Шевченко Тетяна Петрівна Молекулярна епідеміологія вірусів овочевих культур України : Шевченко Татьяна Петровна Молекулярная эпидемиология вирусов овощных культур Украины

Краткое описание

Шевченко Тетяна Петрівна, доцент кафедри вірусо­логії Київського національного університету імені Тараса Шевченка: «Молекулярна епідеміологія вірусів овочевих культур України» (03.00.06 - вірусологія). Спецрада Д
у Київському національному університеті імені Тараса Шевченка

Київський національний університет імені Тараса Шевченка
Міністерство освіти і науки України
Київський національний університет імені Тараса Шевченка
Міністерство освіти і науки України
Кваліфікаційна наукова
праця на правах рукопису
ШЕВЧЕНКО ТЕТЯНА ПЕТРІВНА
УДК: 578.85/.86: 578.2
ДИСЕРТАЦІЯ
МОЛЕКУЛЯРНА ЕПІДЕМІОЛОГІЯ ВІРУСІВ ОВОЧЕВИХ КУЛЬТУР
УКРАЇНИ
03.00.06 - вірусологія
Подається на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук
Дисертація містить результати власних досліджень. Використання ідей,
результатів і текстів інших авторів мають посилання на відповідне
джерело
_________Т.П. Шевченко
Науковий консультант д. б. н., професор
Київ - 2019

ЗМІСТ
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ
ВСТУП
РОЗДІЛ 1 СПЕКТР ВІРУСІВ РОСЛИН, ЩО ІНФІКУЮТЬ
ОВОЧЕВІ КУЛЬТУРИ
РОЗДІЛ 2 МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ДЕЯКИХ
ВІРУСІВ ОВОЧЕВИХ КУЛЬТУР
РОЗДІЛ 3 ЕПІДЕМІОЛОГІЧНІ АСПЕКТИ ВІРУСІВ ОВОЧЕВИХ
КУЛЬТУР
РОЗДІЛ 4 МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
4.1. Віруси
4.2. Відбір зразків та підготовка рослинного матеріалу для проведення
імуноферментного аналізу
4.3. Підготовка насіння для детекції вірусних антигенів методом ІФА
4.4 Тестування передачі ізолятів вірусів насінням
4.5 Біотестування на рослинах-індикаторах
4.6. Імуноферментний аналіз у модифікації «сендвіч»
4.7. Непрямий імуноферментний аналіз
4.8. Приготування препаратів для електронної мікроскопії
4.9. Виділення тотальної РНК
4.10. Зворотньотранскрипційна полімеразна ланцюгова реакція в один
крок
4.11 Зворотньотранскрипційна полімеразна ланцюгова реакція в два
кроки
4.12. Горизонтальний електрофорез нуклеїнової кислоти
4.13. Очищення продуктів ЗТ-ПЛР
4.14. Сиквенування ДНК
4.15. Філогенетичний аналіз нуклеотидних та амінокислотних
23
31
50
59
71
71
71
71
72
72
73
73
75
75
76
77
80
81
82
84
84
20
послідовностей
4.16. Статистична обробка результатів
РОЗДІЛ 5 ІДЕНТИФІКАЦІЯ ВІРУСІВ У ЗРАЗКАХ РОСЛИН
ОВОЧЕВИХ КУЛЬТУР
5.1 Різноманіття вірусоподібних симптомів на рослинах овочевих
культур
5.2 Видовий спектр вірусів ідентифікованих у зразках рослин
овочевих культур за допомогою імуноферментного аналізу
5.2.1. Аналіз рослин овочевих культур родини Solanaceae на наявність
вірусних антигенів
5.2.2 Детекція Cucumber mosaic virus в агроценозах України
5.2.3 Детекція Zucchini yellow mosaic virus в агроценозах України
5.2.4 Детекція Watermelon mosaic virus 2 в агроценозах України
5.2.5 Детекція Cucumber green mottle mosaic virus в агроценозах
України
5.2.6 Детекція Turnip mosaic virus в агроценозах України
РОЗДІЛ 6 ЗМІШАНІ ВІРУСНІ ІНФЕКЦІЇ ОВОЧЕВИХ КУЛЬТУР
РОЗДІЛ 7 НАСІННЯ ЯК ОДНЕ З ДЖЕРЕЛ ВІРУСІВ ОВОЧЕВИХ
КУЛЬТУР В УКРАЇНІ
7.1 Тестування насіння овочевих культур родини Solanaceae на
вірусоносійство
7.2 Перевірка насіння Cucurbataceae на присутність CGMMV
7.3 Встановлення насіннєвої передачі ZYMV
РОЗДІЛ 8 МОЛЕКУЛЯРНО-ЕПІДЕМІОЛОГІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ
ВІРУСНИХ ІНФЕКЦІЙ ОВОЧЕВИХ КУЛЬТУР В УКРАЇНІ
8.1 Філогенетичний аналіз ізолятів Watermelon mosaic virus 2
8.2 Філогенетичний аналіз ізолятів Zucchini yellow mosaic virus
8.3 Філогенетичний аналіз ізолятів Сucumber mosaic virus
8.4 Філогенетичний аналіз ізолятів Тomato mosaic virus
84
86
86
92
92
100
103
105
109
114
122
136
136
140
144
151
151
168
186
218
21
8.5 Філогенетичний аналіз ізолятів Рepper mild mottle mosaic virus
8.6 Філогенетичний аналіз ізолятів Turnip mosaic virus
РОЗДІЛ 9 АНАЛІЗ ТА УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
ДОСЛІДЖЕННЯ
ВИСНОВКИ
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ
ДОДАТОК А
227
231
251
282
286
325

Список литературы

ВИСНОВКИ
У дисертаційній роботі представлені нові підходи до вирішення
актуальної науково-біологічної проблеми, а саме - розроблена концепція
контролю вірусних інфекцій овочевих культур, що базується на
встановлених молекулярно-біологічних властивостях вірусів та
епідеміологічних закономірностях розвитку і поширення вірусних
інфекцій.
1. Вперше встановлений спектр вірусів, що є представниками
родин Virgaviridae (PMMoV, ToMV, CGMMV, TRV), Bromoviridae
(CMV), Potyviridae (PVY, ZYMV, WMV-2, TuMV) та
Alphaflexiviridae (PVX), які з урахуванням екологічних умов та
біологічних властивостей є актуальними та шкодочинними для
овочевих культур України та Європи. Вперше в Україні описані
віруси PMMoV та TuMV, встановлені їх рослини-хазяї та вивчені
способи передачі вірусів, які є небезпечними для широкого кола
рослин агроценозів.
2. Вперше показано поширення змішаних вірусних інфекцій,
які супроводжуються більш суворими візуальними симптомами
захворювання і втратами комерційної продукції, та встановлені
типові групи вірусів, що їх викликають в Україні: ZYMV/WMV-2,
CMV/ZYMV/WMV-2, CMV/ToMV/PVY та TuMV/CMV. Частота
виявлення вірусів у моноінфекції варіює у межах 1-30%, а у
змішаній інфекції – 2-34% для різних вірусів, що визначається їх
епідеміологічними властивостями, видом рослин-хазяїв, а також
умовами вирощування культури.
3. Вперше в Україні встановлено нове джерело ZYMV та
підтверджено здатність вірусу передаватися насінням з
283
ефективністю у 2,6%. Обгрунтовано, що насіння овочевих культур є
одним із важливих та недооцінених джерел вірусів в екосистемах.
Встановлено, що в екологічних умовах України насіннєвий шлях
передачі є актуальним, потребує відповідного контролю для ряду
вірусів (CGMMV, ZYMV, ToMV та CMV) і становить особливу
небезпеку для вірусів із широким колом рослин-хазяїв, а саме CMV
та ToMV.
4. Продемонстрована консервативність генетичних
послідовностей більшості вивчених вірусів. Підтверджена
домінуюча роль точкових мутацій, синонімічних амінокислотних
замін та стабілізуючого добору в еволюції вірусних популяцій в
Україні.
5. Встановлена генетична однорідність українських популяцій
вірусів WMV-2, ZYMV, PMMoV та ToMV, і подібність їх ізолятів
до відомих штамів цих вірусів. Виявлені унікальні амінокислотні
заміни білка 2b у українських ізолятів CMV і продемонстровано, що
популяція цього вірусу в Україні є більш гетерогенною, ніж у інших
європейських країнах і представлена різними генетичними групами.
6. Вперше встановлено, що філогенетична спорідненість
українських ізолятів вірусів овочевих культур не залежить від
географічного походження та рослини-хазяя, що має
епідеміологічне значення, свідчить про інтенсивну циркуляцію
вірусів в Україні і може бути використане для оптимізації
діагностичних тест-систем.
7. Вперше знайдені нові рекомбінантні ізоляти шкодочинних
вірусів WMV-2 та TuMV, що свідчить про активні еволюційні
процеси та обмін генетичним матеріалом вірусів в Україні. За
результатами аналізу послідовності повного геному встановлено,
284
що український ізолят TuMV UKR9 є нетиповим для Європи
рекомбінантом двох різних генетичних груп і має один
рекомбінаційний сайт у гені HC-Pro, який не був описаний раніше.
Показано, що рекомбінантний український ізолят TuMV UKR9
здатний системно інфікувати рослини двох основних родів
хрестоцвітих Brassica та Raphanus, і становить потенційну
небезпеку в епідеміологічному аспекті.
8. Підтверджено кореляцію генетичних ознак українських
ізолятів вірусів з їх вірулентністю щодо овочевих культур.
Встановлено, що українські ізоляти ZYMV, WMV-2, PMMoV не
належать до високовірулентних штамів. За комплексом біологічних
та молекулярно-епідеміологічних ознак встановлено, що ToMV,
TuMV та CMV потенційно є найбільш небезпечними вірусами, які
загрожують вирощуванню овочевих культур в Україні.
9. Вперше доведено значне поширення TuMV в міських
екосистемах, де супутні культурні та дикорослі рослини є
резервуарами для збереження популяції вірусу та його передачі
механічно та літаючими векторами. Показано, що даний фактор має
виключно важливе значення для епідеміології TuMV в Україні, не
зважаючи на ефективність класичних заходів контролю вірусних
захворювань.
10. Розроблений концептуальний підхід до ефективного та
рентабельного контролю вірусних інфекцій овочевих культур
України з урахуванням епідеміологічних властивостей вірусів, їх
епідеміологічного потенціалу (способами передачі і збереження у
довкіллі, вірулентністю та ін.), типом сприйнятливої культури та
умовами її вирощування, і включає контроль насіннєвого матеріалу
на вірусоносійство; тестування супутніх дикорослих рослин, які
285
можуть виступати резервуарами вірусів з широким спектром
рослин-хазяїнів в екосистемах; та тестування культурних рослин
для видалення інфікованих рослин