Дудар Людмила Валеріївна Молекулярно-біологічна характеристика ізо­лятів цирковірусу свиней 2 типу, ідентифікованих в Укра­їні : Дударь Людмила Валерьевна Молекулярно-биологическая характеристика изолятов цирковирус свиней 2 типа, идентифицированных в Украине

Краткое описание

Дудар Людмила Валеріївна, завідувач лабораторії молекулярної діагностики ТОВ «Центр ветеринарної діа­гностики»: «Молекулярно-біологічна характеристика ізо­лятів цирковірусу свиней 2 типу, ідентифікованих в Укра­їні» (03.00.06 - вірусологія). Спецрада Д 26.001.14 у Київ­ському національному університеті імені Тараса Шевченка

Київський національний університет імені Тараса Шевченка
Міністерство освіти і науки України
Київський національний університет імені Тараса Шевченка
Міністерство освіти і науки України
Кваліфікаційна наукова
праця на правах рукопису
ДУДАР ЛЮДМИЛА ВАЛЕРІЇВНА
УДК: 575.86 + 578.832.1
ДИСЕРТАЦІЯ
МОЛЕКУЛЯРНО-БІОЛОГІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА
ІЗОЛЯТІВ ЦИРКОВІРУСУ СВИНЕЙ 2 ТИПУ,
ІДЕНТИФІКОВАНИХ В УКРАЇНІ
03.00.06 – вірусологія
біологічні науки
Подається на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
Дисертація містить результати власних досліджень. Використання ідей,
результатів і текстів інших авторів мають посилання на відповідне джерело
_______________Дудар Л.В.
Науковий керівник: Поліщук Валерій Петрович, доктор біологічних наук,
професор
Київ 2019

ЗМІСТ
Стор.
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ………………………………………... 11
ВСТУП………………………………………………………………………... 12
РОЗДІЛ 1 ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ……………………………………………. 19
1.1. Загальна характеристика цирковірусу свиней 2 типу……………… 19
1.1.1. Таксономічне положення та філогенетичні зв’язки цирковірусу
свиней 2 типу………………………………………………………… 20
1.1.2. Молекулярна організація та особливості функціонування геному
ЦВС2………………………………………………………………… 23
1.1.3. Будова ЦВС2 та функції окремих компонентів вірусу……………. 24
1.2. Характеристика та особливості цирковірус-асоційованих
синдромів свиней……………………………………………………. 26
1.2.1. Розповсюдження цирковірус-асоційованих синдромів свиней …... 27
1.2.2. Джерела та шляхи передачі цирковірусу свиней 2 типу…………... 28
1.3. Патогенез цирковірус-асоційованих синдромів свиней…………… 29
1.3.1. Вірус-залежні фактори розвитку ЦАСС……………………………. 31
1.3.2. Хазяїн-залежні фактори розвитку ЦАСС…………………………... 32
1.3.3. Вплив коінфекцій на розвиток окремих ЦАСС……………………. 33
1.3.4. Вплив імуномодуляції тварин на розвиток ЦАСС………………… 35
1.4. Клінічна картина цирковірус-асоційованих синдромів свиней…… 35
1.4.1. Цирковірус-асоційована системна інфекція свиней……………….. 36
1.4.2. Цирковірус-асоційований синдром дерматито-нефропатії свиней.. 38
1.4.3. Цирковірус-асоційовані респіраторні захворювання свиней……… 40
1.4.4. Цирковірус-асоційовані репродуктивні порушення та аборти……. 41
1.5. Особливості перебігу інфікування ЦВС2 в популяціях диких
кабанів………………………………………………………………... 43
РОЗДІЛ 2 МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ………………………………………... 45
2.1. Об’єкт дослідження та його характеристика……………………….. 45
8
2.1.1. Загальна характеристика об’єкту дослідження…………………….. 45
2.1.2. Аналіз морфолого-потологічного стану уражених свиней та відбір
зразків для досліджень………………………………………………. 46
2.2. Реактиви, матеріали та обладнання, що були використані в роботі. 47
2.3. Молекулярно-біологічні методи дослідження……………………... 49
2.3.1. Конструювання і підбір праймерів та зондів для проведення ПЛР
та ПЛР в реальному часі……………………………………………. 49
2.3.2. Виділення РНК та ДНК з патологічного матеріалу свиней……….. 50
2.3.3. Проведення полімеразної ланцюгової реакції……………………… 51
2.3.4. Проведення ПЛР в режимі реального часу………………………… 52
2.3.5. Проведення електрофоретичного аналізу продуктів реакцій в
агарозному гелі………………………………………………………. 52
2.3.6. Очищення продуктів ПЛР з агарозного гелю……………………… 53
2.3.7. Аналіз і інтерпретація результатів отриманих при проведенні
ПЛР в реальному часі……………………………………………..… 53
2.3.8. Філогенетичний аналіз та побудова філогенетичних дерев………. 54
2.4. Гістологічні методи дослідження…………………………………… 54
2.4.1. Виготовлення гістологічних зразків………………………………... 54
2.4.2. Мікроскопіювання і аналіз………………………………………….. 56
2.5. Імуногістохімічний метод дослідження зразків тканин…………… 56
2.5.1. Підготовка тканин органів………………………………………….. 56
2.5.2. Проведення імуногістохімічної реакції……………………………. 57
2.6. Статистична обробка результатів…………………………………... 58
РОЗДІЛ 3 ІДЕНТИФІКАЦІЯ ЦИРКОВІРУСУ СВИНЕЙ 2 ТИПУ В
УКРАЇНІ………………………………………………………………………. 59
3.1. Характеристика патолого-анатомічного стану тварин,
відібраних для досліджень в період 2007-2012 рр. ……………… 59
3.2. Молекулярно-генетичні дослідження патологічного матеріалу….. 62
3.2.1. Характеристика праймерів, підібраних для проведення ПЛР……. 62
3.2.2. Ідентифікація ЦВС2 у зразках, відібраних від свиней різних
9
вікових груп та різних областей України………………………….. 68
3.2.3. Виявлення ДНК цирковірусу свиней 2 типу у патологічному
матеріалі окремих органів, відібраних від хворих свиней………… 72
3.2.4. Ефективність виявлення ДНК ЦВС2 методом ПЛР…..………….. 75
3.2.5. Визначення специфічності експрес-методів виявлення ЦВС2,
розроблених на основі ПЛР ………………………………………… 76
РОЗДІЛ 4 ВИВЧЕННЯ ФІЛОГЕНЕТИЧНИХ ОСОБЛИВОСТЕЙ ТА
ПОШИРЕННЯ ЦИРКОВІРУСУ СВИНЕЙ 2 ТИПУ СЕРЕД
СВІЙСЬКИХ ТА ДИКИХ ТВАРИН НА ТЕРИТОРІЇ УКРАІНИ………... 78
4.1. Поширення цирковірусу свиней 2 типу в Україні в період 2007-
2012 рр.………………………………………………………………. 78
4.2. Філогенетичний аналіз ізолятів ЦВС-2, ідентифікованих в Україні 83
4.2.1. Встановлення еволюційних звязків виділенних ізолятів ЦВС2….. 84
4.2.2. Генетична характеристика цирковірусу свиней типу 2,
детектованого від диких кабанів з різних регіонів України……….. 88
РОЗДІЛ 5 РОЗРОБКА КОМПЛЕКСНОГО ПІДХОДУ ДО
ДІАГНОСТИКИ ЦВС-АСОЦІЙОВАНИХ ЗАХВОРЮВАНЬ…………….. 94
5.1. Виявлення ЦВС2 в патологічному матеріалі свиней методом ПЛР
в реальному часі…………………………..……………….................. 95
5.1.1. Характеристика праймерів та зондів, що були використані для
проведення ПЛР в режимі реального часу…………………………. 95
5.1.2. Виявлення ДНК цирковірусу свиней 2 типу в ліофілізованих
сироватках крові від свиней………………………………………… 99
5.1.3. Ідентифікація ЦВС2 в зразках від свиней з респіраторною
патологією в 2014-2015 роках …………..…………..…………….. 101
5.2. Гістологічні дослідження патологічного матеріалу……………... 103
5.2.1. Гістологічний аналіз патологічних змін у тканинах уражених
тварин……………………………………………..………………… 103
5.3. Диференційне виявлення ЦВС2 в зразках абортованих плодів
від свиней методом ПЛР та імуногістохімії за одночасного
10
інфікування вірусом РРСС……………..……………………..…… 110
РОЗДІЛ 6 АНАЛІЗ ТА УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ………………... 115
ВИСНОВКИ…………………………………………………………………... 126
ПЕРЕЛІК ПОСИЛАНЬ………………………………………………………. 128

Список литературы

ВИСНОВКИ
В дисертації була вирішена науково-практична проблема – досліджені
молекулярно-біологічні та філогенетичні особливості та поширення ізолятів
ЦВС2 в Україні. Розроблено комплексний підхід до діагностики цирковірусасоційованих синдромів у патологічному матеріалі шляхом молекулярнобіологічного, гістологічного та імуногістохімічного аналізів, що дозволить
швидко діагностувати збудник, оцінювати епізоотичну ситуацію для
впровадження адекватної схеми вакцинопрофілактики, оцінювати
ефективність застосованих профілактичних засобів та заходів біобезпеки для
попередження розповсюдження ЦВС2 територією України.
1. Вперше ідентифіковано ЦВС2 у 20 із 24 областей України та АР Крим.
Проведена оцінка розповсюдження вірусу, дозволяє стверджувати, що рівень
поширення ЦВС2 в Україні сягає 41 %.
2. ЦВС2 є поширеним вірусом в України, найбільшу кількість випадків
захворювання зафіксовано у Дніпропетровській, Донецькій, Київській,
Полтавській, Черкаській та Чернігівській областях, в яких частота виявлення
коливалась від 26,9 до 51,7%. В Житомирській, Івано-Франківській,
Хмельницькій та Рівненській областях – ЦВС2 ідентифіковано не було.
3. Філогенетичний аналіз українських ізолятів ЦВС2 від свійських тварин
засвідчив належність вірусів до групи 1 (ЦВС2-1ab), і до групи 2 (ЦВС2-2b).
4. Встановлені еволюційні зв'язки між ізолятами, виділеними від свійських
свиней та диких кабанів з однакових регіонів України вказують на те, що
більшість з них має різне походження і належать до різних підгруп. Однак
ізоляти з Харківської області є високогомологічними, що може бути
спричинено безпосередньою передачею ЦВС2 між кабанами та
сільськогосподарськими тваринами.
5. Розроблений нами універсальний молекулярно-біологічний підхід із
використанням праймерів CVSTL_1F та CVSTL_3R дозволяє ефективно
виявляти цирковірус свиней 2 типу методом ПЛР у матеріалі різних тканин.
127
Він є високоспецифічним, оскільки забезпечує диференційне виявлення саме
цього вірусу, навіть від таких близькоспоріднених вірусів як ЦВС1 та BFDV.
6. Для діагностики ЦВС2 найбільш доцільно відбирати зразки
лімфатичних вузлів та кишковика, або ж проводити діагностування
об’єднаних зразків вказаних органів.
7. Експрес-метод виявлення генетичного матеріалу ЦВС2 на основі
кількісної полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі з використанням
праймерів PCVLD_F і PCVLD_R та ДНК-зондів PCVLD_probe1 й
PCVLD_probe2 дозволяє виявляти цирковірус свиней 2 типу у матеріалі різних
тканин від тварин різного віку без хибно-позитивних та хибно-негативних
результатів і забезпечує високий рівень ефективності.
8. Для комплексної діагностики всіх ЦВС2-асоційованих синдромів
рекомендуємо підхід, що поєднує результати, отримані на основі ПЛР в
реальному часі з даними гістологічного та імуногістохімічного аналізу.