Іващенко Ольга Андріївна. ІДЕНТИФІКАЦЯ ВІРУСУ РЕПРОДУКТИВНОГО ТА РЕСПІРАТОРНОГО СИНДРОМУ СВИНЕЙ В УКРАЇНІ НА ОСНОВІ ВИВЧЕННЯ ЙОГО МОЛЕКУЛЯРНО-БІОЛОГІЧНИХ ОСОБЛИВОСТЕЙ : Иващенко Ольга Андреевна. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСА РЕПРОДУКТИВНОГО И РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ В УКРАИНЕ НА ОСНОВЕ ИЗУЧЕНИЯ ЕГО МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ Ivashchenko Olga Andreevna. IDENTIFICATION OF THE VIRUS OF REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME OF SWINE IN UKRAINE ON THE BASIS OF STUDY OF ITS MOLECULAR AND BIOLOGICAL

Краткое описание

Іващенко Ольга Андріївна. Назва дисертаційної роботи: "ІДЕНТИФІКАЦЯ ВІРУСУ РЕПРОДУКТИВНОГО ТА РЕСПІРАТОРНОГО СИНДРОМУ СВИНЕЙ В УКРАЇНІ НА ОСНОВІ ВИВЧЕННЯ ЙОГО МОЛЕКУЛЯРНО-БІОЛОГІЧНИХ ОСОБЛИВОСТЕЙ"

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ
КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
На правах рукопису
Іващенко Ольга Андріівна
УДК: 575.86 + 578.832.1
ІДЕНТИФІКАЦЯ ВІРУСУ РЕПРОДУКТИВНОГО ТА РЕСПІРАТОРНОГО
СИНДРОМУ СВИНЕЙ В УКРАЇНІ НА ОСНОВІ ВИВЧЕННЯ ЙОГО
МОЛЕКУЛЯРНО-БІОЛОГІЧНИХ ОСОБЛИВОСТЕЙ
03.00.06 – вірусологія
Дисертація
на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Науковий керівник:
доктор біологічних наук, професор
Будзанівська І.Г.
Київ – 2017
2
ЗМІСТ
Стор
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ 5
ВСТУП 7
РОЗДІЛ 1 ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА ВІРУСУ
РЕПРОДУКТИВНОГО ТА РЕСПІРАТОРНГО СИНДРОМУ СВИНЕЙ 15
1.1 Етіологічний агент репродуктивного та респіраторного синдрому
свиней 15
1.1.1 Транскрибційні особливості генів неструктурних білків та
характеристика їх протеїнів. 16
1.1.2 Транскрибційні особливості генів структурних білків та
характеристика їх протеїнів. 18
1.1.3 Віріон-асоційовані протеїни клітини хазяїна 19
1.1.4 Життєвий цикл вірусу репродуктивного та респіраторного синдрому
свиней 20
1.2 Варіабельність вірусу репродуктивного та респіраторного синдрому
свиней 21
1.3. Патогенез ВРРСС 25
1.3.1 Патогенез ВРРСС на рівні клітини 25
1.3.2. Патогенез ВРРСС на рівні організму 29
1.4. Імунна відповідь органзму тварини на ВРРСС інфекцію 31
1.4.1. Гуморальний імунітет 31
1.4.1.1. Протеїни ВРРСС, що беруть участь в інгібіції індукції
інтерферону 33
1.4.1.2. Інтерференція ВРРСС з JAK/STAT сигнальною системою 35
1.4.2. Клітинний імунітет 36
1.5. Клінічні прояви репродуктивного та респіраторного синдрому
свиней 37
1.5.1. Механізм трансплацентарного інфікування плоду ВРРСС 39
РОЗДІЛ 2 МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ 41
3
2.1 Об’єкт дослідження та його характеристика 41
2.1.1. Загальна характеристика об’єкту дослідження 41
2.1.2 Аналіз морфолого-потологічного стану уражених поросят/свиней та
відбір зразків для дослідження 43
2.2. Реактиви, матеріали та обладнання, що були використані в роботі
2.3 Молекулярно-біологічні методи дослідження 46
2.3.1 Конструювання і підбір праймерів для проведення ЗТ-ПЛР 47
2.3.2 Виділення РНК ВРРСС з патологічного матеріалу уражених тварин
49
2.3.3 Постановка реакції зворотньої транскрипції 49
2.3.4 Проведення полімеразної ланцюгової реакції 51
2.3.5. Проведення електрофоретичного аналізу продуктів реакцій в
агарозному гелі 52
2.3.6 Очищення продуктів ПЛР з агарозного гелю 53
2.3.7.Побудова філогенетичного дерева за допомогою програми MEGA 6.0 53
2.4. Гістологічний метод дослідження 54
2.4.1. Приготування гістологічних зразків 54
2.4.2. Мікроскопіювання і аналіз 56
2.5. Імуногістохімічний метод дослідження зразків тканин 56
2.5.1 Підготовка тканин органів. 56
2.5.2 Процедура проведення реакції 56
2.6. Метод імуноферментного аналізу 58
2.6.1 Приготування реагентів та зразків 58
2.6.2 Процедура проведення реакції 58
2.7. Статистична обробка результатів 59
РОЗДІЛ 3 ПОШИРЕНІСТЬ ВРРРСУ НА ТЕРИТОРІЇ УКРАЇНИ ТА
ДИНАМІКА ЙОГО РОЗПОВСЮДЖЕННЯ 61
3.1. Характеристика клінічного та морфолого-патологічного стану тварин,
відібраних для дослідження 61
3.2. Динаміка розповсюдження вірусу територією України в період 2005
по 2009 р. 64
4
3.3. Аналіз ситуації за ВРРСС в Україні в період з 2010 по 2014 рр.
67
РОЗДІЛ 4 ОСОБЛИВОСТІ ЗАСТОСУВАННЯ СЕРОЛОГІЧНИХ
ДОСЛІДЖЕНЬ У ДІАГНОСТИЦІ ВРРСС 69
4.1. Валідація використання методу імуноферментного аналізу 70
4.1.1. Чутливість та специфічність IDEXX HerdCheck PRRS 3XR ELISA. 70
4.1.2 Точність та повторюваність результатів 72
4.1.3 Міжнародні міжлабораторні порівняльні дослідження 74
4.2 Порівняння чутливості до українських ізолятів комерційних
серологічних тест-систем
77
4.3 Використання серологічного моніторингу та особливості інтерпретації
результатів
РОЗДІЛ 5 МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНІ ДОСЛІДЖЕННЯ ВРРСС 84
5.1 Характеристика праймерів, підібраних для проведення ЗТ-ПЛР з метою
діагностики вірусу 84
5.2 Виявлення ВРРСС у патологічному матеріалі органів свиней, в зразках
крові, сперми та фаренгіальних змивів 88
5.3 Апробація та вдосконалення умов проведення ПЛР ORF-5 92
5.4 Філогенетичний аналіз ізолятів за ORF-5 97
РОЗДІЛ 6 ГІСТОЛОГІЧНИЙ ТА ІМУНОГІСТОХІМІЧНИЙ АНАЛІЗ
ТКАНИН ТВАРИН ІНФІКОВАНИХ ВРРСС 102
УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ 107
ВИСНОВКИ 127
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ 129
5
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ
а.к.з. - амінокислотні залишки
АГ - Антиген
АТ - Антитіло
ДНК - дизоксирибонуклеїнова кислота
ЕДТА - етилендіамінтетраоцтова кислота
ЗТ - зворотня транскрипція
ПЛР - полімеразна ланцюгова реакція
п.о. - пар основ
РНК - рибонуклеїнова кислота
ВРРСС
- вірус репродуктивного та респіраторного
синдрому свиней
РРСС - репродуктивний та респіраторний синдром свиней
ПА-ВРРСС - Північно-Американський ВРРСС
ВП-ВРРСС - високопатогенний ВРРСС
ORF - open reading frame, відкрита рамка зчитування
NSP - неструктурний протеїн
ТИЖ. - тижні життя тварини
ЛГК - легені
ЛВ - лімфатичний вузол
ГС - гепарин сульфат
ЕПР - ендоплазматичний ретикулюм
ІФА - імуноферментний аналіз
UTR - нетрансльовані повтори
ГС - гепарин сульфат
CD 169 - сіалоадгезин
гЕПР - гладенький ендоплазматичний ретикулум
kb - тисяч пар основ
6
HSPA1 - білок 1 теплового шоку
IDH3A - ізоцитрат дегідрогеназа 3 ( NAD+) альфа
NDFUS1 - NAD дегідрогеназа Fe-S протеїн 1
ANXA2 - алексин А2
GSTP1 - глутатіон-S-трансферази
7
ВСТУП
Актуальність. Вірус репродуктивного та респіраторного синдрому
свиней на теперішній час поширений у більшості країнах-виробниках
свинини та продовжує залишатись головною причиною репродуктивних
втрат та респіраторних захворювань свиней [1, 2]. На даний момент його
вважають економічно одним з найважливіших вірусних патогенів у
свинарстві [2]. Це висококонтагіозне захворювання свиней різних вікових
груп може проявлятись як гостро, так і субклінічно [3, 4].
Територіальна поширеність ВРРСС, тяжкість його впливу на
сприйнятливі популяції тварин, виникнення непередбачуваних надзвичайних
епідемічних ситуацій – всі ці факти стали причиної внесення ВРРСС до
списку особливо небезпечних захворювань МЕБ [5, 6].
ВРРСС є представником роду Arterevirus, родини Artereviridae, порядку
Nidovirales. Аналіз секвенованих нуклеотидних послідовностей та
антигенних властивостей показав, що вірус репродуктивного та
респіраторного синдрому свиней (ВРРСС) можна поділити на ПівнічноАмериканський (тип 2) та Європейський (тип 1) генотипи, які мають лише
63% ідентичності на геномному рівні [2, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14].
Еволюційна мінливість ВРРСС фіксується, як найвища серед РНК вірусів
тварин [11, 15, 16]. Так, Dan Liu та колеги експериментально показали
високий рівень рекомбінації між двома різними штамами ВРРСС під час
одночасного інфікування тварини ними [3, 4]. Високий рівень варіабельності
вірусу значно ускладнює постановку правильного діагнозу, вакцинацію та
контроль за захворюванням.
Tomasz Stadejek, провів аналіз різних ізолятів вірусу з країн Європи та
наголосив на високому рівні варіабельності особливо у Східній Європі
навіть за ORF7, що вважається найконсервативнішим геном вірусу [7, 8].
8
Репродуктивний та респіраторний синдром свиней вперше
діагностований в Канаді в 1979 році та швидко розповсюдився в Північній
Америці в пізніх 80-тих. В Європі подібний синдром, що був викликаний
спорідненим, але генетично відмінним артеревірусом, швидко
розповсюдився протягом 1990-1992 років. Серологічні докази також свідчать
про те, що вірус ще в 1988 році циркулював у Німеччині [1, 3, 17 ].
Більш ніж за 10 років вірус репродуктивного та респіраторного
синдрому свиней розповсюдився в більшості популяцій свиней. Вірус
репродуктивного та респіраторного синдрому свиней не виявлений лише в
Австралії, Новій Зеландії, Норвегії, Фінляндії, Швейцарії та Швеції [1]. Цей
збудник визнаний ре-емерджентим, від так, генетичний матеріал ВРРСС був
виявлений у Франції, Німеччині, Бельгії, Данії, Іспанії, Італії, Чехії, Латвії,
Литві, Росії, Білорусії, Казахстані, Україні, Китаї, Японії, В’єтнамі, Тайланді,
США [18, 19, 20, 21].
Беручи до уваги той факт, що поширеність ВРРСС в Україні
недостатньо вивчена, виникла необхідність проведення серологічного
дослідження для з’ясування ситуації з ВРРСС в Україні.
Вивчення репродуктивного та респіраторного синдрому свиней має
велике значення, оскільки дане захворювання може завдати надзвичайних
збитків свинарним господарствам. Контагіозність, високий рівень абортів та
смертності за згаданого захворювання зумовлює необхідність розробки та
застосування експрес-методів діагностики для ідентифікації збудника та
запровадження карантинних і профілактичних заходів.
Впровадження ефективних методів діагностики захворювання є одним з
інструментів у боротьбі з розповсюдженням ВРРСС серед тварин у
господарствах України. Одним із підходів до вирішення даної проблеми є
створення тест-систем на основі полімеразної ланцюгової реакції, що є
найперспективнішим методом діагностики ВРРСС як за хронічного та
персистентного перебігу захворювання, так і у випадку гострого перебігу
захворювання. Очевидним є те, що розробка тест-систем на основі ПЛР є
9
необхідним для швидкої диференційної діагностики ВРРСС, що є
надзвичайно важливим для широкого практичного використання. Крім того,
лише за допомогою вказаного методичного підходу можливим є виявлення
вірусоносійства, що необхідно для успішного контролю за розповсюдженням
захворювання [9].
З огляду на значну різноманітність та високу варіабельність штамів
ВРРСС, з'ясування походження ізолятів вірусу є необхідним для визначення
ступеню їх вірулентності, шляхів зараження тварин. Оскільки для захисту
проти різних типів штамів необхідно використовувати специфічні вакцини,
аналіз походження виявлених ізолятів є необхідним для адекватної
вакцинації тварин. Однією з найваріабельніших ділянок геному ВРРСС є
ORF 5, данні про сиквенс якої є найінформативнішим. Це важливо для
встановлення філогенетичної спорідненості ізоляту з раніше відомими та для
встановлення ступеню гомології з вакцинними штамами для підбору
оптимального підходу до вакцинопрофілактики в кожному окремому
клінічному випадку. Одним із методів вирішення даної проблеми є
відпрацювання тест-системи на основі полімеразної ланцюгової реакції на
консервативну ділянку гену ORF 7 для постановки діагнозу та на ORF 5 для
подальшого сиквенування вірус, проте високий рівень варіабельності цієї
ділянки геному ВРРСС значно ускладнює виконання цього завдання.
Після постановки діагнозу ВРРСС необхідним наступним кроком є
підбір оптимальної схеми вакцинопрофілактики та контроль за ефективністю
її застосування. Для аналізу епізоотичної ситуації в господарстві, термінів
інфікування тварин, інтенсивності та тривалості інфекційного процесу, що
необхідно для комплексної оцінки причетності ВРРСС в симптомокомплексі
респіраторних проблем та подальшого підбору оптимальної схеми
вакцинопрофілактики, найзручнішою є побудова серологічних профілів.
Враховуючи високу варіабельність nsp-2 регіону ВРРСС вцілому, а
також можливість циркулювання на території України ВРРСС з генетичним
профілем, характерним для східноєвропейського ВРРСС, постає необхідність
10
аналізу чутливості серологічних тест-систем, які використовуються в
Україні.
Взаємодія між вірусом та імунною системою хазяїна достатньо складна.
Вже достеменно відомо, що ВРРСС проявляє імуносупресивну дію, що
ослаблює вроджений захист організму та значно знижує ефективність
адаптивної імунної відповіді [22]. Це в свою чергу призводить до розвитку
ко-інфекцій, як вірусними так і бактеріальними патогенами. В таких
складних клінічних випадках необхідно не тільки виявити кожен з патогенів,
який бере участь в розвитку патологічного процесу, проте й встановити роль
в ньому кожного з них. З цією метою найдоцільнішим є використання
гістологічного методу дослідження для аналізу характеру патогістологічних
змін в тканинах органів та ступеню ураження для встановлення ролі ВРРСС
та ко-інфектантів у інфекційному процесі.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Дисертаційна робота виконана в межах технічного завдання держбюджетної
теми №11БФ 036-02 «Збереження біорізноманіття та комплексне
дослідження стратегій адаптації фіто-, зоо-, та віробіоти України з
використанням біоінформаційних технологій» кафедри вірусології ННЦ
«Інститут біології» Київського національного університету імені Тараса
Шевченка, № державної реєстрації 0111U004649.
Мета та завдання дослідження. Ідентифікувати ВРРС на території
України, вивчити його молекулярно-біологічні особливості, дослідити
поширеність та розробити підходи до диференційної діагностики даного
патогену.
Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:
1. Провести ретроспективний аналіз захворюваності на ВРРСС серед
поголів’я свиней України за період 2005-2014 рр.
11
2. Виділити генетичний матеріал українських ізолятів вірусу
репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (ВРРСС) з
патологічного матеріалу.
3. Підібрати праймери до ділянок геному ВРРСС (ORF 5, ORF 7) та
оптимізувати умови проведення ПЛР.
4. Провести секвенування та філогенетичний аналіз українських ізолятів
ВРРСС.
5. Провести порівняльний аналіз чутливості комерційних серологічних тестсистем до українських ізолятів ВРРСС.
6. Розробити принципи побудови серологічних профілів стада за ВРРСС.
7. Розробити диференційну діагностику ВРРСС в клінічно складних
випадках ко-інфікування декількома патогенми.
Об’єкт дослідження: вірус репродуктивного та респіраторного
синдрому свиней та його діагностика.
Предмет дослідження: молекулярно-біологічна характеристика
ізолятів вірусу репродуктивного та респіраторного синдрому свиней, що
циркулюють в Україні, захворюваність на ВРРСС.
Методи досліджень. Для виявлення та ідентифікації вірусів
застосовували клінічні, вірусологічні, серологічні, молекулярно-біологічні,
гістологічні (паталого-формологічний аналіз та імуногістохімічне
дослідження), філогенетичні, статистичні методи дослідження.
Наукова новизна одержаних результатів. Проведено виділення в
Україні ізолятів вірусу ВРРСС, біологічні властивості цих ізолятів,
зроблений їх філогенетичний аналіз. Отримані результати дають можливість
підібрати штами для виробництва діагностичних та вакцинних препаратів.
Проведений ретроспективний аналіз поширеності ВРРСС серед
поголів’я свиней України і філогенетичний аналіз високоваріабельної
ділянки гену геному ORF5 є науковим підґрунтям для вдосконалення
12
впровадженої системи епідеміологічного та вірусологічного нагляду за
ВРРСС в Україні.
Завдяки проведенню порівняльного аналізу комерційних серологічних
тест-систем показано різну їх чутливість до українських ізолятів, що в свою
чергу вказує на антигенну відмінність ВРРСС, що циркулює в Україні, у
порівнянні з тими, що циркулюють в Західній Європі, Азії, Америці.
Показана різниця у патогенезі на рівні тканин ВРРСС українських
штамів, у порівнянні з американськими та західноєвропейськими.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати
молекулярно-біологічної характеристики ВРРСС, що циркулює в Україні,
забезпечують необхідною інформацією для вдосконалення існуючих методів
діагностики та впровадження комплексних підходів до профілактики
захворювання.
Порівняльний аналіз чутливості комерційних серологічних тестсистем, що використовуються в Україні для діагностики ВРРСС, виявив
доцільність використання конкретних тест-систем виробництва США (тестсистема 1) та Іспанії (тест-система 4) для проведення моніторингових
досліджень епізоотичної ситуації в Україні. Це забезпечить необхідною
інформацією управлінські структури, що дозволить більш ефективно
реагувати на появу нових штамів ВРРСС в Україні та контролювати
динаміку його поширення.
Апробована тест-система для детекції консервативної ділянки геному
ВРРСС методом ПЛР забезпечить необхідність в точній експрес діагностиці
збудника, тоді як тест-система для детекції гену ORF 5 ВРРСС –
інструментом, що дозволив ідентифікувати і оцінити положення виділених
штамів на філогенетичному дереві на глобальному рівні. Важливість цього
полягає не стільки в аналізі конкретних ізолятів, як в можливості
використання цього методу в рутинній діагностиці ВРРСС для впровадження
ефективніших засобів профілактики, та заходів біобезпеки для кращого
контролю ситуації з ВРРСС.
13
Виявлені характерні зміни в тканинах органів тварин уражених ВРРСС
на різних стадіях захворювання, що робить можливим використання
гістологічного методу для диференційної діагностики ВРРСС у складних
клінічних випадках ко-інфекції.
Результати досліджень використані для розробки комплексного
підходу до діагностики ВРРСС впроваджені в протокол роботи Центру
ветеринарної діагностики (м. Київ), в якому проводиться діагностика
вірусних та бактеріальних захворювань сільськогосподарських тварин та
птиці з усієї України.
Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою
автора. Розробка плану експерименту та її реалізація, отримання
експериментальних даних, їх узагальнення, інтерпретація здійснена автором
особисто під керівництвом проф. І.Г. Будзанівської.
Автором вивчено динаміку поширення ВРРСС на території України за
період 2005-2014рр. разом з директором Центру ветеринарної діагностики
Собко І.О.
Лабораторна диференційна діагностика ВРРСС методом ПЛР,
гістологічне та імуногістохімічне дослідження були проведені у Центрі
ветеринарної діагностики самостійно під керівництвом директора Центру
ветеринарної діагностики Собко І.О.
Вибір праймерів для виявлення високоваріабельного гену ORF5 та
філогенетичний аналіз вірусів, що циркулюють в Україні, проведений
автором особисто на кафедрі вірусології ННЦ «Інститут біології» Київського
національного університету імені Тараса Шевченка під керівництвом
наукового керівника Будзанівської І.Г.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної
роботи оприлюднені та обговорені на засідання кафедри вірусології ННЦ
«Інститут біології» Київського національного університету імені Тараса
Шевченка (що півроку); конференції присвяченій 50-річчю кафедри
14
вірусології «Understanding and combating PRRS in Europe» (Будапешт 25-27
жовтня 2012, Угорщина); VII Міжнародній конференції «Біоресурси та
віруси» (Київ, 10-13 вересня 2013); «Global Virus Networking»(4-6 червня,
Estonia 2014); V-ий Європейський симпозіум здоров’я свиней (Сполучене
королівство Великої Британії і Північної Ірландії, 2013); VIІI Міжнародній
конференції «Біоресурси та віруси» (Київ, 10-13 вересня 2016).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 наукових праць
у фахових наукових виданнях (2 мають індекс цитування) та 13 тез наукових
конференцій (7 – міжнародні).
Структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 148
сторінках комп’ютерного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, 5
розділів власних досліджень та їх обговорення, узагальнень, висновків.
Список літератури включає 156 джерел. Дисертація ілюстрована 20
рисунками та 20 таблицями.

Список литературы

ВИСНОВКИ
В дисертації була вирішена науково-практична проблема – досліджені
молекулярно-біологічні особливості циркулюючого в Україні ВРРСС, що
дозволить оперативно діагностувати збудник, оцінювати епізоотичну
ситуацію для впровадження адекватної схеми вакцинопрофілактики,
оцінювати ефективність застосованих профілактичних засобів та заходів
біобезпеки для попередження розповсюдження ВРРСС територією України.
Основні результати представлені у висновках:
1. Виявлено циркуляцію вірусу репродуктивного та респіраторного
синдрому свиней у 60 господарствах 19-ти областей України.
Захворюваність поголів’я свиней на ВРРСС в України за період 2005-
2014 рр має тенденцію до зростання. Основними причинами цього є
збільшення поголів’я тварин, ввезення тварин із закордону.
2. Встановлення різниці чутливості серологічних комерційних тестсистем до українських ізолятів ВРРСС показали неможливість
використання тест-систем корейського та іспанського виробництва.
Серед досліджених найчутливішою до українських ізолятів ВРРСС
показала себе серологічна тест-система 1 (виробництва США).
3. Встановлено, що для першого етапу оцінки епізоотичної ситуації за
ВРРСС у господарстві доцільно проводити дослідження сироватки
крові від тварин у віці 24 тижнів (кінець продуктивного періоду).
4. Вперше проведено підбір оптимальних вікових груп для побудови
інформативного серологічного профілю за ВРРСС – 4, 7, 10, 15, 18 та
129
24 тижні життя, результати якого використовуються для розробки та
контролю ефективності застосування профілактичних заходів.
5. Для швидкої рутинної діагностики ВРРСС до консервативного
фрагменту ORF7 геному вірусу підібрано пару праймерів
PRRSVp1_Nfor, PRRSVp2_Nrev. Оптимізовано умови проведення ЗТПЛР: найбільша специфічність реакції спостерігається за температури
гібридизації 58°С та концентрації 2,5 мМ магнію сульфату в межах
0,75 мкл.
6. Для проведення філогенетичного аналізу ВРРСС до варіабельного
фрагменту ORF5 геному вірусу підібрані дві пари праймерів.
Оптимізовано умови проведення ЗТ-ПЛР для ідентифікації та
подальшого секвенування генетичного матеріалу ВРРСС у зразках.
Найбільша специфічність реакції спостерігається за температури
гібридизації 52°С та концентрації 2,5 мМ магнію сульфату в межах
0,75 мкл.
7. Показана різниця у патогенезі на рівні тканини українських штамів
ВРРСС, у порівнянні з американськими та західноєвропейськими.
Виявлені характерні зміни в тканинах органів тварин уражених ВРРСС
на різних стадіях захворювання, що робить можливим використання
гістологічного методу для диференційної діагностики ВРРСС у
складних клінічних випадках ко-інфекції.
8. Філогенетичний аналіз українських ізолятів ВРРСС доводить
гетерогенність їх популяцій, що свідчить про їх різне походження. За
нашими даними, українські ізоляти мають спільне походження зі
штамами з Білорусії, Іспанії та Італії.