Селезнева Ирина Ивановна. Разработка и исследование термочувствительных биоматериалов на основе поли-N-изопропилакриламида : Дис. ... канд. физ.-мат. наук : 03.00.02 : Пущино, 2004 140 c. РГБ ОД, 61:04-1/925

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК
ИНСТИТУТ ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОФИЗИКИ
На правах рукописи
Селезнева Ирина Ивановна
РАЗРАБОТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕРМОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ
БИОМАТЕРИАЛОВ НА ОСНОВЕ П О Л И-ІЧ-ИЗ О П РО П И Л АКРИ Л AM ИДА
03.00.02 - Биофизика
Диссертации на соискание ученой степени
кандидата физико-математических наук
Научные руководители: д.м.н., профессор Гаврилюк Б.К., к.ф.-м.н. Рочев Ю.А.
ПУЩИНО-2004
СОДЕРЖАНИЕ
Введение • 4
Глава I. Термочувствительные субстраты, модификация свойств поверхности для целей тканевой инженерии.
1.1. Природа кооперативных фазовых переходов, термочувствительность
полимеров и способы ее модификации. 11
1.2. Методы приготовления субстратов на основе поли-Г4-изопропилакриламида
и анализ физико-химических характеристик их поверхности. 21
1.3 Взаимодействие термочувствительных субстратов на основе поли-N-
изопропилакриламида с клетками и белками сыворотки. 27
Глава 2. Материалы и методы исследования.
2.1. Методы исследования фазовых переходов в растворах термочувствительных
полимеров и полимерных субстратах. 45
2.2. Методы формирования субстратов и исследования физико —химических
характеристик их поверхности. 50
2.3. Культура клеток: экспериментальные среды, методы культивирования, под¬
счета, определения адгезионной, пролиферативной активности и жизнеспо¬собности клеток. 57
Глава 3. Исследование кооперативных фазовых переходов в растворах термочувствительных полимеров и полимерных субстратах на основе сополимеров N-изопропилакриламида и N-третбутилакриламида.
3.1. Исследование объемных фазовых переходов в разбавленных растворах тер-мочувствительных полимеров методом спектрофотометрии. 60
3.2. Определение параметров фазового перехода методом микрокалориметрии,
выявление возможных механизмов модуляции термочувствительности в сополи¬мерах ПНИПА/НТБА. 65
3.3. Исследование объемных фазовых переходов в термочувствительных субстратах
ПНИПА/НТБА 75
з
Глава 4. Разработка техники приготовления полимерных субстратов ПНИ- ПА/НТБА и анализ физико-химических характеристик их поверхности.
4.1. Разработка техники приготовления полимерных субстратов ПНИПА/НТБА. 77
4.2. Исследование эластических свойств субстратов ПНИПА/НТБА. 82
4.3. Анализ химической композиции субстратов ПНИПА/НТБА 84
4.4. Исследование смачиваемости поверхности субстратов ПНИПА/НТБА. 90
Глава 5. Исследование взаимодействия термочувствительных субстратов ПНИПА/НТБА с клетками, оптимизация свойств субстратов для целей тка¬невой инженерии.
5.1. Исследование особенностей взаимодействия клеток с термочувствительными
субстратами ПНИПА/НТБА. 100
5.2, Разработка методики фотоиндуцируемого связывания полимеров, исследование
объемных фазовых переходов в субстратах ПНИПА/НТБА/ААБФ 113
5.3 Исследование особенностей взаимодействия клеток с термочувствительной поверхностью субстрата ПНИПА/НТБА/ААБФ. 118
Заключение 122
Выводы 124
Список работ, опубликованных по материалам диссертации 125
Список цитируемой литературы 126
Благодарности 139
Используемые в тексте сокращения
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время культуры клеток животных и человека находят все более ши-рокое применение в медицине и биотехнологии. Развитие клеточных технологий и тка-невой инженерии выдвигает ряд новых требований к материалам, формирующим суб-страт-подложку для культивирования субстратзависимых клеток млекопитающих, и составляющих основу имплантируемых тканевых конструкций. Данные материалы должны поддерживать адгезию, рост и сохранение функциональной активности клеток, обеспечивать иммобилизацию и направленную доставку факторов, управляющих фор-мированием тканей, быть нетоксичными и, по возможности, биодеградабельными.
Понимание механизма кооперативных взаимодействий в биополимерах, являю-щихся не только существенной составной частью, но и управляющей основой организ¬ма, явилось толчком к созданию так называемых ’’умных” или “восприимчивых” синте-тических полимерных материалов. Способность восприимчивых полимеров резко и об-ратимо реагировать на изменение внешних условий определяет их использование в ка-честве функциональных материалов в самых разных областях. Восприимчивые поли¬меры используют для направленной доставки лекарств, разделения макромолекул, им-мобилизации биокатализаторов и клеток и многого другого.
В 1990 году группой японских ученых был разработан субстрат для культивиро-вания клеток на основе поли-М-изопропилакриламида (ПНИПА), термочувствительно¬го полимера, несущего функциональные С=0 и N-H группы, характерные для молекул белков, и являющегося аналогом полилейцина по химическому составу. Поли-N- изопропилакриламид испытывает фазовый переход из нерастворимого в растворимое в воде состояние при температуре около 33°С, называемой нижней критической темпера-турой сольватации (НКТС). Из всех Н,Н-алкилпроизводных акриламида ПНИПА ха-рактеризуется наиболее резким набуханием/коллапсом при переходе температуры че¬рез критическую точку, что определяется уникальным балансом гидрофоб- но/гидрофильных взаимодействий в молекуле данного полимера (Вае et al., 1990). При температуре 37°С полимер находится в нерастворимом состоянии, что позволяет ис¬пользовать его в качестве твердого субстрата для культивирования клеток. Понижение температуры культивирования ниже НКТС вызывает гидратирование полимера и от¬крепление клеток от поверхности субстрата без применения протеолитических фермен¬тов и диссоциирующих агентов.
На основании анализа опубликованных работ можно отметить несколько основ¬ных преимуществ термочувствительных субстратов на основе ПНИПА перед традици-
онно используемым культуральньш пластиком. Культивирование на термочувстви¬тельной поверхности позволяет получать интактные культуры клеток и на протяжении многих пассажей поддерживать специфическую активность клеток (Okano et al, 1993). Гидрофильно/гидрофобные свойства поверхности ПНИПА позволяют управлять не только прикреплением/откреплением культур клеток, но и процессами сорб- ции/десорбции белков, при откреплении от субстрата клетки сохраняют функциональ¬ные белки, межклеточные контакты и синтезированный матрикс (Liu, Zhu 1999). Зави¬симое от температуры изменение адгезионных характеристик и набухания субстрата ПНИПА позволяет проводить позиционирование двух типов сокультивируемых клеток. (Ito et al., 1997) (Yamato et al., 2002). Данные характеристики субстрата ПНИПА подра¬зумевают широкие возможности его применения для культивирования специализиро¬ванных клеток, создания тканевых эквивалентов и проведения исследований в области клеточной биологии.
Однако, ряд недостатков, связанных в основном с существующими ныне метода¬ми формирования субстратов, ограничивают возможности широкого применения ПНИПА для нужд тканевой инженерии, медицины и биотехнологии. Основным недос¬татком применяемых в настоящее время методик приготовления субстратов ПНИПА является необходимость ковалентного связывания ПНИПА с поверхностью для обеспе¬чения устойчивой адгезии и роста культур клеток. Эта необходимость вызвана сильной* гидратацией линейных полимеров ПНИПА (Takezawa et al., 1990). В настоящее время для приготовления субстратов ПНИПА чаще всего используется метод полимеризации полимера при помощи электронного луча высокой энергии непосредственно на по¬верхности, предназначенной для культивирования клеток (Вае et al, 1990, Yamada et al., 1990). Низкая плотность покрытия, формируемого данным методом, ограничивает ди¬намические свойства субстратов и определяет существенное влияние свойств подложки на смачиваемость поверхности субстратов ПНИПА. К недостаткам данного метода; следует отнести также ряд ограничений на тип покрываемой поверхности, необходи¬мость проведения многократных промывок, для удаления непрореагировавших токсич¬ных для каеток мономеров, а также то, что аппаратура, используемая для формирова¬ния электронного луча высокой энергии, недоступна большинству исследователей, ра¬ботающих с культурами клеток.
Разработаны также методы фото индуцируемой полимеризации ПНИПА на по¬верхности полистирола (Chen et al., 98).(Ichimura, Komatsu, 1987) (Moghaddam, Matsuda, 1993) (Liang et al., 2000), однако данные методы также подразумевают проведение ряда промывок и стерилизацию поверхности перед использованием ПНИПА в качестве суб-
страта для культивирования клеток. Различие в методах синтеза, отсутствие контроля над степенью ковалентного связывания, неконтролируемое изменение шероховатости и смачиваемости поверхности привели к значительному расхождению данных, получае¬мых различными исследовательскими группами.
Таким образом, наряду с несомненными преимуществами субстрата ПНИПА при проведении разработок в области тканевой инженерии, биотехнологии и медицины, не-достатки, связанные с существующими технологиями формирования данных субстра¬тов, делают актуальной задачу разработки новых композиций и новых методов форми¬рования термочувствительных субстратов на основе ПНИПА.
Снижение гидратированности субстрата ПНИПА путем сополимеризации его с гидрофобным мономером является логичным способом повышения его адгезивных свойств. К настоящему времени путем сополимеризации НИПА с гидрофобными мо¬номерами создан целый ряд линейных полимеров, отличающийся по температурам фа¬зового перехода и степени его кооперативности (Takei et al., 1993) (Yoshida et al., 1994) . ( Liu, Zhu, 1999). Однако, большая часть работ, в которых исследуется влияние хими¬ческой композиции полимеров на параметры фазового перехода, проводится на линей¬ных полимерах, синтезированных стандартными химическими методами. Исследова¬ния клеточной активности, за редким исключением, проводят на термочувствительных субстратах, полимеризованных непосредственно на покрываемой поверхности. Разли- чиє в применяемых методах синтеза не позволяет корректно сравнить данные, полу¬ченные разными авторами, и выявить связь микро и макрохарактеристик субстратов, определяющих их взаимодействие с культурами клеток. Кроме того, вопросы о том, насколько однородной или неоднородной является структура сколапсировавшего по¬лимера, какие факторы отвечают за кооперативность фазового перехода, а также какова связь макропараметров с термодинамическими характеристиками системы остаются до сих пор открытыми вследствие недостатка экспериментальных данных.
Таким образом, существует настоятельная необходимость разработки - подхода,, который позволил бы провести параллельное исследование параметров фазового пере¬хода термочувствительных полимеров в растворах, физико-химических характеристик поверхности формируемых субстратов и особенностей взаимодействия с ними культур субстратзависимых клеток млекопитающих.
Наш подход к модификации свойств ПНИПА заключался в постепенном увели¬чении числа гидрофобных групп в полимере путем его сополимеризации с N-трет- бути л акриламидом (НТБА). Выбор НТБА определялся требованием минимального из¬менения химической структуры полимера ПНИПА, поскольку N-третбутилакриламид является наиболее гидрофобным мономером в ряду АА>ДМА>ЭА>ДЭА>ТБА (Liu, Zhu, 1999) и отличается от НИПА наличием одной дополнительной метальной группы.
Для обеспечения эффективности фотоиндуцируемого ковалентного связывания субстрата с поверхностью было предложено ввести в состав линейных полимеров мо-номерные звенья акриламидобензофенона, т.к. преобразование фенилазидогрупп про¬исходит гораздо быстрее и с большей эффективностью, чем реакции циклодимеризации хромофоров типа циннамолила, кумаролила и производных стилбена.
Цель данной работы заключалась в разработке на основе сополимеров N- изопропилакриламида (НИПА) и N-третбутилакриламида (НТБА) и акриламидобензо¬фенона (ААБФ) новых термочувствительных материалов, предназначенных для под¬держания роста субстратзависимых клеток, а также обеспечения бесферментного от¬крепления клеток от поверхности культивирования.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
1. Исследование особенностей фазовых переходов в растворах термочувствительных полимеров и термочувствительных субстратах ПНИПА/НТБА. Выявление возмож¬ных механизмов модуляции температуры и кооперативноста фазовых переходов сополимеров ПНИПА/НТБА в растворах и в пленочных субстратах.
2. Разработка техники приготовления полимерных субстратов ПНИПА/НТБА и про¬ведение анализа физико-химических характеристик их поверхности.
3. Исследование адгезии, роста и бесферментного открепления клеток от поверхности субстратов ПНИПА/НТБА. Определение оптимального композиционного состава субстрата ПНИПА/НТБА, обеспечивающего высокую адгезионную и пролифера¬тивную активность, а также эффективное бесферментное открепление клеток.
4. Разработка методики фотоиндуцируемого формирования полимерных сеток, опре¬деление влияния введенных в состав сополимера фотоиндуцируемых мономеров акриламидобензофенона (ААБФ) на термочувствительность формируемых суб¬стратов ПНИПА/НТБА/ААБФ и их взаимодействие с клетками.
Объектом нашего исследования; стали линейные сополимеры N- изопропилакриламида и N-третбутилакриламида с различным соотношением мономер¬ных звеньев, синтезированные на химическом факультете Дублинского Университета А.Гореловым и Т.Голубевой. Учитывая то, что данные полимеры не несут на поверхно¬сти электрического заряда и химическая структура в ряду сополимеров НИПА/НТБА меняется минимально, данные сополимеры мы рассматривали в качестве модельной системы для исследования влияния относительного количества гидрофобных групп на термочувствительность полимеров и их взаимодействие с субстратзависимыми клетка¬ми млекопитающих. Использование линейных полимеров ПНИПА/НТБА позволило предпринять комплексный подход к разработке новых термочувствительных биомате¬риалов: исследования кооперативных фазовых переходов в растворах термочувстви¬тельных полимеров и полимерных субстратах и определение физико-химических ха¬рактеристик поверхности сополимеров ПНИПА/НТБА с различным соотношением мо¬номеров были проведены параллельно с исследованием клеточной активности.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и ме¬тодов исследования, изложения собственного экспериментального материала, выводов и библиогафического списка использованной литературы.
В первой главе диссертации приведен анализ публикаций, посвященных термо-чувствительным субстратам. Рассмотрены механизмы кооперативного фазового пере¬хода в термочувствительных полимерах и методы модификации физико-химических свойств субстратов. Большое внимание уделено анализу существующих методов фор¬мирования субстратов на основе поли-Ы-изопропилакриламида и физико-химических характеристик их поверхности. Проведено рассмотрение особенностей взаимодействия клеток с поверхностью термочувствительных субстратов на основе ПНИПА, описаны возможные механизмы взаимодействия; клеток с термочувствительной поверхностью. Определены перспективы использования данных субстратов для целей тканевой инже¬нерии и биотехнологии.
Вторая глава включает описание применяемых в работе методов, материалов и оборудования. Исследование параметров фазового перехода в водных растворах поли¬меров проводились с использованием методов дифференциальной сканирующей мик-рокалориметрии и спектрофотометрии. Исследование объемных фазовых переходов в термочувствительных субстратах ПНИПА/НТБА проводили методом гравиметрии. Для контроля шероховатости полимерных субстратов использовался метод атомной силовой микроскопии. Метод инфракрасной Фурье-спектроскопии полного отражения был использован для недеструктивного анализа химической композиции полимерной пленки. Эксперименты по определению механических свойств поверхностей полимер¬ных пленок проводились методом наноиндентации. Определение краевых углов сма¬чивания проводилось путем анализа изображения капли, получаемого при помощи ви¬деокамеры. Ковалентное связывание субстратов проводили при облучении пленок УФ- лампой ДРТ-220. В исследованиях были также применены стандартные методы рабо¬ты с культурами клеток.
Третья глава данной работы посвящена изучению кооперативных фазовых пере¬ходов в растворах термочувствительных полимеров и полимерных субстратах ПНИ-
ПА/НТБА с различным соотношением мономерных звеньев. Описаны результаты, по-лученные при исследовании фазовых переходов в растворах термочувствительных со-полимеров ПНИПА/НТБА методами микрокалориметрии и спектрофотометрии, а так¬же исследование динамики набухания полимерных пленочных субстратов ПНИ- ПЛ/НТБА. '
Четвертая глава включает описание техники приготовления полимерных субстра¬тов ПНИПА/НТБА, описание факторов, определяющих шероховатость поверхности субстратов, а также результаты анализа физико-химических характеристик их поверх¬ности методами атомной силовой микроскопиии, ИК-спектроскопии, наноиндентации и определения краевых углов смачивания поверхности.
Пятая глава посвящена исследованию взаимодействия термочувствительных суб¬стратов ПНИПА/НТБА с клетками и оптимизации свойств субстрата для целей ткане¬вой инженерии. На данном этапе работы было проведено определение композиционно¬го состава субстрата ПНИПА/НТБА, обеспечивающего высокую адгезионную и про¬лиферативную активность, а также оптимальную динамику бесферментного открепле¬ния клеток. Для обеспечения эффективного фотоиндуцируемого ковалентного связыва¬ния субстрата с поверхностью в состав линейных полимеров с оптимальным соотноше¬нием мономерных звеньев НИПА и НТБА введен фотоактивный мономер акриламидо- бензофенон (ААБФ). Определены параметры кооперативного фазового перехода в рас¬творах и субстратах ПНИПА/НТБА/ААБФ, разработана эффективная методика фото¬индуцируемого формирования полимерных сеток и ковалентного связывания их с по¬верхностью. Проведено исследование особенностей взаимодействия субстратов ПНИ¬ПА/НТБА/ААБФ с культурами клеток и определены перспективы его использования для целей тканевой инженерии, биотехнологии и медицины.
Можно отметить следующие основные результаты, представленные в диссерта¬ционной работе. Путем изменения сотношения гидрофильных и гидрофобных групп, мы добились снижения нижней критической температуры и уменьшения кооператив- ности фазового перехода полимеров ПНИПА/НТБА по сравнению с субстратом ПНИ- ПА. Снижение НКТС позволяет проводить манипуляции с клетками без жесткого тер- мостатирования, необходимого при работе с субстратами ПНИПА. Уменьшение коо- перативности фазового перехода привело к снижению темпов набухания субстратов и позволило регулировать тепы открепления клеточных пластов. Разработан метод формирования субстратов с шероховатостью поверхности 15 нм, оптимальной для ад¬гезии и роста клеток разных типов. Разработанная нами методика индуцируемого ультрафиолетовым светом ковалентного связывания полимерных цепей чрезвычайно эффективна на различных типах поверхности, позволяет наносить покрытие большей толщины, чем в разработанных ранее методах, варьировать число сшивок на единицу объема путем изменения времени экспозиции УФ. Разработанные нами субстраты поддерживают адгезию, пролиферацию клеток и экспрессию большинства генов на уровне, сравнимом с культивированием на специально обработанном для роста клеток полистироле, и позволяют проводить дифференцированное открепление клеток разных типов. Все эти достоинства разработанных нами субстратов определяют прикладную ценность полученных нами результатов для разработок в области тканевой инженерии, биотехнологии и медицины.
В ходе исследований было впервые показано, что увеличение процентного со¬держания мономеров НТВ А вызывает конформационные изменения в структуре сопо¬лимера ПНИПА/НТБА, следствиями которых являются экспоненциальное снижение кооперативности фазового перехода, а также темпов набухания субстратов и бесфер¬ментного открепления клеток от их поверхности. Впервые показано, что уменьшение числа полярных групп, находящихся в подходящей конформации для связывания с во¬дой, является основной причиной изменения смачиваемости поверхности субстратов ПНИПА/НТБА, и обуславливает усиление адгезионных характеристик субстратов ПНИПА/НТБА по сравнению с ПНИПА. Таким образом, несмотря на практическую направленность данной разработки, впервые удалось выявить связь микро и макропа¬раметров субстратов с термодинамическими характеристиками полимеров ПНИ¬ПА/НТБА и клеточной активностью, что является фундаментальным результатом про¬веденных исследований.
Данная работа была проведена в тесном сотрудничестве с российскими учеными, работающими в настоящее время в Университетах г. Дублина и г. Гэлуэя, и ирландски¬ми коллегами. В текст дисертации включены некоторые данные, полученные сотруд¬никами Дублинского Университета А.Гореловым (определение свободной энергии по¬верхности субстратов) и Л.Алленом (исследование параметров клеточного цикла и экс¬прессии генов), дополняющие результаты, полученные непосредственно автором.

Список литературы

ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Использование линейных полимеров позволило исключить токсичность субстратов и предпринять комплексный подход к разработке новых биоматериалов. Исследования кооперативных фазовых переходов в растворах термочувствительных полимеров и полимерных субстратах и определение физико-химических характеристик поверхности сополимеров ПНИПА/НТБА с различным соотношением мономеров были проведены параллельно с исследованием клеточной активности. Наряду с оптимизацией свойств субстратов ПНИПА/НТБА для целей тканевой инженерии, биотехнологии и медицины, были проведены исследования, направленные на выявление связи микро и макропараметров субстратов, определяющих их взаимодействие с культурами клеток. Проведенные исследования позволили также сделать ряд выводов, относительно возможных механизмов модуляции термочувствительности и адгезионных характеристик субстратов ПНИПА/НТБА.
Таким образом, все поставленные задачи были решены. Разработанные нами субстраты ПНИПА/НТБА поддерживают адгезию, пролиферацию клеток и экспрессию большинства генов на уровне, сравнимом с культивированием на специально обработанном для роста клеток полистироле, но при этом обеспечивают эффективное открепление клеток без применения ферментов и диссоциирующих агентов. Данные субстраты могут быть использованы для позиционирования трех и более типов клеток, создания сложных тканевых конструкций, предназначенных для восстановления поврежденных органов и тканей. Термочувствительные субстраты ПНИПА/НТБА обеспечивают возможность получения интактных первичных культур клеток и сохранения их специфической активности в течение многих пассажей, что открывает перспективу их применения в биотехнологии, для производства биологически активных препаратов, а также в медицине для проведения клеточной терапии тканей и органов. Высокая эластичность субстратов ПНИПА/НТБА в сочетании с возможность контролируемой доставки лекарственных препаратов открывают возможность применения разработанных нами материалов в качестве полимерного покрытия имплантируемых конструкций.
Разработанная нами методика формирования субстратов из спиртовых растворов линейных полимеров не требует проведения многократных промывок и стерилизации поверхности перед использованием для культивирования клеток, как в разработанных ранее методах. Медленное испарение спирта приводит к самоорганизации полимеров, следствиями которого являются минимизация площади поверхности и снижение шероховатости формируемых субстратов до уровня 15 нм, оптимального для адгезии, роста и поддержания функциональной активности клеток разных типов.
Снижение температуры фазового перехода, пропорциональное проценту содержащихся в полимерной цепи мономеров НТБА, позволяет проводить манипуляции с клетками без жесткого термостатирования, обычно применяемого при работе с субстратами ПНИПА. Снижение темпов набухания субстратов, вызванное уменьшением кооперативное™ фазового перехода, позволяет регулировать скорость открепления клеточных пластов.
Эффективность предложенного нами метода УФ-индуцируемого формирования полимерных сеток и ковалентного связывания их с поверхностью полистирола при использовании акриламидобензофенона в качестве сшивающего реагента существенно выше, чем в методах, предложенных ранее, плотность наносимого нами покрытия (500мкг/см2) существенно превышает максимальную плотность (3 мкг/см2) покрытия ПНИПА, полимеризуемого электронным лучом.
Наиболее интересным результатом, полученным на данном этапе, явилось выявление связи термодинамических характеристик с макропараметрами системы.. Резкое увеличение числа кооперативных блоков и константы инициации коллапса, характеризующее снижение термочувствительности полимеров, происходит при том же соотношении соотношении мономерных звеньев НИПА и НТБА ( приблизительно 3/1), при котором резко меняются темпы набухания полимерных субстратов и степень связывания ими воды при температуре культивирования. При том же соотношении мономерных звеньев происходит резкое снижение удельной теплоемкости
сколапсировавших полимеров. Эта связь может отражать наличие, по крайней мере, двух основных конформаций сополимеров ПНИПА/НТБА. Первая конформация при соотношении мономеров выше 3/1 — характеризуется высокой- кооперативностью фазового перехода, вторая, более компактная конформация, характеризуется низкой кооперативностью фазового перехода и низким содержанием С=0 и N-H групп, находящихся; в конформации, подходящей для образования водородных связей с молекулами воды. Продолжение исследований в данном направлении может привести к лучшему пониманию механизмов кооперативных фазовых переходов.
Результаты данной диссертационной работы можно применить как в дальнейших разработках термочувствительных биоматериалов, предназначенных для поддержания формирования тканей, иммобилизации и направленной доставки лекарственных препаратов, разделения макромолекул и регуляции активности биокатализаторов, так и в проведении исследований в области клеточной биологии.
ВЫВОДЫ
1. Установлено, что усиление гидрофобных взаимодействий при увеличении количества мономерных звеньев N-третбутилакриламида приводит к нелинейному снижению кооперативности и линейному снижению температуры фазового перехода в растворах сополимеров и термочувствительных субстратах ПНИПА/НТБА.
2. Разработан метод формирования полимерных субстратов с шероховатостью поверхности, оптимальной для культивирования клеток многих типов и обеспечивающей необходимую точность при проведении анализа физико-химических характеристик поверхности.
3. Выявлено, что с увеличением процентного содержания НТБА происходит изменение конформации сополимеров ПНИПА/НТБА в пленочных субстратах и возрастает степень компактизации структуры полимеров в растворе при температурах выше НКТС. Показано, что снижение числа полярных групп, находящихся в конформации, подходящей для формирования водородных связей с молекулами воды, приводит к снижению гидратируемости поверхности субстратов ПНИПА/НТБА при температуре 37°С.
4. Установлено, что снижение гидратируемости поверхности субстратов при температуре культивирования клеток приводит к значительному увеличению адгезионных характеристик субстратов ПНИПА/НТБА по сравнению с субстратами, сформированными на основе линейных полимеров ПНИПА. Показано, что разработанные нами субстраты на основе: линейных сополимеров ПНИПА/НТБА и ПНИПА/НТБА/ААБФ поддерживают адгезию, распластывание и рост фибробластов и эпителиальных клеток на уровне, сравнимом с обработанным для роста клеток полистиролом.
5. Разработана методика фотоиндуцируемого формирования полимерных сеток и ковалентного связывания субстратов ПНИПА/НТБА/ААБФ с поверхностью полистирола, установлены режимы формирования субстратов с различной степенью ковалентного связывания.
Выявлено, что при снижении температуры ниже НКТС все разработанные нами субстраты обеспечивают открепление клеток от поверхности без применения протеолитических ферментов и диссоциирующих реагентов. Установлено, что время, необходимое для открепления клеток, определяется темпами набухания сополимеров и существенно зависит от типа клеток и степени ковалентного связывания субстратов.