ЄФІМЕНКО ОЛЕНА ЮРІЇВНА. МОРФО-ФУНКЦІОНАЛЬНИЙ СТАН ШЛУНКА ТА ТОВСТОЇ КИШКИ У ЩУРІВ РІЗНОГО ВІКУ ЗА УМОВ ВВЕДЕННЯ НАНОКРИСТАЛІЧНОГО ДІОКСИДУ ЦЕРІЮ

Краткое описание

ЄФІМЕНКО ОЛЕНА ЮРІЇВНА. Назва дисертаційної роботи: "МОРФО-ФУНКЦІОНАЛЬНИЙ СТАН ШЛУНКА ТА ТОВСТОЇ КИШКИ У ЩУРІВ РІЗНОГО ВІКУ ЗА УМОВ ВВЕДЕННЯ НАНОКРИСТАЛІЧНОГО ДІОКСИДУ ЦЕРІЮ"

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ
КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
На правах рукопису
ЄФІМЕНКО ОЛЕНА ЮРІЇВНА
УДК 546.655.4-31+616.33+616.34
МОРФО-ФУНКЦІОНАЛЬНИЙ СТАН ШЛУНКА ТА ТОВСТОЇ КИШКИ
У ЩУРІВ РІЗНОГО ВІКУ ЗА УМОВ ВВЕДЕННЯ
НАНОКРИСТАЛІЧНОГО ДІОКСИДУ ЦЕРІЮ
03.00.13 – фізіологія людини і тварин
Дисертація
на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Науковий керівник:
доктор біологічних наук,
старший науковий співробітник
Фалалєєва Тетяна Михайлівна
Київ – 2015
2
ЗМІСТ
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ 6
ВСТУП 7
РОЗДІЛ 1 ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ 12
1.1. Вікові особливості морфологічної будови шлунково-кишкового
тракту 12
1.1.1.Морфологічні зміни у шлунку з віком 12
1.1.2. Вікові особливості морфологічної будови тонкої кишки 13
1.1.3. Вікові зміни морфологічної будови товстої кишки 14
1.2. Вікові особливості моторної функції шлунково-кишкового тракту
15
1.2.1. Вікові особливості моторної функції шлунка 15
1.2.2.Особливості моторики тонкої кишки 16
1.2.3.Зміни моторики товстої кишки 17
1.2.4. Сучасні послаблюючі засоби 18
1.3. Загальна характеристика нанокристалічного діоксиду церію 19
1.3.1. Будова та фізико-хімічні властивості нанокристалічного
діоксиду церію 19
1.3.2. Токсичність нанокристалічного діоксиду церію 21
1.3.3. Нанокристалічний діоксид церію і проблема окислювального
стресу 22
1.3.4.Нанокристалічний діоксид церію і система органів травлення
24
РОЗДІЛ 2 МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ 25
2.1. Реактиви та матеріали, використані в роботі 25
2.2. Об’єкти та умови дослідження 25
3
2.3. Схема експерименту 26
2.4. Методика дослідження моторної функції травного тракту 27
2.5. Визначення скорочувальної активності гладеньких м’язів
шлунково-кишкового тракту щурів 29
2.5.1. Схема та умови проведення експерименту 29
2.5.2. Визначення кінетичних параметрів скорочувальних
відповідей гладеньких м’язів 30
2.5.3. Виділення актоміозину гладеньких м’язів шлунка та товстої
кишки щурів 32
2.5.4. Методика визначення АТФ-гідролазної активності
актоміозину гладеньких м’язів шлунку та товстої кишки. 33
2.5.5. Методика визначення вмісту карбонільних груп в
актоміозині 35
2.6 Гістологічний аналіз слизової оболонки шлунка та товстої кишки
щурів 35
2.7. Отримання біологічного матеріалу 35
2.8. Дослідження вмісту продуктів перекисного окиснення ліпідів у
плазмі крові, слизовій оболонці шлунка та тостої кишки щурів 37
2.9. Визначення активності ферментів антиоксидантної системи у
плазмі крові та слизовій оболонці шлунка щурів 38
2.10 Статистична обробка даних 39
РОЗДІЛ 3 ВИВЧЕННЯ ОНТОГЕНЕТИЧНИХ ЗМІН МОТОРНОЇ
АКТИВНОСТІ У ЩУРІВ 40
3.1. Дослідження вікових змін спонтанної та стимульованої моторики
шлунка та товстої кишки у щурів in vivo 40
3.2. Дослідження спонтанної скорочувальної активністі
багатоклітинних гладеньком’язових препаратів шлунка та товстої
кишки in situ у щурів різних вікових груп 48
4
3.3. АТФ-гідролазна активність актоміозину гладеньких м’язів шлунка
і товстої кишки у щурів різних вікових груп 51
3.4. Морфологічні зміни слизової оболонки шлунка та товстої кишки у
щурів різного віку 53
3.5 Окисно-антиоксидантна рівновага у слизовій оболонці шлунка та
товстій кишці, і сироватці крові щурів різного віку 65
РОЗДІЛ 4 ДОСЛІДЖЕННЯ ЕФЕКТИВНОСТІ ФАРМАКОЛОГІЧНОЇ
КОРЕКЦІЇ НАНОКРИСТАЛІЧНИМ ДІОКСИДОМ ЦЕРІЮ ВІКОВИХ
ЗМІН У ФУНКЦІОНУВАННІ МОТОРНОЇ АКТИВНОСТІ ШЛУНКА ТА
ТОВСТОЇ КИШКИ У ЩУРІВ 71
4.1. Дослідження гострої токсичності нанокристалічного діоксиду
церію на щурах 71
4.1.1. Визначення середньолетальної дози препарату, яка викликає
загибель 50% тварин групи (DL50) у щурів 71
4.1.2. Дослідження змін відносної маси органів щурів в умовах
введення нанокристалічного діоксиду церію в дозі 2000 мг/кг 74
4.2. Вплив нанокристалічного діоксиду церію на моторну функцію
шлунка та товстої кишки у щурів in vivo 76
4.3. Вплив нанокристалічного діоксиду церію на спонтанну скоротливу
активність гладеньком’язових препаратів травного тракту in situ у
щурів різних вікових груп 86
4.4. Вплив нанокристалічного діоксиду церію на АТФ-гідролазну
активність актоміозину гладеньких м’язів шлунку щурів різних
вікових груп 92
4.5. Вплив нанокристалічного діоксиду церію на АТФ-гідролазну
активність актоміозину гладеньких м’язів товстої кишки щурів
різних вікових груп 94
4.6. Вплив нанокристалічного діоксиду церію на ступінь окисної
5
модифікації актоміозину гладеньких м’язів шлунку і товстої кишки
щурів різних вікових груп 95
4.7. Вплив нанокристалічного діоксиду церію на морфологічні зміни
слизово-мязовогошару шлунка та товстої кишки у щурів 98
4.8. Вплив нанокристалічного діоксиду церію на окисноантиоксидантну рівновагу у слизовій оболонці шлунка та товстої
кишки, і сироватці крові щурів різного віку 107
РОЗДІЛ 5 ПОРІВНЯЛЬНА ДІЯ СУЧАСНИХ ПРОКІНЕТИКІВ ТА
НАНОКРИСТАЛІЧНОГО ДІОКСИДУ ЦЕРІЮ НА МОТОРНУ
ФУНКЦІЮ ТРАВНОГО ТРАКТУ У ЩУРІВ РІЗНОГО ВІКУ 114
5.1. Вплив прокінетиків на спонтанну моторну активність шлунка та
товстої кишки у щурів обох вікових груп 115
5.2. Порівняльна дія прокінетиків на стимульовану моторну активність
шлунка та товстої кишки у щурів 123
ЗАКЛЮЧЕННЯ 135
ВИСНОВКИ 150
СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ 151
6
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ
АФК – активні форми кисню
АТФ – аденозинтрифосфат
АХ – ацетилхолін
в/о – внутрішньоочеревинно
ВСС – верхній стравохідний сфінктер
в/ш – внутрішньошлунково
ДК – дієнові кон’югати
ІМА – індекс моторної активності
КЛЛМ – кіназа легких ланцюгів міозину
ЛММ – легкий мероміозин
ММК – мігруючий моторний комплекс
НДЦ – нанокристалічний діоксид церію
НСС – нижній стравохідний сфінктер
ПОЛ – перекисне окиснення ліпідів
С2 – субфрагмент 2
СОД – супероксиддисмутаза
СОШ – слизова оболонка шлунка
ТБК – тіобарбітурова кислота
ФЛЛМ – фосфатаза легких ланцюгів міозину
Фн – фосфор неорганічний
ШКТ – шлунково-кишковий тракт
ДПК дванадцятипала кишка
ГКР – гіперкалієвий розчин
7
ВСТУП
Актуальність теми. Старіння справляє виражені ефекти на шлунковокишковий тракт, викликаючи порушення фізіологічних функцій та збільшення
частоти його захворювань [1], в тому числі й таких, що пов’язані з
порушеннями моторики [2]. Зокрема, поширеність розладів моторики, таких як
нетримання калу і запорів, істотно зростає в залежності від віку [3-9]. Проте
знання механізмів старіння, які призводять до дисмоторики шлунковокишкового тракту, обмежені.
Оскільки частка людей похилого віку в структурі населення збільшується,
зокрема, за оцінками американського Бюро перепису населення очевидно, що
чисельність населення США в віці 85 років і старше збільшиться з 5 до 20 млн.
в період 5 до 20 млн в період з 2000 по 2050 рік [10], то питання вікових змін
моторної функції травного тракту залишається актуальною проблемою.
Зважаючи на те, що закрепи діагностують у 60% людей літнього віку та з
огляду на побічні ефекти сучасних прокінетичних препаратів, що
застосовуються для відновлення моторики травного тракту, пошук нових
прокінетиків не втрачає актуальності [11].
Сьогодні є перспективними інноваційні дослідження біологічних
властивостей різних наноматеріалів [12]. Зокрема, була показана ефективність
застосування діоксиду церію з нанокристалічною граткою як антиоксидантної,
імуномодулюючої, антибактеріальної та пребіотичної сполуки [4, 13-16]. Тому
нанокристалічний діоксид церію (НДЦ) привернув нашу увагу як можливий
прокінетичний засіб. На даний час інформація щодо впливу НДЦ на моторну
функцію травного тракту відсутня, що й обумовило мету та завдання наших
досліджень.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу
виконано в науково-дослідній лабораторії (НДЛ) «Фармакології та
8
експериментальної патології» ННЦ «Інститут біології» Київського
національного університету імені Тараса Шевченка у рамках науково-дослідної
теми № 11БФ036-01 «Механізми реалізації адаптаційно-компенсаторних
реакцій організму за умов розвитку різних патологій» (2011-2015 рр., №
держреєстрації 0111U004648). Робота виконана за фінансування Державного
агентства з питань науки, інновацій та інформатизації України в рамках
виконання науково–дослідної роботи «Експериментальне обґрунтування
застосування нанодисперсного діоксиду церію в гастроентерології, проктології
і геріатрії», № державної реєстрації 0113U006058.
Мета та завдання дослідження. Метою роботи було дослідити морфофункціональний стан шлунка та товстої кишки у молодих і старих щурів за
умов введення НДЦ. Відповідно до мети були поставлені наступні задачі:
1. Дослідити спонтанну та стимульовану моторну активність шлунка та
товстої кишки у молодих та старих щурів.
2. Вивчити вплив НДЦ на спонтанну та стимульовану моторну активність
шлунка та товстої кишки у щурів обох вікових груп.
3. Порівняти дію НДЦ на вікові зміни моторної активності шлунка та
товстої кишки щурів з ефектами сучасних прокінетиків.
4. Вивчити вплив НДЦ на морфологічний стан слизової та м’язової
оболонок шлунка та товстої кишки у щурів різного віку.
5. З’ясувати вплив НДЦ на функціональну активність скоротливих білків
гладеньких м’язів шлунка та товстої кишки щурів різних вікових груп.
6. Визначити вміст в гомогенаті шлунка і товстої кишки та плазмі крові
продуктів перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) (дієнових кон’югатів (ДК),
тіобарбітурової кислоти (ТБК)-активних продуктів, шиффових основ (ШО)) та
активність ферментів антиоксидантного захисту (супероксиддисмутази (СОД)
та каталази) за звичайних фізіологічних умов та за дії НДЦ у щурів різного
віку.
Об’єкт дослідження – вікові зміни моторної функції травного тракту.
9
Предмет дослідження – показники моторної функції, функціональні
характеристики актоміозину гладеньких м’язів, морфологічний та біохімічний
аналіз вікових змін слизової і м’язової оболонок шлунка і товстої кишки та дія
НДЦ на вказані показники.
Методи дослідження: фізіологічні, гістоморфологічні, біохімічні,
біофізичні, та методи математичної статистики.
Наукова новизна одержаних результатів. Отримані дані в
дисертаційному дослідженні свідчать про послаблення моторної активності
шлунка і товстої кишки щурів з віком. Вперше проведено дослідження дії НДЦ
на моторну функцію шлунково-кишкового тракту in vivo, на скоротливу
активність гладком’язових препаратів in situ, на показники функціональної
активності актоміозинового комплексу скоротливих білків гладеньких м’язів
шлунка та товстої кишки у щурів різного віку. Вперше показана прокінетична
дія НДЦ на моторну активність шлунка та товстої кишки у щурів обох вікових
груп. В порівнянні з відомими прокінетиками (Сеноде і Метаклопромід
(Церукал)) НДЦ зберігав прокінетичні властивості після 10-денного
застосування. Відновлення вікових змін моторної активності шлунка та товстої
кишки відбувається за рахунок нормалізації функціонування актоміозинового
комплексу. Вперше показано, що НДЦ посилював АТФ-азну активність
актоміозину гладеньких м’язів шлунка і товстої кишки, що зменшувалася у
старечих щурів. НДЦ відновлював про/антиоксидантну рівновагу в гомогенаті
шлунка і товстої кишки та плазмі крові, а також морфологічний стан слизової і
м’язової оболонок шлунка та товстої кишки у старечих щурів за умов 10-
денного введення.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати
поглиблюють уявлення про фізіологічні вікові зміни структури та функції
травного тракту. Дисертаційна робота була направлена на пошук нового
ефективного прокінетика. В роботі проведені доклінічні дослідження
ефективності НДЦ щодо впливу на моторику шлунка та товстої кишки та
10
визначення його гострої токсичності. Встановлено, що LD50 НДЦ є більшою за
2000 мг/кг, що підтверджує приналежність даної сполуки до V класу
токсичності (практично нетоксичні речовини), що є більше у 2000 разів
порівняно з вживаною дозою НДЦ. Це свідчить про дуже низьку токсичність
речовини. Отже, отримані дані свідчать про доцільність створення на основі
НДЦ терапевтичного препарату для лікування закрепів, а також для
профілактики їх виникнення.
Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведено пошук та
аналіз наукових літературних джерел за темою дисертації, проведено
експериментальні дослідження, статистичну обробку та теоретичне
обґрунтування одержаних результатів. Розробка методичних підходів,
обговорення та аналіз отриманих даних проведено за участю наукового
керівника д.б.н., с.н.с. Фалалєєвої Т.М. Морфологічна частина роботи
проведена за участю другого наукового керівника д.м.н. Курик О.Г. НДЦ для
експериментальних досліджень було люб’язно наданий членомкореспондентом НАНУ, проф., д.б.н. Співаком М.Я. (Інститут мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України). Біохімічні дослідження
проводились за консультативною допомогою д.б.н., с.н.с. Дворщенко К.О. з
НДЛ «Біохімії» ННЦ «Інститут біології» Київського національного
університету імені Тараса Шевченка. Дослідження моторної функції травного
тракту проводились за консультативною допомогою д.б.н., проф. Берегової Т.В.
та к.б.н. Савченко Ю.О. з НДЛ «Фармакології та експериментальної патології»
ННЦ «Інститут біології» Київського національного університету імені Тараса
Шевченка. Автор висловлює глибоку вдячність колегам за допомогу в
проведенні досліджень, співучасть яких у виконанні роботи відмічена у
спільних публікаціях.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації
доповідались та обговорювались на 4-ій Міжнародній науковій конференції
«Досягнення у фармакології та патології травного тракту» (Київ, Україна,
11
2012); 7-й Львівсько-люблінській конференції експериментальної та клінічної
біохімії (Львів, 2013); VII міжнародній науковій конференції
«Психофізіологічні та вісцеральні функції в нормі і патології» (Київ, 2014); 8-
му Міжнародному науковому симпозіумі з клітинного / тканинного ураження
та цитопротекції/органопротекції (Будапешт, Угорщина, 2008); XIX-му з’їзді
Українського фізіологічного товариства ім. П.Г. Костюка з міжнародною
участю, присвяченого 90-річчю від дня народження академіка П.Г.Костюка
(Львів, 2015).
Публікації. За результатами досліджень опубліковано 14 наукових праць:
9 статей (8 – у вітчизняних фахових виданнях (1 оглядова), 1 – у зарубіжному
виданні, з них 6 статей у журналах, що входять до наукометричних баз даних),
5 тез доповідей у матеріалах наукових конференцій та з’їздів.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі
вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, 3-х розділів
результатів власних досліджень з їх обговоренням, заключення, висновків,
списку використаних літературних джерел 211 посилань. Дисертація викладена
на 175 сторінках і проілюстрована 29 рисунками та 10 таблицями
Висновки біоетичної експертизи. У дослідженнях використані білі
нелінійні щури розведення віварію Навчально-наукового центру «Інститут
біології» Київського національного університету імені Тараса Шевченка.
Впродовж усього експерименту тварини не зазнавали жорстокого і негуманного
поводження за висновком комісії з питань біоетики Навчально-наукового
центру «Інститут біології» Київського національного університету імені Тараса
Шевченка від 10 березня 2015 року (протоколу № 3 від 10 березня 2015 року).
Дослідження відповідають основним вимогам щодо утримання та роботи з
лабораторними тваринами згідно правил Європейської конвенції щодо захисту
хребетних тварин, які використовуються в експериментальних дослідженнях та
інших наукових цілях [17] та Закону України [18].

Список литературы

ВИСНОВКИ
В дисертаційному дослідженні, відповідно до поставленої мети, було
встановлено послаблення моторної активності шлунка і товстої кишки у старих
щурів, виявлено стимулюючий вплив на моторику нанокристалічного діоксиду
церію, який також сприяв відновленню про/антиоксидантного та морфофункціонального стану слизової та м’язової оболонок шлунково-кишкового
тракту. У порівнянні з відомими прокінетиками сенаде і метаклопромідом
(церукал) нанокристалічний діоксид церію зберігав прокінетичні властивості
після 10-денного застосування. На основі результатів дослідження зроблені
наступні висновки:
1. З віком зменшується амплітуда і частота спонтанних та стимульованих
скорочень, індекс моторної активності, фазний індекс в шлунку і товстій
кишці у щурів.
2. Нанокристалічний діоксид церію після 10-ти денного введення
збільшував амплітуду, частоту, фазний та індекс моторної активності
спонтанної та стимульованої моторики шлунка та товстої кишки у щурів
молодих та старих груп.
3. Через добу після 10-денного введення сенаде і метаклопроміду (церукал)
моторна активність шлунка та товстої кишки була зниженою.
4. За умов 10-ти денного введення нанокристалічного діоксиду церію було
виявлено суттєве відновлення морфологічного стану слизової та м’язової
оболонок шлунка та товстої кишки у старих щурів.
5. Нанокристалічний діоксид церію посилював АТФ-гідролазну активність
актоміозину гладеньких м’язів шлунка і товстої кишки, що зменшувалася
у старих щурів.
151
6. Нанокристалічний діоксид церію відновлював про/антиоксидантну
рівновагу в гомогенаті шлунка, товстої кишки і сироватці крові, яка була
порушеною у старих щурів.