Майстренко Марія Ігорівна Емерджентні вірусні інфекції коропа (Cyprinus carpio) та райдужної форелі (Oncorhynchus mykiss)

Краткое описание

Майстренко Марія Ігорівна, тимчасово не працє. Назва дисертації: «Емерджентні вірусні інфекції коропа (Cyprinus carpio) та райдужної форелі (Oncorhynchus mykiss)». Шифр та назва спеціальності 03.00.06 вірусологія. Спецрада Д 26.001.14 Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Київський національний університет імені Тараса Шевченка
Міністерство освіти і науки України
Київський національний університет імені Тараса Шевченка
Міністерство освіти і науки України
Кваліфікаційна наукова
праця на правах рукопису
МАЙСТРЕНКО МАРІЯ ІГОРІВНА
УДК [578.82/.83:597-12]:[639.371.13+639.371.52](477)
ДИСЕРТАЦІЯ
ЕМЕРДЖЕНТНІ ВІРУСНІ ІНФЕКЦІЇ КОРОПА (Cyprinus carpio)
ТА РАЙДУЖНОЇ ФОРЕЛІ (Oncorhynchus mykiss)
03.00.06.- вірусологія
Подається на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
Дисертація містить результати власних досліджень. Використання ідей,
результатів і текстів інших авторів мають посилання на відповідне джерело
Майстренко М.І.
Науковий керівник: Бучацький Леонід Петрович, доктор біологічних наук,
професор
Київ – 2021

ЗМІСТ
Перелік умовних скорочень………………………………………………………..13
ВСТУП………………………………………………………………………………14
РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ………………………………………………19
1.1. Біологічні властивості герпесвірусів риб……………….…........................19
1.2. Біологічні властивості бірнавірусів риб…………………………………….31
РОЗДІЛ 2. ОБ’ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ………………….............41
2.1. Об’єкти досліджень……………….…………………………………………42
2.2. Методи досліджень…………………………………………………………..40
РОЗДІЛ 3. БІОЛОГІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ ВІРУСУ ГЕРПЕСА КОРОПА
ТРЕТЬОГО ТИПУ (CYHV-3)……………………………………………………49
3.1 Клінічні ознаки інфікованих коропів………………………………………..49
3.2. Електронна мікроскопія нирок інфікованих коропів……………………….50
3.3 Конструювання тест-системи для діагностики вірусу герпеса коропа
третього типу (CyHV-3)……………………………………………………………53
3.3. Нові хазяї CyHV-3. ………………………………………………………….54
РОЗДІЛ 4. БІОЛОГІЧНІ ОСОБЛИВОСТІIPNV(ШТАМ «КАРПАТИ»)……… ….58
4.1. Ізоляція IPNV та його накопичення …………………………………………….58
4.2. Ампліфікація та аналіз нуклеотидної послідовності генів VP2 та NS …..65
4.3. Філогенетичний аналіз сегмента А IPNV (штам Карпати») ……………….67
4.4. Визначення впливу вірусу на активність АсАТ……………………………70
4.5. Визначення впливу вірусу на активність катепсину В ……………………72
4.6. Вивчення можливих носіїв вірусу у водоймах………………………………79
РОЗДІЛ 5 АНАЛІЗ ТА УЗАГАЛЬНЕННЯ ОТРИМАНИХ ДАНИХ……………88
ВИСНОВКИ………………………………………………………………………...97
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ………………………………………….98
13
Перелік умовних скорочень
IPNV – вірус інфекційного панкреатичного некрозу
CyHV-3 – вірус герпесу коропа 3-го типу
МЕБ – Міжнародне епізоотичне бюро
АГ – антигени
ПЛР – полімеразна ланцюгова реакція
АЛТ – аланінамінотрансфераза
АСТ – аспартатамінотрансфераза
АТ – антитіла
ІФА – імуноферментний аналіз
ІФН – інтерферон
NS – неструктурний білок
ВРЗ – відкрита рамка зчитування
кДНК – комплементарна дизоксирибонуклеїнова кислота;
кЗТ-ПЛР – кількісна зворотньотранскрипційна ПЛР
мРНК – матрична РНК
п.о. – пар основ
ПЛР– полімеразна ланцюгова реакція
РНК – рибонуклеїнова кислота
PDB – Protein Data Bank
ДНК – дизоксирибонуклеїнова кислота
ЗТ-ПЛР – зворотньотранскрипційна ПЛР
14
ВСТУП
Актуальність теми. Емерджентними називають хвороби, які виникають
або проявляються раптово, несподівано, які раніше були невідомі і часто
викликають надзвичайно напружені епізоотичні ситуації. Для України такими є
вірус інфекційного панкреатичного некрозу (IPNV) та вірус герпесу коропа 3-го
типу (CyHV-3). Особливо небезпечним для рибництва є CyHV-3. Спалахи нового
захворювання, який він спричиняє, призвели до масової загибелі коропових риб
в Ізраїлі, в США та багатьох країнах Європи, Азії та Північної Америки. Швидке
розповсюдження цього вірусу по всьому світу обумовлене тим, що він вражає
декоративного коропа коі, який має широкий попит серед акваріумістів і є
предметом інтенсивної торгівлі. Міжнародне епізоотичне бюро (МЕБ) у 2007р.
визнало цю емерджентну інфекцію як загрозливу і таку, що підлягає
обов’язковому декларуванню та викоріненню. Відсутність повідомлень про
розповсюдження цього вірусу у Східній Європі є однією з причин заборони
ввезення коропа до країн Європейського Союзу.
IPNV також викликає масову загибель лососевих риб, особливо форелі. У
зв’язку з тим, що в Україні в останній час розведення цієї риби в умовах
аквакультури набуло широкого розповсюдження, вивчення інфекційного
панкреатичного некрозу є актуальним завданням іхтіопатологів.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота
виконана в рамках наукової програми «Збереження біорізноманіття та
комплексне дослідження стратегій адаптації фіто-, зоо- та віробіоти України з
використанням біоінформаційних технологій» (номер держреєстрації: 11БФ 036-
02). Робота також є складовою частиною досліджень, передбачених тематичним
планом Інституту рибного господарства НААН та відповідає НТП НААН за
2011-2015 рр. з теми: «Дослідити біологічні і еколого-географічні особливості
поширення збудників хвороб промислових видів риб і впровадити молекулярні
методи дослідження виділених патогенів» (№ д. р. 0111U006973).
15
Мета і завдання дослідження. Метою роботи було дослідження біологічних
властивостей IPNV (штам «Карпати») та CyHV-3 як у природних водоймах, так
і в прісноводній аквакультурі України та вивчення їх молекулярно-біологічних
властивостей, а також проведення філогенетичного аналізу для розробки засобів
діагностики і профілактики вірусних захворювань цінних видів риб. Для
досягнення мети були поставлені наступні завдання:
1. Провести виділення та ідентифікацію емерджентних вірусів коропа
(C. carpio) та форелі (O. mykiss) за допомогою сучасних вірусологічних та
молекулярно-біологічних методів.
2. Розробити тест-системи щодо ПЛР-діагностики емерджентних
вірусів коропа та форелі.
3. Провести електронномікроскопічне дослідження нирок коропів,
вражених CyHV-3.
4. Провести визначення первинної послідовності певних фрагментів
генів VP2 та NS штаму «Карпати» IPNV.
5. Вивчити вплив IPNV на активність деяких ферментів в перевивних
культурах клітин та в організмі інфікованих риб.
6. Оцінити можливих хазяїв IPNV (штам «Карпати») у природних
водоймах.
Об’єкт дослідження: емерджентні віруси риб різних таксономічних груп
(IPNV (штам «Карпати») та CyHV-3).
Предмет дослідження: біологічна характеристика IPNV (штам
«Карпати») та герпесвірусу CyHV-3, які є емерджентними для України.
Методи дослідження: для виконання поставлених завдань у роботі
використано комплекс вірусологічних, біохімічних, електронно-мікроскопічних
і статистичних методів досліджень.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні від коропа коі
та від акваріумних риб з Київського зоопарку був виділений високопатогенний
вірус герпеса третього типу (CyHV-3). Розроблений на основі ПЛР діагностикум
ефективний для виявлення цієї висококонтагіозної інфекції.
Вперше на території України вірус інфекційного панкреатичного некрозу
(IPNV) був виявлений у райдужної форелі, виловленої з природних водойм (р.
Серет). Проаналізовано первинну послідовність генів VP2 та NS,
сконструйовано олігонуклеотидні праймери, та відпрацьовані умови постановки
16
ПЛР, які дозволяють ідентифікувати віруси в культурі клітин та клінічному
матеріалі.
Практичне значення одержаних результатів. Розроблені діагностичні
тест-системи на основі ПЛР для виявлення та ідентифікації герпесвірусу коропа
третього типу та вірусу інфекційного панкреатичного некрозу (штам «Карпати»).
Результати проведених досліджень розширюють уявлення про особливості
перебігу інфекційного процесу у організмі риб, висвітлюють механізми і
принципи реплікації вищезгаданих вірусів риб.
Застосування нових засобів діагностики на основі ПЛР дозволить
зменшити втрати від хвороб в рибницьких господарствах та підвищити
рибопродуктивність. Це дасть змогу суттєво покращити епізоотичну ситуацію в
рибницьких господарствах.
Матеріали даної роботи використані при розробці патентів на винаходи в
галузі рибного господарства.
Особистий внесок автора. За особистої участі здобувача визначені тема
та мета дослідження, обґрунтовано актуальність і основні напрямки роботи;
окреслено завдання наукових досліджень. Планування експериментів та вибір
методичних підходів, формулювання основних положень і висновків дисертації
здійснено під керівництвом д.б.н., професора Л.П. Бучацького.
Автором особисто здійснено інформаційно-патентний пошук, вивчено та
проаналізовано сучасну літературу з досліджуваної проблеми. Дисертанткою
здійснено електронно-мікроскопічні дослідження та вивчено морфологоструктурні особливості герпесвірусу коропа (CyHV-3), вивчено особливості
процесу інфікування райдужної форелі та інших досліджуваних гідробіонтів
вірусом інфекційного панкреатичного некрозу (IPNV). Здобувачем проведено
науковий аналіз та статистичну обробку.
Виділення IPNV з природнього середовища, культивування вірусу на
культурі клітин, градієнтне ультрацентрифугування здійснено у співавторстві із
завідувачем лабораторії біотехнолоій в рибництві Інституту рибного
господарства НААН Рудьом Ю.П. Під керівництвом Рудя Ю.П. дисертантка
17
здійснила молекулярно-біологічні дослідження, включаючи ідентифікацію
вірусу за допомогою ПЛР, секвенування фрагментів вірусного геному та
біоінформаційний аналіз. Біохімічні дослідження інфікованих риб здійснено за
участю к.б.н. Драган Л.П. Електронно-мікроскопічні дослідження впливу
CyHV-3 на нирки та інші внутрішні органи коропа проведені у співавторстві з
доктором біологічних наук Матвієнко Н.М.
Автор взяла участь у підготовці двох патентів на винахід щодо ізольованих
на території України штамів емерджентних вірусів риб. Автор висловлює щиру
подяку усім співавторам публікацій за темою дисертації.
Обґрунтування та достовірність основних положень, висновків,
рекомендацій. Представлена робота виконана на сучасному науковометодичному рівні з використанням комплексу вірусологічних та біохімічних
методів та статистичних методів, адекватних поставленим завданням.
Застосовані в роботі методи є сучасними та дозволяють повною мірою оцінити
отримані дані. Наукові положення, висновки, практичні рекомендації, порівняні
з літературними джерелами, є достовірними і обґрунтовані на підставі вивчення
сучасних досягнень лабораторної діагностики, переконливі та репрезентативні.
В науковому дослідженні використовувались сучасні науково-методичні
підходи, які відповідають поставленим завданням. Цифровий матеріал повністю
базується на фактичних даних, підданий статистичній обробці.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної
роботи доповідались та обговорювалися на конференції «Молодь і поступ
біології» (Львів, 2012); на VIІ Міжнародній конференції «Біоресурси і віруси»
(Київ, 2013); на 4-ій науково-практичній конференції «Современные проблемы и
перспективы рыбохозяйственного комплекса» (Москва, 2013), на міжнародному
симпозіумі з водних наук (Туреччина, 2014).
Публікації. За результатами дослідження опубліковано 18 наукових праць
загальним обсягом 4,5 д.а. (з них 0,94 д.а. належать особисто автору), (2 статті у
виданняхWeb of Science та Scopus, 11 статей у наукових фахових виданнях
України, 2 статті в іноземних виданнях, 3 статті в інших виданнях та 7 тез
18
матеріалів наукових конференцій), які відповідають вимогам п.п. 11, 13
постанови Кабінету Міністрів України «Порядок присудження наукових
ступенів і присвоєння вченого звання старшого наукового співробітника» від 24
липня 2013 року. Отримано 2 патенти на штам вірусу герпеса та на штам
бірнавірусу «Карпати», права співавторів не порушено.
Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 116 стор.
машинописного тексту (основний текст – 97 стор.) і складається зі вступу, огляду
літератури, основної частини (включає матеріали і методи досліджень,
результати досліджень та їх обговорення), висновків, списку використаних
джерел, що містить 163 джерела, з яких111 – зарубіжних авторів. Робота
ілюстрована 6 таблицями, 20 рисунками.

Список литературы

ВИСНОВКИ
У роботі наведені матеріали по розробці методів діагностики
емерджентних для України вірусів герпеса коропа третього типу (CyHV-3) та
бірнавірусу IPNV (штам «Карпати»). Проаналізовано первинну послідовність
генів VP2 та NS вірусу інфекційного панкреатичного некрозу, сконструйовано
олігонуклеотидні праймери, та відпрацьовані умови постановки ПЛР, які
дозволяють ідентифікувати вірус в культурі клітин та клінічному матеріалі.
1. Вперше в Україні від коропа коі та коропа лабео виділено
емерджентний для України вірус герпеса риб третього типу.
Розроблений на основі ПЛР діагностикум може бути ефективним для
виявлення цієї висококонтагіозної інфекції в рибницьких
господарствах.
2. Вперше в Україні у риб, виловлених з природніх водойм (річка Серет)
був виявлений бірнавірус IPNV (штам «Карпати»).
3. Проаналізовано первинну послідовність генів VP2 та NS IPNV, на
основі проведеного філогенетичного аналізу встановлена ідентичність
штаму «Карпати» з штамом Sp.
4. Сконструйовані олігонуклеотидні праймери в реакції ПЛР дозволяють
ідетивікувати IPNV як в культурі клітин, так і в клінічному матеріалі.
5. Проведені біохімічні дослідження свідчать про значну зміну під
впливом бірнавірусу IPNV (штам «Карпати») активностей
аспартатамінотрансферази та катепсину В.
6. Результати вивчення кола хазяїв IPNV свідчать про довготривале
перебування вірусу в організмі струмкової форелі, широкопалих раків
та інших водяних організмів.