БОЯЛЬСЬКА ОКСАНА ГЕННАДІЇВНА. ЕПІДЕМІОЛОГІЧНИЙ ПРОФІЛЬ ГРІ ТА МОЛЕКУЛЯРНО-БІОЛОГІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ВІРУСІВ ГРИПУ ПІД ЧАС ЕПІДЕМІЙ В ЖИТОМИРСЬКІЙ ОБЛАСТІ

Краткое описание

БОЯЛЬСЬКА ОКСАНА ГЕННАДІЇВНА. Назва дисертаційної роботи: "ЕПІДЕМІОЛОГІЧНИЙ ПРОФІЛЬ ГРІ ТА МОЛЕКУЛЯРНО-БІОЛОГІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ВІРУСІВ ГРИПУ ПІД ЧАС ЕПІДЕМІЙ В ЖИТОМИРСЬКІЙ ОБЛАСТІ "

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ
КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
На правах рукопису
Бояльська Оксана Геннадіївна
УДК: 575.86 + 578.832.1
ЕПІДЕМІОЛОГІЧНИЙ ПРОФІЛЬ ГРІ ТА МОЛЕКУЛЯРНОБІОЛОГІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ВІРУСІВ ГРИПУ
ПІД ЧАС ЕПІДЕМІЙ В ЖИТОМИРСЬКІЙ ОБЛАСТІ
03.00.06 - вірусологія
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
Науковий керівник:
доктор біологічних наук, професор
Будзанівська І. Г.
Київ - 2016
2
ЗМІСТ
Стор
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ ТА СКОРОЧЕНЬ 4
ВСТУП 5
РОЗДІЛ 1 ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА ВІРУСІВ, ЩО
ВИКЛИКАЮТЬ ГРВІ
12
1.1 Загальна характеристика респіраторних вірусів 12
1.2 Характеристика родини Orthomyxoviridae 14
1.3 Історичні аспекти відомих пандемій ХХ та ХХІ століття 15
1.4 Організація геному вірусу грипу 22
1.5 Реплікація геному вірусу грипу 24
1.6 Білковий склад та антигени вірусу грипу 26
1.7 Механізми еволюції вірусів грипу 34
1.8 Лабораторна діагностика грипу 35
1.9 Філогенетичний аналіз для вивчення вірусів грипу 40
РОЗДІЛ 2 МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ 43
2.1 Матеріали досліджень 43
2.2 Методи досліджень 43
2.2.1 Виявлення вірусів грипу типів А та В за допомогою панелі
праймерів та зондів (Biosearch) методом ПЛР у реальному часі
43
2.2.2 Виявлення інших збудників ГРВІ за допомогою набору «ОРВИ -
скрин» (Амплисенс, Россия)
57
2.2.3 Ізоляція виявлених вірусів грипу на культурі клітин MDCK та
MDCK-SIAT
60
2.2.4 Визначення типоспецифічності ізольованих вірусів методом
РГГА
63
2.2.5 Побудова філогенетичних дерев за допомогою програми
MEGA 6.0
65
2.2.6 Статистична обробка результатів 66
3
РОЗДІЛ 3 РЕТРОСПЕКТИВНИЙ АНАЛІЗ ЗАХВОРЮВАНОСТІ НА
ГРИП ТА ІНШІ ГРІ НАСЕЛЕННЯ ЖИТОМИРСЬКОЇ ОБЛАСТІ ЗА
ПЕРІОД З 1999 ДО 2015 РР.
67
3.1 Аналіз захворюваності на грип та інші ГРІ населення Житомирської
області
67
3.2 Порівняльний аналіз захворюваності на грип та інші ГРІ населення
Житомирської області в розрізі районів
71
РОЗДІЛ 4 МОНІТОРИНГ ВІРУСІВ ГРИПУ ТА ІНШИХ ЗБУДНИКІВ
ГРВІ, ЯКІ БУЛИ ПОШИРЕНІ В ЖИТОМИРСЬКІЙ ОБЛАСТІ
ПРОТЯГОМ 2009-2015 РР.
77
4.1 Виявлення вірусів грипу типів А та В методом ПЛР у реальному
часі
77
4.2 Виявлення збудників інших ГРВІ методом ПЛР у реальному часі 83
РОЗДІЛ 5 ФІЛОГЕНЕТИЧНИЙ АНАЛІЗ ВІРУСІВ ГРИПУ,
ВИДІЛЕНИХ У ЖИТОМИРСЬКІЙ ОБЛАСТІ ЗА ПЕРІОД З 2009 ДО
2015 РР.
88
5.1 Порівняльний філогенетичний аналіз вірусів грипу А(H1N1)pdm,
які циркулювали в Житомирській області протягом 2009-2015 рр.
88
5.2 Порівняльний філогенетичний аналіз вірусів грипу А(H3N2), які
циркулювали в Житомирській області протягом 2009-2015 рр.
94
5.3 Порівняльний філогенетичний аналіз вірусів грипу В, які
циркулювали в Житомирській області протягом 2009-2015 рр.
102
УЗАГАЛЬНЕННЯ 110
ВИСНОВКИ 125
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ 127
4
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ ТА СКОРОЧЕНЬ
АГ - антиген;
аз - амінокислотні залишки;
ВООЗ - Всесвітня організація охорони здоров’я;
ГРІ - гострі респіраторні інфекції;
ГРВЗ - гостре респіраторне вірусне захворювання;
ЗТ-ПЛР - полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскрипцією;
ІФН - інтерферон;
ІФА - імуноферментний аналіз;
ІХА - імунохроматографічний метод;
МФА - метод флуоресцируючих антитіл;
НК - нуклеїнова кислота;
нз - нуклеотидні залишки;
Об/хв - обертів за хвилину;
Од/мл - одиниць на 1 мл;
ПААГ - поліакриламідний гель;
РС- вірус - респіраторно-синцитіальний вірус;
РЛА - реакція латекс-аглютинації;
РГА - реакція гемаглютинації;
РГГА - реакція гальмування гемаглютинації;
РНК - рибонуклеїнова кислота;
мРНК - матрична рибонуклеїнова кислота;
кРНК - повні комплементарні транскрипти;
пре-мРНК - попередник матричної РНК;
РЦР - ранні цитокінові реакції;
РЗК - реакція зв’язування комплементу;
РН - реакція нейтралізації;
HA - гемаглютинін;
NA - нейрамінідаза.
5
ВСТУП
Актуальність. Грип та інші гострі респіраторні інфекції (ГРІ) займають
перше місце за частотою та кількістю випадків захворювань у світі [1]. В
Україні щорічно на грип та ГРІ хворіють 10-14 млн осіб, що становить 25-30%
усієї та близько 75-90% інфекційної захворюваності в країні [2].
До 95% респіраторних інфекцій мають вірусну природу. Вони
зумовлюють високі рівні захворюваності та смертності, особливо в людей
похилого віку і в групах високого ризику, немовлят, дітей, а також в осіб з
ослабленим імунітетом та людей з хронічними хворобами [3, 4, 5]. Відомо
більше ніж 200 вірусів, які здатні викликати ураження респіраторного тракту.
До найбільш розповсюджених збудників гострих респіраторних вірусних
інфекцій (ГРВІ) відносять віруси грипу, парагрипу, респіраторносинцитіальний вірус, аденовіруси, риновіруси, метапневмовіруси,
коронавіруси, ентеровіруси та бокавіруси [1]. Сезонні підйоми захворюваності
на грип та інші ГРІ характеризуються змішаною етіологією, у яких частка
грипу превалює [2].
Вірус грипу є основним респіраторним вірусом, який може призвести до
чисельної кількості випадків госпіталізації та смертей [6]. Віруси грипу
викликають щорічні епідемії та разом з іншими ГРІ уражують 5-15% населення
у всьому світі. За даними Всесвітньої організації охорони здоров'я (ВООЗ)
щорічно у всьому світі реєструється 3-5 млн важких випадків грипу і
250000-500000 смертей від нього [7]. Віруси грипу – збудники, які мають
здатність викликати пандемії. Пандемії виникають кожні 11-40 років та
звичайно протікають хвилеподібно й можуть продовжуватись до 1,5-2 років,
іноді – з охопленням за 9-10 місяців до 30% населення земної кулі [2, 8].
Найтяжчою в історії людства була пандемія вірусу грипу A(H1N1), так
званий «Іспанський грип» 1918-1919 рр. [9]. Остання пандемія та перша у
ХХІ ст. виникла у 2009 р. та була викликана вірусом грипу A(H1N1)pdm, який
являв собою вірус-реасортант, що утворився з вірусів грипу людини, птахів та
6
свиней. Набуття цим вірусом властивості передаватися від людини до людини
через повітря призвело до швидкого поширення серед людей у країнах різних
континентів [10].
Усі пандемії були викликані різними серотипами вірусу грипу типу А.
Висока мінливість вірусу грипу зумовлена, по-перше, фрагментарною
структурою геному вірусу, а також унікальними антигенними властивостями
двох поверхневих глікопротеїнів: гемаглютиніну (HA) і нейрамінідази (NA).
Віруси грипу типу А більш мінливі, ніж віруси грипу В та С [11]. Змінюючи
склад своїх поверхневих антигенів з високою еволюційною швидкістю, віруси
грипу мають можливість ухилитися від дії імунної системи, при цьому
зберігаючись у популяції людини [12].
Висока мінливість вірусів грипу призводить до необхідності робити
порівняння антигенних і біологічних властивостей вірусів грипу під час
епідемій [12]. Спостереження і контроль за антигенними властивостями
циркулюючих серед населення вірусів грипу щороку необхідні для визначення
нового варіанта штаму для включення його до складу вакцини [14, 15].
У даний час в людській популяції циркулюють підтипи вірусу грипу А
(H1N1) і (H3N2) та грипу В [16]. Поширеність цих трьох вірусів грипу може
змінюватися за часом або географічно усередині країни, між країнами і
континентами протягом одного сезону грипу [17].
Отже, моніторинг інтенсивності епідемічного процесу та циркуляції
вірусів грипу та інших ГРІ на окремих територіях країни є одним з
пріоритетних напрямків епідеміологічного і вірусологічного нагляду та
наукових досліджень, що дозволить оперативно оцінювати ситуацію і
проводити профілактичні (протиепідемічні) заходи.
Вдалою моделлю для дослідження епідеміологічного профілю ГРІ та
філогенетичного аналізу вірусів грипу можна використати Житомирську
область, яка на своїй території має добре розвинені транспортні магістралі, як
залізничні, так і автомобільні, які з'єднують з центральною, східною та
південною частинами України, а також з країнами Східної та Центральної
7
Європи. Внаслідок цього вірус грипу може швидко потрапляти до
Житомирської області з території інших областей та країн.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Дисертаційна робота виконана в межах технічного завдання держбюджетної
теми № 11БФ 036-02 «Збереження біорізноманіття та комплексне дослідження
стратегій адаптації фіто-, зоо- та віробіоти України з використанням
біоінформаційних технологій» кафедри вірусології ННЦ «Інститут біології»
Київського національного університету імені Тараса Шевченка
(номер держреєстрації 0111U004649). Також пов’язана з роботами, виконаними
у відділі респіраторних та інших вірусних інфекцій ДУ «Інститут епідеміології
та інфекційних хвороб ім. Л. В. Громашевського НАМН України»: шифр 133,
«Розробити програму етіологічного прогнозування епідемій грипу в Україні»
2014-2016 рр. виконання (номер держреєстрації: 0114U000383); шифр 122,
«Філогенетичний аналіз вірусів грипу та напрямок їх еволюції» 2011-2013 рр.
виконання (номер держреєстрації: 0111U002013).
Мета та завдання дослідження. Дослідити епідеміологічний профіль
ГРІ за період з 1999 до 2015 рр. та провести філогенетичний аналіз вірусів
грипу, які циркулювали протягом 2009-2015 рр.
Для досягнення поставленої мети необхідно було виконати такі завдання:
1. Провести ретроспективний аналіз захворюваності на грип та інші ГРІ
серед населення Житомирської області за період з 1999 до 2015 рр.
2. Визначити етіологічну структуру популяції вірусів грипу в Житомирській
області протягом 2009-2015 рр.
3. Вивчити поширення вірусів грипу серед різних груп населення в
епідемічних сезонах 2009-2015 рр.
4. Провести диференційну діагностику грипу та інших ГРВІ молекулярногенетичним методом.
5. Виділити та накопичити на чутливій культурі клітин MDCK віруси грипу,
що циркулювали протягом 2009-2015 рр. для проведення сиквенування.
8
6. Провести філогенетичний аналіз нуклеотидних послідовностей
поверхневих антигенів вірусів грипу для виявлення еволюційних змін.
7. Дослідити нуклеотидні та амінокислотні послідовності генів
гемаглютиніну та нейрамінідази сиквенованих вірусів грипу і виявити в
них мутації.
Об’єкт дослідження: епідемічний процес ГРІ в Житомирській області,
генетична мінливість вірусів грипу.
Предмет дослідження: захворюваність на грип та інші ГРІ, молекулярногенетична характеристика вірусів грипу типів А та В.
Методи дослідження: для виконання поставлених завдань у роботі
використано епідеміологічний, вірусологічний, серологічний, молекулярногенетичний, статистичний методи дослідження.
Наукова новизна одержаних результатів.
Вперше показано, що захворюваність на грип населення Житомирської
області та України в цілому протягом 17 календарних років має тенденцію до
зниження.
Захворюваність на інші ГРІ населення Житомирської області, як і
України в цілому, на відміну від захворюваності на грип, реєструється
протягом всього календарного року.
Виявлено особливість етіологічної структури популяцій вірусів грипу в
Житомирській області протягом 2009-2015 рр., яка відрізняється від України та
інших країн Європи та світу. Вірус грипу А(H1N1)pdm на території
Житомирської області виявлявся у чотирьох, вірус грипу А(H3N2) – в трьох,
вірус грипу В – в двох епідемічних сезонах.
Вперше, на прикладі двох епідемічних сезонів протягом 2009-2015 рр.
показано моноциркуляцію штамів вірусів грипу (епідемічні сезони
2012-2013 рр. (А(H1N1)pdm) та 2013-2014 рр. (A(H3N2)), в порівнянні з
Україною та іншими країнами Європи та світу, де в даних епідемічних сезонах
спостерігалась ко-циркуляція всіх трьох штамів вірусів грипу.
9
Завдяки проведенню філогенетичного аналізу методом максимальної
правдоподібності показано еволюційні зміни в послідовностях генів
гемаглютиніну та нейрамінідази сиквенованих вірусів грипу за період з 2009 до
2015 рр.
Практичне значення одержаних результатів.
На прикладі Житомирської області показано, що проведення
епідеміологічного та вірусологічного нагляду за грипом на високому рівні з
використанням сучасних лабораторних методів забезпечує необхідною
інформацією управлінські структури, що дозволяє вчасно реагувати на появу
нових вірусів, в тому числі – з можливими пандемічними потенціалами.
Отримані результати доповнюють інформацію про дослідження
властивостей вірусів грипу, циркулюючих в Україні в цілому, що дозволило
ідентифікувати й оцінити положення виділених штамів на глобальному рівні.
Дана інформація буде повною та більш коректною, якщо такі дані будуть
отримані з кожної області України. Це, своєю чергою, потрібно для відбору
кандидатів до складу протигрипозної вакцини.
Комплексне застосування тест-систем на грип та інші респіраторні
патогени показали доцільність використання диференційної діагностики грипу
та інших ГРВІ на підставі проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР),
зокрема для прийняття рішення лікарями щодо необхідності використання для
лікування хворих інгібіторів нейрамінідази.
Результати досліджень використані при внесенні даних України у дві
системи нагляду за грипом: Європейську систему TESSY (Flu News Europe) та
всесвітню мережу ВООЗ – FluNet, що забезпечило більш повну подачу
інформації щодо відображення епідемічної ситуації в нашій країні.
Особистий внесок здобувача.
Дисертація є самостійною роботою автора. Розробка плану експерименту
та її реалізація, отримання експериментальних даних, їх узагальнення,
інтерпретація здійснена автором особисто під керівництвом академіка НААН,
10
д.б.н., проф. А. Л. Бойка; д.б.н., проф. І. Г. Будзанівської;
д.мед.н. А. П. Міроненко.
Автором вивчено особливості епідеміологічного процесу грипу в
Житомирській області за період з 1999 до 2015 рр. разом із заступником
начальника Головного управління Держсанепідслужби України в
Житомирській області Киричуком І. М.
Лабораторна диференційна діагностика грипу та інших ГРВІ методом
ПЛР у реальному часі була проведена у вірусологічній лабораторії ДУ
«Житомирський обласний лабораторний центр Держсанепідслужби України»
самостійно.
Виділення вірусів грипу на чутливій культурі клітин, проведення
штамової ідентифікації виділених житомирських ізолятів проводились у відділі
респіраторних та інших вірусних інфекцій ДУ «Інститут епідеміології та
інфекційних хвороб ім. Л. В. Громашевського НАМН України».
Філогенетичний аналіз вірусів грипу, що циркулювали в Житомирській
області за період з 2009 до 2015 рр., проведений автором особисто на кафедрі
вірусології ННЦ «Інститут біології» Київського національного університету
імені Тараса Шевченка.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної
роботи оприлюднені та обговорені на засіданнях кафедри вірусології ННЦ
«Інститут біології» Київського національного університету імені Тараса
Шевченка (щопівроку); конференції, присвяченій 50-річчю кафедри вірусології
«Вірусологія: минуле, сьогодення, майбутнє» (Київ, 12 квітня 2012);
VII Міжнародній конференції «Біоресурси та віруси» (Київ, 10-13 вересня
2013); V Науково-практичній конференції «Біологічні дослідження - 2015»
(Житомир, 11-12 березня 2015); Міжнародній конференції для молодих вчених
«Сучасні проблеми мікробіології та біотехнології» (Одеса, 1-4 червня 2015);
Міжнародній конференції молодих вчених CYS-2015 (Київ, 21-25 вересня
2015).
11
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 наукових праць у
фахових наукових виданнях (з них 1 у виданні, що входить до міжнародної бази
даних Scopus) та 5 тез наукових конференцій (3 – міжнародні).
Структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 145 сторінках і
складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, 3 розділів
власних досліджень та їх обговорення, узагальнення отриманих результатів,
висновків. Список літератури включає 165 джерел. Дисертація ілюстрована 28
рисунками та 6 таблицями.

Список литературы

ВИСНОВКИ
У дисертаційній роботі вирішено важливу та актуальну науковопрактичну проблему – за допомогою епідеміологічного та вірусологічного
нагляду досліджено інтенсивність та етіологічні чинники епідемічного процесу
грипу та інших ГРІ в Житомирській області, а також генетичні зміни, які
відбулися у циркулюючих вірусах грипу, що дозволить оперативно оцінювати
ситуацію і проводити профілактичні (протиепідемічні) заходи.
Основні результати надані у висновках:
1. Захворюваність на грип населення Житомирської області та України в
цілому протягом 17 календарних років має тенденцію до зниження.
2. Виявлена особливість етіологічної структури популяції вірусів грипу в
Житомирській області протягом 2009-2015 рр., яка відрізняється від
України та інших країн Європи та світу. Вірус грипу А(H1N1)pdm на
території Житомирської області виявлявся у чотирьох, вірус грипу
А(H3N2) – в трьох, вірус грипу В – у двох епідемічних сезонах.
3. Проведена диференційна діагностика ГРВІ методом ПЛР у реальному
часі показала, що під час епідемій грипу серед населення Житомирської
області крім вірусів грипу виявлялись інші респіраторні віруси, а саме
аденовіруси, коронавіруси обох груп (HKU1/OC43 та NL63/229E),
метапневмовіруси та риновіруси. Високий відсоток виявлених
негативних зразків пов’язаний з тим, що доступні до використання
діагностичні набори здатні виявляти лише найбільш поширені збудники
ГРВІ.
4. Ізоляти вірусів грипу A(H1N1)pdm чотирьох епідемічних сезонів
суттєвих мутацій в генах поверхневих білків вірусів не набули. Всі
досліджувані ізоляти залишались антигенно подібними до вакцинного
штаму A/California/07/2009pdm, що підтверджено філогенетичним
аналізом.
126
5. Віруси грипу А(H3N2) й надалі чітко утримуються в людській популяції
за допомогою антигенного дрейфу, який відбувається в генах
поверхневих антигенів вірусу. Так ізоляти епідемічного сезону
2013-2014 рр. були більш подібні до вакцинного штаму A/Texas/50/2012,
а вже ізоляти наступного епідемічного сезону антигенно подібні до
нового вакцинного штаму A/Switzerland/9715293/2013.
6. Виявлено, що на відміну від широкого розповсюдження вірусів грипу В
двох генетичних гілок у світі, в Житомирській області в різних
епідемічних сезонах (2010-2011 рр. та 2014-2015 рр.) виявлялись віруси
грипу В різних генетичних гілок. Показано, що ізоляти сезону
2010-2011 рр. є більш подібними до референс-штаму B/Hong
Kong/514/2009. Ізоляти сезону 2014-2015 рр. виявились більш подібними
до нового вакцинного штаму епідемічного сезону 2015-2016 рр.
B/Phuket/3073/2013, ніж до вакцинного штаму даного епідемічного сезону
2014-2015 рр. B/Massachusetts/02/2012.
7. Вперше, на прикладі двох епідемічних сезонів протягом 2009-2015 рр.,
показано моноциркуляцію штамів вірусів грипу (епідемічні сезони
2012-2013 рр. (А(H1N1)pdm) та 2013-2014 рр. (A(H3N2)), хоча в різних
країнах світу в даних епідемічних сезонах спостерігалась ко-циркуляція
всіх трьох штамів вірусів грипу.