Щетиніна Ганна Сергіївна Молекулярно-біологічна характеристика нового для України Х-вірусу хости

Краткое описание

Щетиніна Ганна Сергіївна, вчитель біології загально­освітнього навчального закладу І - ІІІ ступенів «Середня загальноосвітня школа № 242» Подільського району м. Киє­ва: «Молекулярно-біологічна характеристика нового для України Х-вірусу хости» (03.00.06 - вірусологія). Спецрада Д 26.001.14 у Київському національному університеті імені Тараса Шевченка

Київський національний університет імені Тараса Шевченка
Міністерство освіти і науки України
Київський національний університет імені Тараса Шевченка
Міністерство освіти і науки України
Кваліфікаційна наукова
праця на правах рукопису
ЩЕТИНІНА ГАННА СЕРГІЇВНА
УДК 578.85/86
ДИСЕРТАЦІЯ
МОЛЕКУЛЯРНО - БІОЛОГІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА НОВОГО ДЛЯ
УКРАЇНИ Х-ВІРУСУ ХОСТИ
03.00.06 – ВІРУСОЛОГІЯ
Подається на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
Дисертація містить результати власних досліджень. Використання ідей,
результатів і текстів інших авторів мають посилання на відповідне джерело
___________________________
Науковий керівник: Будзанівська Ірина Геннадіївна, доктор біологічних наук,
професор
КИЇВ – 2018

ЗМІСТ
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ 13
ВСТУП 16
РОЗДІЛ 1 ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
1.1 Загальна характеристика хости (Hósta spp) 21
1.2 Шкідники та патогени хости 25
1.3 Х-вірус хости – небезпечний патоген 26
1.4 Механізми поширення та симптоми ХВХ 27
1.5 Характеристика генома, фізико-хімічні
1.6 властивості віріонів та стратегія реплікації ХВХ 34
1.7 Філогенетични зв'язок між різними ізолятами ХВХ 37
1.8 Методи детекції ХВХ 43
РОЗДІЛ 2 МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
2.1 Матеріали дослідження 46
2.2 Метод візуальної діагностики рослин хости 52
2.3 Імуноферментний аналіз 53
2.4 Виділення тотальної РНК 54
2.5 Виділення вірусної РНК методом імунного захопленням 56
2.6 Зворотньотранскрипційна полімеразна ланцюгова реакція 56
2.7 Електрофорез в агарозному гелі 57
2.8 Виділення, очистка та концентрація вірусу
методом диференційного центрифугування 58
2.9 Метод електронної мікроскопії 59
2.10 Спектрофотометричне визначення концентрації
та чистоти вірусного препарату 60
2.11 Електрофорез в поліакриламідному гелі за Леммлі 60
2.12 Імуноелектроблотинг 61
2.13 Імунізація лабораторних тварин 62
2.14 Отримання, приготування та титрування кролячої
12
антивірусної сироватки 62
2.15 Визначення спектру рослин-індикаторів
методом біотестування 64
2.16 Дослідження здатності Х-вірусу хости
до насіннєвої передачі 65
2.17 Виділення субматричної РНК (18s & 28s) 66
2.18 Приготування ДНК - бібліотек 66
2.19 Філогенетичний аналіз 69
2.20 Визначення впливу добору 70
2.21 Статистична обробка 71
РОЗДІЛ 3 ПЕРВИННА ДЕТЕКЦІЯ ХВХ ХОСТИ В УКРАЇНІ 73
РОЗДІЛ 4 ОТРИМАННЯ СПЕЦИФІЧНОЇ
АНТИСИРОВАТКИ ДО ХВХ 79
РОЗДІЛ 5 СКРИНІНГ КОЛЕКЦІЙ ХОСТИ 85
РОЗДІЛ 6 БІОЛОГІЧНЕ ТЕСТУВАННЯ УКРАЇНСЬКОГО ІЗОЛЯТУ
ХВХ, ВСТАНОВЛЕННЯ СПЕКТРУ РОСЛИН-ІНДИКАТОРІВ
ТА МОЖЛИВИХ ШЛЯХІВ ПЕРЕДАЧІ 94
РОЗДІЛ 7 ФІЛОГЕНЕТИЧНИЙ АНАЛІЗ Х - ВІРУСУ ХОСТИ 98
АНАЛІЗ ТА УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ 115
ВИСНОВКИ 119
СПИСОК ПОСИЛАНЬ 121
ДОДАТКИ 131
13
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ
Аг Антиген
Ат Антитіло
Ат2 Антивидові антитіа
ЕМ Електронний мікроскоп
ЗТ - ПЛР Полімеразна ланцюгова реакція зі зворотньою транскрипцією
(RT- PCR - reverse transcription polymerase chain reaction)
ІФА Імуноферментний аналіз
КБК Карбонатний буфер
ПЕГ Поліетиленгліколь
ПЛР Полімеразна ланцюгова реакція
ТТІ Точка температурної інактивації
ХВХ Х-вірус хости (HVX - Hosta Virus X)
ArMV Вірус мозаїки резухи (Arabis mosaic virus)
AltMV Вірус мозаїки альтернантерії (Alternanthera mosaic virus)
BLAST Базова програма порівняльного пошуку послідовностей (Basic
Local Aligment Search Tool)
CLUSTALW Функція для вирівнювання послідовностей
CP Білок оболонки (Coat protein)
CsCMV Вірус мозаїки маніоки (Cassava common mosaic virus)
CLBV Вірус плямистості цитрусового лисття (Citrus leaf blotch virus)
CVX Х-вірус кактусу (Cactus virus X)
EPPO Європейська організація захисту рослин (European and
Mediterranean Plant Protection Organization)
FEL метод визначення ймовірності фіксованих ефектів (the fixedeffects likelihood method)
FUBAR метод визначення швидкої природньої апроксимації Баєса (the
fast unconstrained Bayesian approximation method)
14
HdRSV Вірус кільцевої плямистості гортензії (Hydrangea ringspot virus)
HVX-Kr Корейський ізолят ХВХ (Hosta virus X, Korea)
HVX - 37 Американський ізолят ХВХ (Hosta virus X, USA)
ІFEL Метод визначення внутрішньо фіксованих ефектів (the internal
branch fixed-effects likelihood method)
INSV Вірус некротичної плямистості бальзаміну (Impatiens necrotic
spot virus)
MEGA7 Молекулярно еволюційно генетичний аналіз ( molecular
evolutionary genetics analysis )
MEME Метод визначення впливу добору при змішаній моделі еволюції
(the mixed effects model of evolution method)
NJ Метод об’єднання найближчих сусідів (Neighbor-Joining)
ML Метод максимальної правдоподібності (Maximum Likelihood)
MUSCLE Функція для вирівнювання послідовностей
NCBI Національний центр біотехнологічної інформації (National Center
for Biotechnology Information)
ORF Відкрита рамка зчитування (open reading frame)
PBS Натрій-фосфатний буфер (Phosphate buffered saline)
PiAMV Азіатський вірус мозаїки подорожника (Plantago asiatica mosaic
virus,)
PapMV Вірусом мозаїки папайї (Versatile papaya mosaic virus)
PuTTY Вільно розповсюджуваний клієнт для різних протоколів
віддаленого доступу
RDRP РНК залежна РНК полімераза (RNA-dependent RNA polymerase)
sgRNA single guide RNA
SDS Лаурилсульфат натрія (sodium lauryl sulfate)
SLAС Метод визначення ймовірності одного спільного предка (the
single-likelihood ancestor)
15
TBE Тріс-боратний буфер (Tris/Borate/EDTA buffer)
TGB Потрійний блок генів (Triple gene block)
TRV Вірус брязкотіння тютюну (Tobacco rattle virus)
TSWV Вірус плямистого зів’янення томатів (Tomato spotted wilt virus)
TRSV Вірус кільцевої плямистості тютюну (Tobacco ringspot virus)
ToRSV Вірус кільцевої плямистості томатів (Tomato ringspot virus)
TVX Х-вірус тюльпана (Tulip virus X)
16
ВСТУП
Актуальність теми. Х-вірус хости (ХВХ) – небезпечний патоген, що
належить до родини Alphaflexiviridae, рід Potexvirus, та інфікує хосту. Hosta
tratt – це трав’яниста багаторічна тіневитривала рослина – яскравий
представник родини Liliacea. В Україні рослини хости використовують в
декоративному квітникарстві, озелененні і створенні ландшафтних
композицій. На світовому ринку садових культур рослини хости посідають
перше місце за обсягом збуту [1-3]. Така популярність сприяє збільшенню
кількості нових сортів, яких на сьогодні налічують більше 12 тисяч [4,5].
У комерційних розплідниках є актуальною проблема первинного
інфікування рослин Х-вірусом хости [6]. Масове інфікування рослин
зумовлене механічною трансмісією патогена. Вчасному діагностуванню
збудника перешкоджає тривала безсимптомна персистенція вірусу в
уражених рослинах. З часом на уражених рослинах розвиваються локальні та
системні вірусні симптоми: мозаїка, хлороз, скручування, гофрування,
знебарвлення чи зміна кольору лисття, карликовість. Х-вірус хости був
детектований в багатьох Європейських країнах, на території Південної
Америки, Австралії, Нової Зеландії. Саме тому Європейська організація
захисту рослин (EPPO) внесла Х-вірус хости до переліку потенційно
карантинних збудників [7].
На сьогоднішній день не існує ефективних методів оздоровлення
інфікованих Х-вірусом хости рослин. Досвід західних дослідників
демонструє неефективність хімічних препаратів для боротьби з вірусною
інфекцією. Їх використання приносить шкоду як рослині, знижуючи її
природну здатність протидіяти вірусу, так і здоров’ю людини за рахунок
токсичності та канцерогенності певних її компонентів [1,2,6].
17
Найбільш перспективним методом боротьби з Х-вірусом хости є
попередження його поширення. Рання діагностика дозволить вилучати
інфіковані рослини і вчасно зупинити епідемію [8, 9].
Зважаючи на це, актуальним є вирішення наступних завдань:
встановлення наявності ХВХ в Україні та його циркуляції, вивчення
молекулярно-біологічних характеристик і філогенетичних зв'язків
українського ізоляту з іншими світовими ізолятами, отримання специфічної
антисироватки для ідентифікації збудника.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Робота виконувалась у межах науково-дослідницької роботи кафедри
вірусології ННЦ «Інституту біології» Київського національного університету
імені Тараса Шевченка за темою «Збереження біорізноманіття та комплексне
дослідження стратегій адаптації фіто-, зоо- та віробіоти України з
використанням біоінформаційних технологій». Номер держреєстрації:
0111U004649.
Мета і завдання дослідження. Метою роботи було вивчення
молекулярно-біологічних властивостей українського ізоляту Х-вірусу хости,
встановлення його філогенетичних зав’язків з іншими ізолятами ХВХ,
вивчення особливостей будови генома українського ізоляту ХВХ.
Для досягнення мети були поставлені наступні задачі:
1. Детектувати Х-вірус хости.
2. Отримати специфічну антисироватку для подальшої діагностики Хвірусу хости методом ІФА та ЗТ-ПЛР з імунним захопленням.
3. Провести скринінг колекцій хост ботанічних садів на наявність ХВХ.
4. Дослідити біологічні властивості українського ізоляту ХВХ.
5. Отримати повногеномну послідовність українського ізоляту ХВХ.
6. Провести філогенетичний аналіз та встановити походження
українського ізоляту ХВХ. З’ясування можливих шляхів потрапляння
вірусу в Україну
18
Об’єкт дослідження: Х-вірус хости.
Предмет дослідження :молекулярно-біологічні властивості та
філогенетичний аналіз українського ізоляту Х-вірусу хости.
Методи дослідження: візуальне обстеження колекцій хости, біологічне
тестування, твердофазний імуноферментний аналіз в модифікації
«непрямий», електронна мікроскопія, спектрофотометричне визначення
концентрації та чистоти вірусного препарату, екстракція тотальної РНК,
електрофорез в поліакридамідному гелі за модифікацією Лемлі,
імуноелектроблоттинг, полімеразна ланцюгова реакція зі зворотньою
транскрипцією, електрофорез у агарозному гелі, створення ДНК-бібліотек,
визначення нуклеотидних послідовностей гена білка оболонки
(секвенування), філогенетичний аналіз.
Наукова новизна одержаних результатів. На території України Хвірус хости був детектований вперше. Проведено скринінг ХВХ найбільших
колекцій ботанічних садів України. Були визначені та зареєстровані в NCBI
нуклеотидні послідовності гена білка оболонки українського ізоляту ХВХ
(GenBank KJ406186.1). Філогенетичний аналіз ХВХ показав низький рівень
дивергенції та високий рівень ідентичності ділянки капсидного білка.
Встановлено високий відсоток гомології послідовностей українського ізоляту
з новозеландським, іранським та американським ізолятами, що вказує на
можливі шляхи потрапляння в Україну Х-вірусу хости.
Практичне значення одержаних результатів.
В ході роботи було отримано високоякісну діагностичну сироватку для
діагностики Х-вірусу хости методом ІФА. Також було запропоновано
ефективну методику діагностики ХВХ у тканинах хости методом ІФА.
Отримана повногеномна послідовність ХВХ дозволила вивчити особливості
генома українського ізоляту вірусу. Встановлено еволюційні зв’язки
українського ізоляту з представниками виду та роду вірусу. Розроблено
методичні рекомендації для постановки ЗТ-ПЛР, які будуть
19
використовуватися в навчальному процесі кафедри вірусології Київського
національного університету імені Тараса Шевченка.
Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійною
роботою автора. Всі етапи роботи, в тому числі пошук інформації,
опрацювання літературних джерел, розробка схем експерименту, отримання
експериментних даних, їх узагальнення та інтерпретація автором дисертації,
були здійснені особисто.
Формування основних положень і висновків дисертаційної роботи, а
також підготовка публікацій на основі отриманих результатів проведені за
участю наукового керівника д.б.н., професора І.Г. Будзанівської.
Частину досліджень виконано на базі лабораторії Талліннського
технічного університету, Естонія (зав. лабораторії Ерркі Труве, с.н.с. Меріке
Сомера): виділення субматричних РНК, створення ДНК-бібліотек,
повногеномне секвенування. Автор висловлює щиру подяку естонським
колегам за корисні поради і допомогу в плануванні, проведенні експерименту
та обговоренні результатів.
Апробація результатів
The Conference dedicated to 50-th Anniversary of the Virology Department
«Virology: the past, the present, the future», Kyiv, Ukraine, April 12, 2012:
Diagnostics of Hosta virus X in Ukraine.
VIIth International Conference Bioresources and viruses, Kyiv, Ukraine, Sep.
10-13, 2013: Phylogenetic analysis of Hosta virus X.
Global Virus Network conference of virologists for the Scandinavia-BalticUkraine region. 11th - 13th of June in Laulasma, Estonia.
11th Conference of the European Foundation for Plant Pathology. 8-13
September 2014.Cracow, POLAND. Monitoring of Hosta virus X in Ukraine.
VIIІ International conference «Bioresources and viruses», 12-14th September,
Kyiv, Ukraine, 2016.
20
Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 11 робіт,
які входять до переліку фахових журналів, з них 6 статей, 5 – тези в
матеріалах конференцій. Права співавторів не порушені.
Структура та обсяг дисертації
Дисертаційну робота викладена на 132 сторінках друкованого тексту і
складається зі вступу, огляду літератури, розділу «Матеріали та методи»,
розділу власних досліджень та їх обговорення, аналізу та узагальнення
результатів, висновків, списку літератури (104 посилань), додатків.
Фактичний матеріал дисертації подано у вигляді 45 рисунків і 3-ох таблиць.

Список литературы

ВИСНОВКИ
У результаті виконання дисертаційної роботи було проведено візуальні
обстеження, серологічні та молекулярно-біологічні дослідження Х-вірусу
хости, визначено нуклеотидні послідовності нуклеотидних послідовностей та
здійснено філогенетичний аналіз українського ізоляту; проведено скринінг на
наявність вірусу у ботанічних садах країни з використанням власно
розробленої діагностичної антисироватки.
Головні наукові та практичні результати роботи сформовані у наступних
висновках:
1. Вперше в Україні у 2012 році був детектований Х-вірус хости за
допомогою електронної мікроскопії, серологічних та молекулярнобіологічних методів.
2. Отримано та апробовано антисироватку до Х-вірусу хости. Була
встановлена її специфічність та чутливість (робоче розведення 1:8000 при
титрі 1:16000) для подальшого скринінгу Х-вірусу хости методом ІФА.
3. Проведений скринінг колекцій ботанічних садів м. Києва з
використанням антисироватки до ХВХ виявив, що колекція ботанічного саду
імені Олександра Фоміна КНУ імені Тараса Шевченка не уражена Х-вірусом
хости, натомість було виявлено, що ХВХ активно циркулює та поширюється
в колекції НБС ім. М.М. Гришка НАНУ (5 інфікованих сортів хост з 15
досліджуваних у 2013 році та 15 інфікованих сортів з 68 досліджуваних у
2016 році).
4. Дослідження біологічних властивостей українського ізоляту Хвірусу хости продемонструвало, що вірус уражує тільки рослини тютюну
(Nicotiana benthamiana), вперше було встановленно, що український ізолят
Х-вірус хости здатний передаватися через насіння.
121
5. Філогенетичний аналіз ХВХ показав низький рівень дивергенції
та високий відсоток ділянки капсидного білка (99,6% за нуклеїновими та до
100% за амінокислотними послідовностями). Встановлено високий відсоток
гомології амінокислотних та нуклеотидних послідовностей українського
ізоляту з новозеландським, польським та американським ізолятами, що
вказує на те, що в Україну ХВХ потрапив з рослинами хости селекції однієї з
цих країн.
6. Отримано повногеномну послідовність українського ізоляту Хвірусу хости (6430 bp) та задепоновано в Ген Банк (GenBank: KX033798.1).
Була виявлена мутація (AUG  UUG) у старт кодоні гена білка руху (ORF4),
яка підтверджена повторним сиквенуванням методом Сенгера. Порівняння
повногеномних послідовностей ХВХ вказує на спорідненість українського та
американського ізолятів Х-вірусу хости.