Агейченко Алина Владимировна. Состояние микробиоценоза толстого кишечника, липидного состава клеточных мембран и антиоксидантного статуса животных при экспериментальном дисбиозе : Агейченко Аліна Володимирівна. Стан мікробіоценозу товстого кишечника, ліпідного складу клітинних мембран і антиоксидантного статусу тварин при експериментальному дисбиозе Ageichenko Alina Vladimirovna. The state of the microbiocenosis of the large intestine, the lipid composition of cell membranes and the antioxidant status of animals with experimental dysbiosis

Краткое описание

Агейченко Алина Владимировна. Состояние микробиоценоза толстого кишечника, липидного состава клеточных мембран и антиоксидантного статуса животных при экспериментальном дисбиозе: диссертация ... кандидата Медицинских наук: 03.02.03 / Агейченко Алина Владимировна;[Место защиты: ФГБОУ ВО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации], 2016

Федеральное государственное бюджетное образовательное
Учреждение высшего образования
«Курский государственный медицинский университет»
Министерства здравоохранения Российской Федерации
На правах рукописи
Агейченко Алина Владимировна
СОСТОЯНИЕ МИКРОБИОЦЕНОЗА ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА,
ЛИПИДНОГО СОСТАВА КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН И
АНТИОКСИДАНТНОГО СТАТУСА ЖИВОТНЫХ ПРИ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ДИСБИОЗЕ
03.02.3 - микробиология
Диссертация
на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Научный руководитель:
доктор биологических наук, доцент Медведева О.А. Научный консультант:
доктор биологических наук, доцент Королев В.А.
Курск - 2016
СОДЕРЖАНИЕ
Список сокращений 5
Введение 6
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1 Нормофлора толстого кишечника и ее значение для макроорганизма....15
1.2 Дисбиоз толстого кишечника и принципы его коррекции 18
1.3 Структура и свойства биологических мембран 24
1.4 Процессы перекисного окисления липидов 30
1.5 Система антиоксидантной защиты организма и антиоксидантная
терапия 33
Глава 2. Материалы и методы исследования 40
2.1 Методика формирования экспериментального лекарственного дисбиоза 40
2.2 Количественное и качественное исследование мукозной микрофлоры
толстого кишечника 40
2.3 Определение продуктов ПОЛ и ферментов АОЗ макроорганизма 41
2.4 Количественное и качественное определение липидных фракций
мембран эритроцитов 43
2.5 Изучение эффективности профилактического и лечебного использования антиоксиданта и пробиотиков при экспериментальном
лекарственном дисбиозе 45
2.6Статистическая обработка полученных данных 46
Результаты собственных исследований 48
Глава 3. Состояние пристеночной микрофлоры толстого кишечника и молекулярно-биохимических показателей крови и колоноцитов мышей в условиях
экспериментального дисбиоза 48
3.1 Состояние пристеночной микрофлоры толстого кишечника мышей в условиях экспериментального дисбиоза 48
3.2 Изменение молекулярно-биохимических показателей крови и
колоноцитов мышей в условиях экспериментального дисбиоза 51
Глава 4. Особенности изменения пристеночной микрофлоры толстого кишечника и молекулярно-биохимических показателей крови и колоноцитов мышей при коррекции экспериментального дисбиоза пробиотиками «РиоФлораИммуно Нео» и «Бифиформ» 59
4.1 Изменения состояния пристеночной микрофлоры толстого кишечника
при коррекции экспериментального дисбиоза пробиотиками «РиоФлора Иммуно Нео» и «Бифиформ» 59
4.2 Изменение молекулярно-биохимических показателей крови и
колоноцитов при коррекции экспериментального дисиоза пробиотиками «РиоФлора Иммуно Нео» и «Бифиформ» 63
Глава 5. Особенности изменения молекулярно-биохимических показателей крови и ткани толстого кишечника мышей при применении антиоксиданта эмоксипина 68
5.1 Изменения состояния пристеночной микрофлоры толстого кишечника и молекулярно-биохимических показателей крови и колоноцитов мышей в условиях профилактического использования антиоксиданта эмоксипина...69
5.2 Изменения состояния пристеночной микрофлоры толстого кишечника и
молекулярно-биохимических показателей крови и колоноцитов мышей в условиях коррекции антиоксидантом эмоксипином 73
Глава 6. Особенности изменения пристеночной микрофлоры толстого кишечника, молекулярно-биохимических показателей крови и колоноцитов мышей при коррекции экспериментального дисбиоза пробиотиком «РиоФлора Иммуно Нео»
и антиоксидантом эмоксипином 79
6.1 Изменения пристеночной микрофлоры толстого кишечника мышей при коррекции экспериментального дисбиоза пробиотиком «РиоФлора Иммуно Нео» и антиоксидантом эмоксипином 79
6.2 Изменение молекулярно-биохимических показателей крови и колоноцитов мышей при коррекции экспериментального дисбиоза пробиотиком «РиоФлора Иммуно Нео» и антиоксидантом эмоксипином...81
Заключение 86
Выводы 94
Практические рекомендации 95
Перспективы дальнейшей разработки темы 95
Список литературы 96
АГП - ацилгидроперекиси
АОЗ - антиоксидантная защита
АОС - антиоксидантная система
АФК - активные формы кислорода
ДГ - диацилглицеролы
КЛ - кардиолипин
КОЕ - колониеобразующая единица
ЛФХ - лизофосфатидилхолин
МГ - моноацилглицеролы
МДА - малоновый диальдегид
ПОЛ - перекисное окисление липидов
СЖК - свободные жирные кислоты
СМ - сфингомиелин
СОД - супероксиддисмутаза
ТГ - триацилглицеролы
УПМ - условно-патогенные микроорганизмы
ФИ/ФС - фосфатидилинозитол/серин
ФХ - фосфатидилхолин
ФЭ - фосфатидилэтаноламин
ХС - холестерол
ЭД - экспериментальный дисбиоз ЭХС - эфиры холестерола
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы исследованияи степень ее разработанности
Кишечник человека представляет собой экологическую систему, для которой характерно наличие сложного динамического равновесия между системами, обеспечивающими гомеостаз макроорганизма и микробными ассоциациями, заселяющими его различные биотопы [10, 95].
Нормофлора человека выполняет различные жизненно важные функции, в том числе обеспечивает процессы переваривания и всасывания, синтез витаминов, аминокислот,ферментов, оказывает подавляющее действие на патогенную микрофлору, обеспечивает иммунорегулирующую функцию и антиинфекционную защиту, принимает участие в синтезе иммуноглобулинов и в морфогенезе иммунной системы [141, 142, 159]. Микрофлора толстого кишечника считается биогенным фактором, в значительной степени определяющим состояние организма [107, 156].
В норме представители кишечной микрофлоры не оказывают отрицательного влияния на макроорганизм, однако нарушение качественного и/или количественного состава нормофлоры, называемое дисбиозом, может приводить к заболеваниям органов пищеварения, иммунной системы,системы кроветворения, развитию анемии, ферментопатии, гипертрофии [127]. Нарушение состава микробиоценоза приводит к снижению резистентности организма человека кишечным инфекциям [100].
Причинами изменений качественного и количественного состава кишечной микрофлоры являются воздействие на организм различных факторов экзогенного и эндогенного характера (возраста, образа жизни, сезона года, характера питания, в том числе и продолжительный неконтролируемый приём антибиотиков широкого спектра действия) [44, 94, 178].
Патологические изменения, развивающиеся при воздействии ксенобиотиков (в том числе антибактериальных препаратов широкого спектра действия) на организм, могут рассматриваться как проявление дезорганизации его функционального и структурного состояния, необходимого для нормальной жизнедеятельности. Это в свою очередь может приводить к выраженным нарушениям липидного состава клеточных мембран форменных элементов крови, которые заключаются в изменении соотношения липидных фракций [59, 88, 135]. Структурные перераспределения, приводящие к утрате асимметрии мембранных липидов клетками, в значительной степени могут сказаться на нарушении функций биомембраны, ее вязкоэластических свойств,проницаемости, что влечет за собой снижение стабильности мембран клеток крови и может способствовать нарушению окислительно-восстановительных процессов в организме,развитию гипоксии[28, 56].
Воздействие антибиотиков на организм человека является одним из провоцирующих факторов образования свободных радикалов - активных частиц с неразделенной химической связью, которые вступают в реакции с различными молекулами организма и повреждают их. Некоторая их часть поступает извне, другая часть образуется в результате химических процессов, протекающих в клетках, что в свою очередь приводит к накоплению продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ). При липопероксидации в клетках интенсифицируются патологические процессы, приводящие к повреждению мембран, инактивации или трансформации активности ферментов, накоплению инертных продуктов полимеризации. Одновременно нарушаются процессы регенерации тканей. Регулятором данных механизмов выступает антиоксидантная система (АОС), которая превращает свободные радикалы в безопасные соединения [50, 60, 80].
Многочисленные клинико-лабораторные исследования, направленные на изучение качественных и количественных изменений состава микробиоценоза толстого кишечника при дисбиозе, позволили выдвинуть концепцию, согласно которой сообщество микроорганизмов в толстом кишечнике человека определяется индивидуальными характеристиками организма, что фактически обуславливает индивидуализацию создания и применения лекарственных и профилактических препаратов для коррекции дисбиотических состояний [62, 199]. В настоящее время для коррекции дисбиоза используются препараты, которые можно подразделить на три группы: пребиотики, пробиотики и синбиотики [20].
Однако эффективность применения препаратов антиоксидантного ряда для коррекции нарушений молекулярно-биохимических показателей плазмы крови и колоноцитов при дисбиозе, до сих пор не изучена.
Цель исследования
Целью исследования явилось изучение взаимосвязи изменений состава микробиоценоза толстого кишечника животных и молекулярно-биохимических показателей крови, колоноцитов в условиях экспериментального лекарственного дисбиоза,возможности их коррекции с использованием пробиотика и антиоксиданта.
Задачи исследования
1. Исследовать качественный и количественный состав микрофлоры муцинового слоя толстого кишечника мышей в условиях экспериментального дисбиоза, обусловленного введением гентамицина.
2. Исследовать в условиях экспериментального дисбиоза количественный и качественный липидный состав мембран эритроцитов животных.
3. Изучить в условиях экспериментального дисбиоза прооксидантно- антиоксидантный баланс плазмы крови и колоноцитов экспериментальных животных.
4. Оценить в эксперименте эффективность применения пробиотиков «РиоФлора Иммуно Нео» и «Бифиформ» для восстановления количественного и качественного состава микробиоценоза муцинового слоя микробиоценоза толстого кишечника и молекулярно-биохимических показателей крови и колоноцитов мышей при воздействии гентамицина.
5. Оценить влияние антиоксиданта эмоксипина на количественный и качественный состав микробиоценоза муцинового слоя толстого кишечника и молекулярно-биохимические показатели крови и колоноцитов мышей в условиях гентамицинового дисбиоза.
6. Изучить возможность сочетанного использования пробиотика и антиоксиданта для коррекции количественных и качественных нарушений в составе микробиоценоза толстого кишечника и метаболических изменений крови и колоноцитах экспериментальных животных, вызванных воздействием ксенобиотика.
Научная новизна работы
Впервые изучена взаимосвязь между изменениями качественного и количественного состава микробиоценоза толстого кишечника и интенсивностью процессов перекисного окисления липидов, функциональной активностью системы антиоксидантной защиты макроорганизма при воздействии гентамицина.
Впервые изучено взаимовлияние между диверсификацией состава муцинового слоя толстого кишечника и количественной представительностью фракций нейтральных и фосфолипидов клеточных мембран эритроцитов животных в условиях гентамицинового дисбиоза.
В условиях эксперимента обоснованы пути коррекции дисбиоза толстого кишечника и нарушений молекулярно-биохимических показателей крови и колоноцитов пробиотиком «РиоФлора Иммуно Нео» и метаболическим антиоксидантом эмоксипином.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные результаты способствуют расширению существующих представлений о молекулярно-клеточных механизмах развития антибиотико-ассоциированного дисбиоза толстого кишечника. Экспериментальные данные свидетельствуют о взаимосвязях между изменениями качественного и количественного состава микробиоценоза муцинового слоя толстого кишечника, нарушениями скоординированной работы ферментативной системы, обеспечивающей антиоксидантную защиту макроорганизма и изменением химического состава клеток макроорганизма (липидного состава мембран эритроцитов) при воздействии антибиотика гентамицина.
Полученные данные представляют значительный интерес и могут использоваться в практике, терапевтов, гастроэнтерологов, инфекционистов при выборе стратегии и тактики применения антибиотиков, а также профилактики и избирательной коррекции негативных последствий применения антибиотиков.
Результаты работы могут быть в дальнейшем использованы при изучении курсов микробиологии, биохимии, фармакологии, патофизиологии, где изучаются механизмы обеспечивающие сохранение гомеостаза макроорганизма.
Положения, выносимые на защиту
1. Применение ксенобиотика гентамицинаприводит к изменению качественного и количественного состава муцинового микробиоценоза толстого кишечника, липидного состава мембран эритроцитов и снижению активности антиоксидантных ферментов, накоплению продуктов перекисного окисления липидов в плазме крови и колоноцитах экспериментальных животных.
2. Использование антиоксиданта эмоксипина при коррекции дисбиоза стабилизирует молекулярно-биохимические показатели крови и колоноцитов.
3. Сочетанное использование пробиотика «РиоФлора Иммуно Нео» и антиоксиданта эмоксипина эффективно корригирует гентамициновый дисбиоз за счет восстановления состава мукозной микрофлоры толстого кишечника и нормализации процессов перекисного окисления липидов в плазме крови и колоноцитах.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Научные положения соответствуют формуле специальности 03.02.03 - «микробиология». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно - пунктам 2, 6, 8.
Личный вклад автора
Автором определено направление исследования. Проведены экспериментальные серии моделирования дисбиоза и его коррекции у животных, выполнен забой животных, забор материала, изучение качественного и количественного состава микробиоценоза муцинового слоя толстого кишечника мышей, исследование молекулярно-биохимических показателей крови и колоноцитов. Выполнены статистическая обработка, анализ и трактовка полученных результатов, сформулированы выводы и практические рекомендации. Личный вклад автора составляет 80-85%.
Внедрения результатов исследования
Основные положения и выводы внедрены в учебный процесс кафедры иммунологии и специализированных клинических дисциплин медицинского института ФГБОУ ВПО «Орловский государственный университет»; кафедры медико-профилактических дисциплин медицинского института ФГАОУ «Белгородский государственныйнациональный исследовательский университет»; кафедры биохимии ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет; используются в научно-исследовательской работе ФКП «Курская биофабрика».
Степень достоверности и апробация результатов
Научные положения и выводы, сформулированные в диссертации, логически вытекают из результатов проведенных исследований и не противоречат классическим положениям микробиологии. В работе использован широкий набор современных и адекватных задачам диссертационного исследования методов, прежде всего бактериологических, микроскопических, статистических. Диссертация апробирована на совместном заседании кафедр: микробиологии, вирусологии, иммунологии, биологии, медицинской генетики и экологии, биологической химии, патофизиологии ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Минздрава России (протокол №19 от 01июля 2015 г.).
Материалы диссертационного исследования представлены на Всероссийской научно-практической конференции по трансляционной медицине «Микробиология - практическому здравоохранению», посвященной 70-ию кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии Московского Государственного Медико-стоматологического Университета им. А.И. Евдокимова (Москва, 2013); 79-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых учёных с международным участием «Молодёжная наука и современность», посвящённой 79-летию КГМУ (Курск, 2014); III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы медицины и фармации» (Орел, 2014); IX Международной научно-практической конференции молодых ученых-медиков, организуемой Воронежским, Курским и Казанским медицинскими образовательными учреждениями, посвященной 95-летию Казанской государственной медицинской академии (Казань, 2015); Международной научно-практической конференции «Университетская наука: взгляд в будущее», посвященной 81-летию Курского государственного медицинского университета и 50-летию фармацевтического факультета в рамках Недели международной медицинской науки (Курск, 2016).
Публикации
Результаты настоящей диссертации изложены в 21 публикации в научных журналах и сборниках (материалах) конференций, из них 7 - в ведущих российских рецензируемых журналах, входящих в Перечень Высшей аттестационной комиссии при Министерстве образования и науки Российской Федерации («Кубанский научный медицинский вестник», «Ученые записки Орловского государственного университета», «Вестник Башкирского государственного медицинского университета», «Журнал микробиологии, эпидемиологии, иммунобиологии», «Научные ведомости Белгородского государственного университета. Медицина. Фармация.», Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье»).
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического списка, включающего 154 отечественных и 45 зарубежных источника. Текст диссертации изложен на 115 страницах машинописного текста, содержит 31 таблицу.

Список литературы

ВЫВОДЫ
1. При экспериментальном дисбиозе, обусловленном применением гентамицина, изменение состава кишечной микрофлоры характеризуется снижением количества бифидо-, лакто-, бактерий рода Enterobacter, кишечных палочек с нормальной ферментативной активностью, отсутствием представителей родов Citrobacter и Enterococcus, увеличением численности эшерихий со сниженной ферментативной активностью, стрептококков, грибов рода Candida; появлением в составе микробиоценоза золотистых стафилококков и протея.
2. У животных с экспериментальным дисбиозом выявлены изменения липидного состава клеточных мембран эритроцитов крови мышей: в составе фосфолипидов отмечено увеличение содержания фракций ЛФХ и СМ, снижение фракций КЛ, ФИ/ФС, ФЭ и ФХ. В составе нейтральных липидов увеличилось содержание фракции ЭХС, ТГ и ХС.
3. Лекарственный дисбиоз характеризуется существенным снижением ферментативной активности системы АОЗ (каталазы и СОД) как в плазме крови, так и в колоноцитах. При этом нарушения в антиоксидантной защите эпителиоидных клеток кишечника выражены интенсивнее, чем в плазме крови, что указывает на нарушение адаптационно-компенсаторных механизмов антиоксидантной защиты на местном уровне.
4. В условиях лекарственного дисбиоза, характеризующегося увеличением численности представителей факультативной микрофлоры толстого кишечника выявлено увеличение содержания продуктов ПОЛ (МДА, АГП) в плазме крови и ткани кишечника. В колоноцитах животных данные изменения выражены интенсивнее, что обусловлено действием как самого антибиотика, так и количественным и качественным изменением состава нормобиоценоза.
5. Наиболее выраженным корригирующим эффектом в отношении восстановления нормобиоценоза кишечника и молекулярно-биохимических показателей колоноцитов животных обладает пробиотик «РиоФлора Иммуно Нео».
6. Использование антиоксиданта эмоксипинане приводит к полному восстановлению количественного и качественногосостава микробиоценоза толстого кишечника, однако повышает адаптивно-компенсаторные возможности макроорганизма при экспериментальном дисбиозе.
7. Сочетанное использование пробиотика «РиоФлора Иммуно Нео» и антиоксиданта эмоксипинавосстанавливает состав микробиоценоза муцинового слоя толстого кишечника, липидный состав мембран эритроцитов, повышает активность ферментов системы АОЗ, снижает содержание продуктов ПОЛ в плазме крови и колоноцитах экспериментальных животных.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. При длительном использовании ксенобиотиков рекомендуется на ряду с проведением исследований на выявление количественного и качественного изменения состава микробиоценоза толстого кишечника проводить изучение состояния прооксидантно-антиоксидантного статуса макроорганизма: активность ферментов, обеспечивающих антиоксидантную защиту (каталаза и СОД), содержание продуктов ПОЛ (МДА и АГП), липидный состав мембран эритроцитов.
2. При нарушении состава микробиоценоза толстого кишечника и молекулярно-биохимических показателей макроорганизма рекомендуется сочетанное использование препаратов групп пробиотиков и антиоксидантов.
ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ
Дальнейшая разработка темы возможна в направлении изучения изменений морфологической структуры слизистой оболочки толстого кишечника под воздействием ксенобиотиков.