Бабій Світлана Володимирівна Генетичні основи резис­тентності українських ізолятів вірусів грипу А та В до інгібі­торів нейрамінідази

Краткое описание

Бабій Світлана Володимирівна: «Генетичні основи резис­тентності українських ізолятів вірусів грипу А та В до інгібі­торів нейрамінідази» (03.00.06 - вірусологія). Спецрада Д 26.001.14 у Київському національному університеті імені Та­раса Шевченка

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ
КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
Кваліфікаційна наукова
праця на правах рукопису
(наукова доповідь)
Бабій Світлана Володимирівна
Гриф
Прим. № ____
УДК: 578.74+575.22+578.832.1
ДИСЕРТАЦІЯ
ГЕНЕТИЧНІ ОСНОВИ РЕЗИСТЕНТНОСТІ УКРАЇНСЬКИХ
ІЗОЛЯТІВ ВІРУСІВ ГРИПУ ТИПУ А ТА В ДО ІНГІБІТОРІВ
НЕЙРАМІНІДАЗИ
03.00.06 – вірусологія
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
Дисертація містить результати власних досліджень. Використання ідей,
результатів і текстів інших авторів мають посилання на відповідне джерело
___________________________ Бабій С.В.
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор - Поліщук В.П.
Київ – 2017

ЗМІСТ
Стор
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ 6
ВСТУП 8
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ 14
РОЗДІЛ 1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА ВІРУСУ ГРИПУ ТА
ЙОГО ФЕРМЕНТУ НЕЙРАМІНІДАЗИ
14
РОЗДІЛ 2. ІНГІБІТОРИ НЕЙРАМІНІДАЗИ В ЕТІОТРОПНІЙ ТЕРАПІЇ
ГРИПУ
24
2.1 Механізм взаємодії нейрамінідази вірусу грипу із інгібіторами
нейрамінідази
24
2.2 Типо- і субтипоспецифічні мутацій у гені нейрамінідази їх вплив на
резистентність
26
2.3 Роль функціональної взаємодії між NA і НА - баланс NA і НА 34
2.4 Перехресна резистентність вірусів грипу до інгібіторів
нейрамінідази
2.5 Подвійна резистентність вірусів грипу до адамантанів й
оселтамівіру
38
2.6 Біологічні властивості вірусів грипу із зниженою чутливістю до
оселтамівіру
39
РОЗДІЛ 3. АНАЛІЗ АДАПТАЦІЇ ВІРУСІВ ГРИПУ ДО УМОВ
НАВКОЛИШНЬОГО СЕРЕДОВИЩА
42
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА 47
РОЗДІЛ 4. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ 47
4.1 Матеріали та обладнання, використані у роботі 47
4.2 Субкультивування, інфікування культури клітин MDCK і MDCKSIAT, накопичення та ізоляція вірусів грипу
53
5
4.3 Постановка реакції гальмування гемаглютинації (РГГА) 57
4.4 Полімеразна ланцюгова реакція у реальному часі 58
4.5 Аналіз інгібіції нейрамінідази методом MUNANA 59
4.6 Генотиповий аналіз: побудова філогенетичних дерев за допомогою
програми MEGA6 та BEAST та визначення їх чутливості до NAI
60
4.7 Визначення впливу добору методами SLAС, FEL, ІFEL, MEME та
FUBAR
62
4.8 Статистична обробка результатів 63
РОЗДІЛ 5. ВИДІЛЕННЯ, ІНДИКАЦІЯ ТА ІДЕНТИФІКАЦІЯ ВІРУСІВ
ГРИПУ, ЩО ЦИРКУЛЮВАЛИ В УКРАЇНІ З 2009 ПО 2015 РОКИ
64
РОЗДІЛ 6. ЕВОЛЮЦІЙНА ДИНАМІКА ГЕНУ NA ВІРУСІВ ГРИПУ
ТИПУ А ТА В
69
6.1 Генетична характеристика українських ізолятів вірусів грипу А та В,
виділених у епідемічні сезони з 2009 по 2015 рр.
69
6.2 Результати впливу природного добору на ген нейрамінідази вірусів
грипу
84
РОЗДІЛ 7. АНАЛІЗ ЧУТЛИВОСТІ ДО ІНГІБІТОРІВ
НЕЙРАМІНІДАЗИ УКРАЇНСЬКИХ ІЗОЛЯТІВ ВІРУСІВ ГРИПУ,
ВИДІЛЕНИХ З 2009 ПО 2015 РОКИ
100
УЗАГАЛЬНЕННЯ 113
ВИСНОВКИ 123
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ 125
ДОДАТКИ 141
Додаток 1 141
Додаток 2 142
Додаток 3 143
Додаток 4 144
6
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ
ВООЗ – Всесвітня організація охорони здоров`я
ІХА – імунохроматографічний аналіз
КК – культура клітин
ПЛР – полімеразна ланцюгова реакція
РАМН – Російська академія медичних наук
ЦПД – цитопатична дія
НА – гемаглютиніни
НАМНУ – Національна академія медичних наук України
BEAST – програма для побудови філогенетичних дерев
(the Bayesian Evolutionary Analysis Sampling Trees)
dN – кількість несинонімічних заміщень
dS – кількість синонімічних заміщень
FEL – метод визначення ймовірності фіксованих ефектів (the
fixed-effects likelihood method)
FUBAR – метод визначення швидкої природньої апроксимації
Баєса (the fast unconstrained Bayesian approximation
method)
GISAID – глобальна ініціатива поширення всіх даних по грипу
(the Global Initiative on Sharing All Influenza Data)
HKG – назва моделі для побудови філогенетичного дерева
ІFEL – метод визначення внутрішньо фіксованих ефектів (the
internal branch fixed-effects likelihood method)
Jones-TaylorThornton (JTT)
– назва моделі для побудови філогенетичного дерева
NA, NAs – нейрамінідаза, нейрамінідази
NAІ – інгібітори нейрамінідази
7
NeuAc N – ацетилнейрамінова кислота
NJ – метод об’єднання найближчих сусідів (NeighborJoining)
MEGA 6 – програма для побудови філогенетичних дерев
MEME – метод визначення впливу добору при змішаній моделі
еволюції (the mixed effects model of evolution method)
ML – метод максимальної правдоподібності (Maximum
Likelihood)
SLAС – метод визначення ймовірності одного спільного
предку (the single-likelihood ancestor)
8
ВСТУП
Мінливість вірусів грипу досліджують вчені світових та регіональних
центрів грипу, особливо в країнах, у яких умови найбільш сприятливі для появи
нових штамів [1]. Варіабельність антигенних і біологічних властивостей ізолятів
вірусів грипу забезпечується завдяки механізмам антигенного дрейфу
(накопичення точкових мутації) та антигенного шифту (обмін генетичними
сегментами) і добором на їх основі [1, 2].
Вивчення чутливості вірусів грипу до протигрипозних препаратів,
зокрема інгібіторів нейрамінідази, є вкрай важливим, оскільки на сьогодні це
практично єдиний клас препаратів з підтвердженою антивірусною активністю
проти вірусів грипу типу А та В [3]. Оскільки адамантани (амантадин та
ремантадин) не рекомендовані до застосування у зв’язку із резистентністю
вірусів грипу типу А, що закріпилась на генетичному рівні [4], а віруси грипу
типу В взагалі не чутливі до них, тому моніторинг чутливості вірусів грипу до
інгібіторів нейрамінідази (NAI), дослідження причин та механізмів появи
стійкості до них є запорукою вчасного адекватного застосування цих препаратів
з лікувальною метою.
Швидке збільшення кількості сиквенованих геномів вірусів грипу із
різних країн світу разом із розвитком біоінформатичних методів, особливо
філогенетичного аналізу, та методів дослідження впливу добору на основі
нуклеотидних послідовностей, зробили можливим більш комплексний аналіз
генетичних особливостей вірусів грипу [5]. За останні роки філогенетичний
аналіз став одним із важливих елементів епідеміологічного нагляду, за
допомогою нього визначають спорідненість вірусів грипу до вакцинних та
референс-штамів (або інших, вже відомих) [6]. У досліджені відображені
еволюційні зв’язки українських вірусів грипу із ізолятами з інших куточків
світу. Незважаючи на те, що на сьогодні існує багато досліджень впливу
9
позитивного добору на гени вірусів грипу людини, взаємозв’язки між позитивно
відібраними сайтами та антигенною варіабельності вірусу і чутливістю до
інгібіторів нейрамінідази досі не зрозумілі [7, 8, 9]. Для відповіді на це питання
було проведено аналіз впливу позитивного добору на послідовності гену NA
вірусів грипу. У роботі досліджено дію добору на ізоляти вірусів грипу,
виділених в Україні за досліджуваний період.
Генетичний аналіз послідовностей гену NA вірусів грипу на наявність
мутацій, асоційованих із резистентністю, успішно застосовується вченими
світових та регіональних референс-лабораторій для визначення чутливості
вірусів грипу до інгібіторів нейрамінідази. Для формування остаточних
висновків щодо чутливості ізолятів до цих препаратів результати генетичного
аналізу зазвичай підтверджують дослідженнями функціональної активності
нейрамінідази [10]. У роботі було вивчено чутливість українських ізолятів за
останні шість років до інгібіторів нейрамінідази.
У виконаній роботі вперше в Україні досліджується вплив добору на
варіабельність гену нейрамінідази вірусів грипу людей та на появу стійкості до
інгібіторів нейрамінідази.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Дисертаційна робота виконувалась у межах науково-дослідної роботи кафедри
вірусології ННЦ «Інститут біології » Київського національного університету
імені Тараса Шевченка за темою «Збереження біорізноманіття та комплексне
дослідження стратегій адаптації фіто-, зоо- та віробіоти України з
використанням біоінформаційних технологій» (№ держреєстрації
0111U004649); та пов’язана з роботами, виконаними у відділі респіраторних та
інших вірусних інфекцій ДУ «Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім.
Л.В. Громашевського НАМН України» у рамках науково-дослідних робіт
«Розробити програму етіологічного прогнозування епідемій грипу в Україні»
(№ держреєстрації 0114U000383) - 2014 – 2016 рр..
10
Мета та завдання дослідження. Дослідити вплив добору на формування
різноманітності вірусів грипу та ідентифікація специфічних мутацій,
асоційованих із резистентністю до інгібіторів нейрамінідази, у гені
нейрамінідази українських вірусів грипу.
Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:
1. Ізолювати та ідентифікувати віруси грипу в епідемічних сезонах з 2009
по 2015 рр.
2. Визначити загальне значення співвідношення несинонімічних до
синонімічних замін у нуклеотидних послідовностях нейрамінідази вірусів
грипу, виділених в Україні.
3. Визначити вплив добору на формування різноманітності вірусів грипу,
циркулюючих в Україні з використанням молекулярно-генетичних та
біоінформатичних методів.
4. Виявити наявність та долю резистентних до противірусних препаратів
вірусів грипу в їх загальній популяції в країні.
Об’єкт дослідження — віруси грипу типів А і В, генетичні
характеристики вірусів грипу
Предмет дослідження — генетична мінливість нейрамінідази вірусів
грипу (синонімічні та несинонімічні мутації), чутливість до противірусних
препаратів.
Методи дослідження. Вірусологічні, молекулярно-генетичні,
статистичні, філогенетичні, біоінформатичні.
Наукова новизна одержаних результатів. У роботі вперше за період
дослідження вірусів грипу в Україні із застосуванням біоінформатичних методів
визначено вплив добору на формування різноманітності вірусів грипу,
циркулюючих в Україні. Вперше в Україні доведена наявність резистентних
штамів до інгібіторів нейрамінідази з використанням різних методів
11
(генотипового та функціонального аналізів). Вперше виявлено вплив добору на
ключові заміщення в гені нейрамінідази вірусів грипу людей типу А: А(H1N1),
А(H3N2), А(H1N1)pdm та типу В генетичних гілок Yamagata і Victoria.
Вперше показано динаміку мінливості вірусів грипу людей, виділених в
Україні протягом останніх шести років із застосуванням філогенетичного
аналізу, методом максимальної правдоподібності (ML) та математичних
моделей, підібраних для кожної конкретної вибірки та встановлена генетична
подібність досліджуваних ізолятів до вірусів з інших країн та до вакцинних
штамів.
Практичне значення одержаних результатів. Апробовані
біоінформатичні методи дослідження впливу добору на прикладі гену
нейрамінідази дозволяє ідентифікувати положення у гені нейрамінідази, на які
діє добір (позитивний чи негативний). Застосування цих методів разом із
філогенетичним аналізом дозволяє досліджувати еволюційну динаміку вірусів
грипу, визначати ті мутації, які закріпилися у популяції вірусів грипу внаслідок
дії добору, та ті, положення в яких мутації елімінуються добором. Важливість
цього полягає не стільки в аналізі конкретних ізолятів, як в можливості
використання цього методу в рутинних дослідження еволюційної динаміки
вірусів грипу для отримання більш достовірної та актуальної інформації щодо
мінливості та адаптації вірусів грипу, і як наслідок кращого розуміння та
контролю ситуації із вірусом грипу.
Результати досліджень використані для апробації комплексного підходу
дослідження генетичних особливостей вірусів грипу за допомогою
біоінформатичних методів та знайшли своє практичне застосування в
Національному Центрі грипу, який є важливою складовою нагляду за грипом у
світі.
Отримані результати чутливості українських ізолятів вірусів грипу до
інгібіторів нейрамінідази за допомогою двох аналізів (генотипового та
12
функціонального) надали достовірну актуальну інформацію щодо чутливості
вірусів грипу до цих препаратів в Україні та щодо появи нових епідемічних
штамів. Проведені дослідження показали доцільність проведення
моніторингових досліджень чутливості ізолятів вірусів грипу до інгібіторів
нейрамінідази в Україні. Це забезпечить необхідною інформацією управлінські
структури, що дозволить більш ефективно реагувати на появу нових штамів
вірусу грипу в Україні та контролювати динаміку поширення. Що відображено
у щорічних прогнозах Національного центра грипу.
Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора.
Ідея роботи, мета і завдання досліджень сформульовано автором особисто.
Опрацювання літературних джерел, інформаційний пошук, розробка схеми
експерименту, її реалізація, отримання експериментальних даних, їх
узагальнення, інтерпретація здійснена автором особисто під керівництвом
д.б.н., професора В.П. Поліщука та д.мед.н. А.П. Міроненко.
Лабораторні дослідження первинних зразків методом ПЛР у реальному
часі, виділення вірусів грипу на культурі клітин, проведення штамової
ідентифікації виділених ізолятів вірусів грипу проводились у відділі
респіраторних та інших вірусних інфекцій ДУ «Інститут епідеміології та
інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського НАМН України» разом з к.б.н.
Л.В. Лейбенко, м.н.с. Л.В.Радченко, к.м.н. О.В. Онищенко та к.м.н. О.С.
Голубкою, аспірантом О. Ю. Смутько, м.н.с. А.Ю. Фесенко.
Філогенетичний аналіз, визначення впливу добору на формування
різноманітності вірусів грипу А (H1N1, H3N2, H1N1pdm), B/Yamagata і
B/Victoria, виділених в Україні з 2009 по 2015 рр., та генетичний аналіз
послідовностей вірусів грипу, на наявність заміщень, асоційованих із
резистентністю до інгібіторів нейрамінідази, проведені автором особисто на
кафедрі вірусології ННЦ «Інститут біології та медицини» Київського
національного університету імені Тараса Шевченка.
13
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної
роботи оприлюднені та обговорені на засіданнях кафедри вірусології ННЦ
«Інститут біології» Київського національного університету імені Тараса
Шевченка (що півроку); на ХІ міжнародній міждисциплінарній науковопрактичної конференції молодих вчених «Шевченківська весна» (Київ, Україна
21-25 березня 2011); 3-rd International Influenza Meeting (Muenster, Germany, 2-4
September 2012); «Вірусологія: минуле, сьогодення, майбутнє» (Київ, 12 квітня
2012); Options VIII for the Control of influenza (Cape Town, South Africa 5-10
September 2013); VII Міжнародній конференції «Біоресурси та віруси» (Київ,
Україна, 10-13 вересня 2013); на ХІІІ з’їзді товариства мікробіологів України ім.
С.М. Виноградського (Ялта, Україна, 01-06 жовтня 2013); Global Virus Network
conference of virologists for the Scandinavia-Baltic-Ukraine region (Laulasmaa,
Estonia 11th -13th of June, 2014); 3-rd International Influenza Meeting (Muenster,
Germany, 21-23 September 2014); на VIII всероссийской научно-практической
конференции с международным участием (Москва,Россия,2014); на Шостому
Міжнародному медичному конгресі (Київ, Україна, 15-17 квітня 2015 року): на
VIII Міжнародній конференції «Біоресурси та віруси» (Київ, Україна, 12-14
вересня 2016).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 17 наукових праць, з
них 7 наукових статей, у тому числі 5 у фахових наукових виданнях та 12 тез
наукових конференцій (5 – за кордоном).

Список литературы

ВИСНОВКИ
У дисертації вирішена актуальна науково-практична задача — доведена
чутливість українських ізолятів вірусів грипу, циркулюючих в епідемічних
сезонах з 2009 по 2015 роки, до противірусних препаратів - інгібіторів
нейрамінідази та досліджено вплив добору на формування генетичної
різноманітності вірусів грипу. Використання молекулярно-генетичних та
біоінформатичних методів дозволило одержати нову значущу інформацію про
генетичну мінливість, що спостерігається у вірусів грипу, та визначити їх
еволюційні зв’язки. Одержані результати представлені в наступних висновках:
1. Визначено , що українські ізоляти вірусів грипу А та В були генетично
споріднені до вакцинних штамів відповідно до сезону. Домінуючий збудник
епідемії в Україні у період з 2009 по 2012 рік співпадав з таким в країнах
Європейського регіону, у наступних сезонах відрізнявся. Штамовий склад
популяції вірусів грипу кожного з представлених сезонів був також різним.
2. Доведено, що більшість мутацій у вірусних клайдах та субклайдах були
нейтральними, - кількість синонімічних замін переважала над кількістю
несинонімічних замін на кожен сайт. Оскільки загальне співвідношення dN/dS
кодонів у гені нейрамінідази становило для вірусів грипу A(H3N2) - 0.205,
A(H1N1)pdm - 0.261, В/Yamagata - 0.226, В/Victoria - 0.292.
3. Встановлено, що на процес еволюційних змін (закріплення мутацій) у
вірусів грипу вплив мають взаємодії і в середині вірусної популяції. Так, як
лише окремі кодони, у гені NA виявились під впливом позитивного добору: у
вірусів грипу A(H3N2) виявлені сайти 93 та 402, у A(H1N1)pdm – 40 сайт, у
вірусів грипу типу B генетичної гілки Yamagata – кодони 74, 99, 268 та
генетичної гілки Victoria – сайти 358, 288, 455. Амінокислоти у визначених
сайтах не належать до активного центру, трансмембранного чи антигенного
124
сайтів. Проте внаслідок дії добору мутації у цих положеннях швидко
закріпилися у популяції вірусів грипу.
4. Встановлено, що інгібітори нейрамінідази не є селективним фактором
добору вірусів грипу в Україні. Оскільки не виявлено вплив добору на сайти,
асоційовані із резистентністю вірусів грипу до них, що було досліджено вперше
в Україні.
5. Доведено, що інгібітори нейрамінідази залишається ефективними
противірусними препаратами. Внаслідок того, що майже усі ізоляти українських
вірусів грипу виявилися чутливими до інгібіторів нейрамінідази за результатами
двох методів - генотипового та функціонального аналізів.
6. Виявлена необхідність щорічних моніторингових досліджень чутливості
вірусів грипу до інгібіторів нейрамінідази навіть за відсутності резистентності у
попередній період. У зв’язку з тим, що у епідемічному сезоні 2014-2015рр. була
зареєстрована раптова поява двох резистентних ізолятів (штам
A/Ukraine/292/2015 (H1N1)pdm із мутацією H275Y, штам B/Ukraine/6295/2015
генетичної гілки B/Yamagata із мутацією D198N), після 4-х років відсутності
резистентних ізолятів на території України.