Чернов Тимофей Иванович. Метагеномный анализ прокариотных сообществ профилей почв европейской территории России : Чернов Тимофій Іванович. Метагеномний аналіз прокаріотних угруповань профілів ґрунтів європейської території Росії Chernov Timofey Ivanovich. Metagenomic analysis of prokaryotic communities of soil profiles in European Russia

Краткое описание

Чернов Тимофей Иванович. Метагеномный анализ прокариотных сообществ профилей почв европейской территории России: диссертация ... кандидата Биологических наук: 03.02.03 / Чернов Тимофей Иванович;[Место защиты: Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова].- Москва, 2016.- 111 с.

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ
М.В. ЛОМОНОСОВА»
На правах рукописи
ЧЕРНОВ
Тимофей Иванович
МЕТАГЕНОМНЫЙ АНАЛИЗ ПРОКАРИОТНЫХ СООБЩЕСТВ
ПРОФИЛЕЙ ПОЧВ ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ
Специальность 03.02.03 - микробиология
Диссертация на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Научный руководитель: доктор биологических наук, Манучарова Наталия Александровна
Москва 2015
Оглавление
ВВЕДЕНИЕ 3
ГЛАВА 1. МЕТАГЕНОМИКА И ГЕН 16S рРНК 9
1.1. Место метагеномики в научном знании 9
1.2. Ген 16S рРНК в метагеномике 11
ГЛАВА 2. РАЗНООБРАЗИЕ ПОЧВЕННЫХ МИКРОБИОМОВ И СПОСОБЫ ЕГО ОЦЕНКИ 16
2.1. Почва как депозитарий микробного биоразнообразия 16
2.2. Альфа-разнообразие 17
2.3. Бета-разнообразие 21
ГЛАВА 3. МЕТАГЕНОМИКА ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ 24
3.1. Методические особенности почвенной метагеномики 24
3.2. Метагеномика и экология почвенных микроорганизмов 25
3.3. Профильный подход в почвенной метагеномике 34
ГЛАВА 4. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 38
4.1. Объекты исследования 38
4.2. Методы исследований 54
4.2.1. Отбор образцов 54
4.2.2. Химические анализы 54
4.2.3. Приготовление препарата почвенной ДНК 54
4.2.4. Проведение количественной ПЦР 55
4.2.5. Секвенирование и обработка данных 56
ГЛАВА 5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 59
5.1. Характеристика первичных данных 59
5.2. Кислые профильно-дифференцированные почвы 59
5.3. Черноземы типичные разных систем землепользования 66
5.4. Коричневая карбонатная почва 78
5.5. Геохимически сопряженные почвы сухостепного почвенного комплекса 81
5.6. Общий анализ таксономического состава микробиомов 88
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 91
ВЫВОДЫ 93
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 94
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность работы
Почва представляет собой сложную экологическую систему, выполняющую множество незаменимых функций в биосфере Земли. Большинство этих функций, связанных с биогеохимическими циклами элементов, обеспечением питания растений, устойчивостью и гомеостазисом биоценозов, осуществляется при участии почвенных микроорганизмов. Благодаря ее уникальному устройству как полифазной системы с высокой внутренней удельной поверхностью в одном грамме почвы может содержаться порядка 10 млрд клеток микроорганизмов, относящихся к тысячам различных видов (Torsvik, 0vreas, 2002). Крайняя гетерогенность почвы как среды обитания, высокая вариабельность экологических факторов и многообразие их сочетаний делают почвенную среду самым большим резервуаром микробного разнообразия на Земле (Звягинцев, 1987).
Лишь небольшую часть этого огромного микробного комплекса удается выделить в лабораторных условиях на искусственных питательных средах. Большую часть прокариот, населяющих почву (90-99 % всего состава сообществ) не удается культивировать в лаборатории, а значит, их биогеохимические и экологические функции недоступны для исследования классическими методами микробиологии (Aslam, 2010).
Приоритетными в обнаружении и изучении некультивируемого большинства почвенных микроорганизмов являются молекулярно¬биологические методы, позволяющие исследовать свойства микроорганизмов in situ, без выделения в чистые культуры (Равин, Марданов, Скрябин, 2015). Особое место среди них занимает метагеномика - анализ суммарного генетического материала, выделяемого из целой биологической системы.
Метагеномный подход стал возможен благодаря развитию
высокопроизводительного секвенирования - современных технологий
«прочитывания» нуклеотидной последовательности ДНК, позволяющих
3
анализировать крупные объемы генетической информации. Наиболее популярен в метагеномных исследованиях анализ гена 16S рРНК, на строении которого основана современная филогенетическая классификация прокариотических организмов.
На протяжении последних двух десятилетий при помощи метагеномики активно изучаются структура и разнообразие почвенных микробных сообществ и их связь с внешними факторами. Однако, большинство метагеномных исследований касаются лишь тонкого поверхностного слоя почвы в 5, 10 или 20 см, хотя общеизвестно, что микроорганизмы населяют ее по всему профилю, от дневной поверхности до почвообразующей породы. Лишь немногие работы в области экологической генетики касаются глубоких слоев почвы, но и в них исследователи, как правило, лишь грубо разделяют профиль на «поверхностную» и «подповерхностную» части или на формальные слои по глубине. Между тем, школа генетического почвоведения, ведущая начало с трудов В.В. Докучаева, много лет назад сформировала представление о почвенном профиле как о системе генетических горизонтов - слоев почвы, различающихся по происхождению, физико-химическим свойствам и протекающим в них процессам и определяющих специфику почвы в целом. Для исследования экологических особенностей почвенных микробных сообществ и их взаимосвязи со свойствами почв представляется оправданным и перспективным рассмотрение почвенного профиля именно по генетическим горизонтам.
В рамках данной работы проведен сравнительный метагеномный анализ
горизонтов, слагающих профили ряда почв европейской части России.
Несмотря на то, что география работ по почвенной метагеномике охватывает
почти все регионы Земли, огромная территория России изучена крайне слабо
- в научной литературе данные по метагеномному анализу почвенного
покрова Российской Федерации практически отсутствуют. В то же время,
европейская территория России достаточно хорошо исследована с точки
зрения генетического почвоведения, взаимосвязи почвенных свойств и
4
факторов почвообразования. Особенно подробно изученный почвенный покров агробиологических станций, научных стационаров и некоторых природных резерватов может являться перспективной основой для решения многих экологических задач почвенной метагеномики. Почвы данных площадок, расположенных в разных биоклиматических и природно¬географических условиях Европейской России, послужили объектами настоящего исследования.
Сочетание современных методов высокопроизводительного
секвенирования с классическим подходом генетического почвоведения
представляется многообещающим способом решения глобальных вопросов экологии почвенных микроорганизмов, касающихся взаимосвязи структуры микробных сообществ и свойств почвы.
Цель исследования
Анализ филогенетической структуры микробиомов генетических
горизонтов ряда почв европейской части России и выявление ее связи с физико-химическими факторами и особенностями почвенного генезиса.
Задачи исследования
1. Оценка общего филогенетического разнообразия микробиомов
генетических горизонтов ряда почв, различных по генезису и типам землепользования.
2. Выявление доминирующих таксонов прокариот в генетических горизонтах почв различных типов.
3. Определение наиболее значимых факторов, определяющих структуру и разнообразие почвенных прокариотных сообществ.
4. Сравнительный анализ структуры микробиомов почвенных горизонтов в связи с генетическими особенностями почв.
Научная новизна
Впервые с использованием высокопроизводительного секвенирования подробно изучены прокариотные сообщества полных профилей почв, от дневной поверхности до почвообразующей породы. В рамках одного исследования рассмотрен широкий спектр почвенных горизонтов генетически различных почв, сформированных в различных биоклиматических и геоморфологических условиях. Ряд почв и почвенных горизонтов впервые является объектом изучения почвенного прокариотного сообщества методами метагеномики. На данный момент настоящая работа, по всей видимости, является наиболее полным исследованием, совмещающим методы метагеномики с подходом генетического почвоведения. В работе впервые дана объемная характеристика филогенетической структуры и разнообразия почв европейской части России на основе анализа гена 16S рРНК.
Практическая значимость
Выявленные особенности структуры прокариотных сообществ, связанные с почвенно-климатическими свойствами, могут быть использованы в качестве биоиндикаторов состояния почвы. Метагеномная характеристика горизонтов почв различного генезиса может быть востребована для оценки устойчивости почвенных экосистем при воздействии на них естественных и антропогенных факторов. Результаты работы были отмечены премией Правительства Российской Федерации в области науки и техники для молодых ученых 2015 г. «за разработку молекулярно-генетического подхода к микробиологической оценке здоровья и ресурсного потенциала почв России».
Выполнение работы было поддержано:
проектом Российского Научного Фонда № 14-26-00079 «Био-физико-
химическая диагностика качества органического вещества почв для
разработки научно-теоретических основ агробиотехнологий», проектом
Российского Фонда Фундаментальных Исследований № 15-04-00918 А
6
«Минералого-микроморфологическая и микробиологическая диагностика почв солонцовых комплексов Северного Прикаспия».
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на конференциях: «Экология и биология почв» (Ростов-на-Дону, 2014); 13th symposium on bacterial genetics and ecology (Милан, Италия, 2015); XVIII Докучаевские молодежные чтения «Деградация почв и продовольственная безопасность России» (Санкт-Петербург, 2015); всероссийская конференция с международным участием «Современные методы исследований почв и почвенного покрова» (Москва, 2015); международная конференция «Г енетическая интеграция про- и эукариот: фундаментальные исследования и современные агротехнологии» (Санкт-Петербург, 2015).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 16 работ: 8 статей в рецензируемых научных журналах и 8 тезисов докладов на российских и международных научных конференциях.
Объем и структура диссертации
Материалы диссертации изложены на 111 страницах, содержат 8 таблиц, 17 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы (главы 1-3), описания объектов и методов исследования (глава 4), обсуждения результатов исследования (глава 5), заключения и выводов. Список литературы включает 149 источников.
Благодарности
Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю - Манучаровой Наталии Александровне - за ценные советы по обработке и структуризации экспериментального материала и помощь при подготовке текста рукописи.
Автор выражает признательность сотрудникам Почвенного института имени В.В. Докучаева: О.В. Кутовой, А.К. Тхакаховой, А.Д. Железовой и М.В. Семенову за помощь в проведении исследования, обработке данных и трактовке результатов метагеномного анализа, М.П. Лебедевой за содействие в исследовании сухостепных почв, Н.Б. Хитрову за активное участие в проведении полевых исследований, а также всем организаторам и участникам экспедиций и лабораторных исследований.
Особую благодарность автор выражает Ивану Юрьевичу Чернову за поддержку и ценные советы в процессе работы над рукописью.

Список литературы

ВЫВОДЫ
1. Установлено, что бактериальные сообщества почв, согласно
метагеномным данным, сформированы преимущественно девятью филумами: Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi, Firmicutes,
Gemmatimonadetes, Planctomycetes, Proteobacteria и Verrucomicrobia. Доминирующими филумами бактерий во всех исследованных почвенных микробиомах независимо от глубины залегания являются Proteobacteria и Actinobacteria.
2. Группа Actinobacteria составляет большую долю в микробиомах почв сухого и теплого климата (30-40 %), и меньшую - в микробиомах почв прохладного и влажного климата, например, темно-серой и дерново¬подзолистой (10-20 %).
3. В большинстве микробиомов выявлены малоисследованные представители домена Archaea, принадлежащие к филогенетической группе Thaumarchaeota. Наибольшей долей таумархеоты обладают в микробиомах верхних горизонтов степных почв.
4. Показано, что почвы с профилем, более дифференцированным по физико-химическим свойствам (солонец, дерново-подзолистая, агрочернозем) более дифференцированы по составу и разнообразию микробных сообществ.
5. Структура прокариотных сообществ черноземов определяется, прежде всего, типом почвенного горизонта. Микробиомы разных горизонтов (гумусо-аккумулятивных и минеральных), согласно анализу бета- разнообразия, образуют непересекающиеся кластеры при анализе на уровне семейств и более низких таксономических уровнях (при схожести гена 16S рРНК 91 % и более).
6. Прокариотные сообщества минеральных горизонтов менее различны по структуре, чем более лабильные сообщества гумусовых горизонтов.