Полев, Дмитрий Евгеньевич. Молекулярно-генетическая характеристика последовательности HS.633957 человека

Краткое описание

Полев, Дмитрий Евгеньевич. Молекулярно-генетическая характеристика последовательности HS.633957 человека : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.02.07 / Полев Дмитрий Евгеньевич; [Место защиты: С.-Петерб. гос. ун-т].- Санкт-Петербург, 2010.- 148 с.: ил. РГБ ОД, 61 11-3/140

НЕГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «БИОМЕДИЦИНСКИЙ ЦЕНТР»

На правах рукописи

04201150527
ПОЛЕВ Дмитрий Евгеньевич МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ Hs.633957 ЧЕЛОВЕКА
специальность: 03.02.07 - генетика
ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург
2010
Научный руководитель: д.б.н. А.П. Козлов
Список сокращений и обозначений 4
Введение 7
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1 Геном человека 10
1.2 Регуляция транскрипции генов 11
1.2.1 Регуляторные элементы генов 12
1.2.2 Регуляция транскрипции генов за счёт метилирования ДНК 18
1.2.3 Регуляция транскрипции генов за счёт модификаций хроматина 21
1.2.4 Роль клеточного протоонкогена с-Мус в регуляции транскрипции генов 25
1.3 Некодирующие РНК 26
1.3.1 История обнаружения миРНК 28
1.3.2 Функции миРНК 31
1.3.3 Основные признаки миРНК 31
1.4 РНК-маркёры опухолей 36
Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ 41
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 52
3.1 Результаты анализа структуры кластера Hs.633957 базы данных UniGene 52
3.2 Результаты экспериментальной проверка экспрессии локуса Hs.633957 в нормальных и опухолевых тканях 53
3.3 Определение первичной структуры транскриптов локуса Hs.633957 59
3.4 Определение основной сплайсинговой формы РНК 64
3.5 Анализ открытых рамок считывания 67
3.6 Анализ вторичной структуры РНК 68
3.7 Поиск потенциальных мишеней предсказанной миРНК 70
3.8 Изучение регуляторных участков локуса 71
3.9 Модификации хроматина в районе локуса Hs.633957 72
3.10 Связь хроматина в районе первого экзона локуса Hs.633957 с транскрипционными факторами 75
3.11 Идентификация сайтов связывания транскрипционного фактора с-Мус 79
3.12 Филогенетический анализ локуса Hs.633957 81
3.13 Поиск гомологичных транскриптов 85
3.14 Происхождение повторов L2 и AluJo в локусе Hs.633957 85
3.15 Происхождение шпильки пре-миРНК Hs.633957 86
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ 91
4.1 Локус Hs.633957 транскрибируется с образованием различных форм транскрипта, но имеет одну доминирующую форму 91
4.2 В локусе Hs.633957 закодирована миРНК, потенциально способная регулировать экспрессию гена DPYS 92
4.3 Экспрессия локуса Hs.633957 обусловлена Мус-зависимым промотором, специфическим для приматов 94
44 Структурная и регуляторные области гена миРНК Hs.633957 произошли de novo у приматов 100
4.5 Последовательность Hs.633957 как онкомаркер 104
Заключение 107
Выводы 109
Благодарности 110
Список литературы 111
Приложения 129
Список сокращений и обозначений
Сокращения на русском языке:
г - грамм
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ЖКТ - желудочно-кишечный тракт
кДНК — комплементарная ДНК
МЖ - молочная железа
минтРНК - малые интерферирующие РНК
миРНК - микроРНК
мл - миллилитр
млн — миллион
нт - нуклеотид
нкРНК - некодирующая РНК ОРС — открытая рамка считывания
ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
ПИК — преинициаторный комплекс
п.н. - пар нуклеотидов
пре-миРНК - предшественник миРНК
НЦР - полимеразная цепная реакция
РНК - рибонуклеиновая кислота
с - секунда
РЭА - раково-эмбриональный антиген
ТСТ - точка старта транскрипции
ТФ — транскрипционный фактор
ЦРК - циркулирующие раковые клетки
Сокращения на английском языке:
BREu - upstream TFIIB recognition element (предшествующий элемент, распознающий TFIIB)
BSA —bovine serum albumin (бычий сывороточный альбумин)
CpG - динуклеотид CG (от "—С—phosphate—G—")
ChlP-seq chromatine immune precipitation and sequencing (иммунопреципитация хроматина с последующим секвенированием)
DPE - downstream promoter element (нижеследующий промоторный элемент)
DCE - downstream core element (нижеследующий коровый элемент)
EST - Expressed Sequence Tag (ярлык экспрессирующейся последовательности)
H(№)K(№)me( 1,2,3) - обозначение модификации хроматина, где Н(№) - название гистона, К(№) - положение лизина в белке, me( 1.2.3) - моно-, ди- или триметилирование
Н(№)К(№)ас - обозначение модификации хроматина, где Н(№) - название гистона, К(№) - положение лизина в белке, ас — ацетилирование
H2AK119ubl - убиквитилирование пістона Н2А по лизину 119 Inr - initiator (инициатор)
MTE — motif ten element (элемент мотив десять)
RACE - rapid amplification of cDNA ends (быстрая амплификация концов кДНК)
RLC - RISC loading complex (комплекс, заряжающий RISC)
RISC - RNA-induccd silencing complex (подавляющий комплекс, индуцированный РНК)
TBP - TATA-binding protein (ТАТА-связывающий белок)
б
Введение
В' 2001 году двумя независимыми группами исследователей были опубликованы черновые данные по секвенированию генома человека (Lander et al., 2001; Venter et al., 2001); в 2003 году завершился проект по расшифровке генома человека The Human Genome' Project. На сегодняшний день полностью отсеквенировано уже несколько индивидуальных человеческих геномов (Levy et al., 2007; Wheeler et al., 2008; Bentley et al., 2008; Wang et al., 2008; Ley et al., 2008; Ahn et al., 2009; Kim et al., 2009; McKernan et al., 2009; Drmanac, et al., 2010). Согласно данным по секвенированию размер гаплоидного генома человека составляет около 3*109 п.н., из которых только 5% относится к белок- кодирующим областям (Lander et al., 2001), тогда как транскрибируется 74-93% всего генома человека (Bimey et al., 2007). Очевидно, что основная часть транскриптов не кодирует белки. Возможно, они имеют некие регуляторные функции, но какие именно, в большинстве случаев мы не знаем, поэтому аннотация транскрибируемых участков генома человека остаётся актуальной задачей.
Одним из неаннотированных транскрибируемых участков генома человека является локус Hs.633957, ставший объектом данного исследования. Предпосылкой его изучения явились теоретические работы А.П. Козлова, в которых он развивает гипотезу об эволюционной роли опухолей в возникновении новых клеточных типов, получившей недавно название «эволюция путём дифференцировкп опухолевых клеток» (Kozlov, 1979, 1996, 2010; Kozlov et al., 1992; Козлов, 1976, 1983, 1987, 2008). Согласно этой гипотезе, неоплазмы предоставляют пространство и ресурсы для экспрессии и апробации новых генов, которые не могут проявится в нормальных тканях в силу отлаженной там регуляции экспрессии. Одним из основных следствий данной гипотезы является предсказание активации экспрессии множества молчащих участков генома в опухолях. Данное следствие в дальнейшем получило подтверждение.
В 2001 г. была опубликована статья с описанием нового подхода к поиску нуклеотидных последовательностей с онкоспецифическим характером экспрессии посредством анализа общедоступных баз данных клонотск кДНК (Baranova et al., 2001). Новизна подхода заключалась в том, что, вместо попарного сравнения опухоль-норма для каждой ткани, сравнивали все клонотеки кДНК, полученные из всех типов опухолей, со всеми клонотеками кДНК из всех возможных нормальных тканей. Всего для сравнения было использовано порядка 2 млн. последовательностей из 4 ООО клонотек кДНК. В результате был выявлен целый ряд последовательностей с опухолеспецифической экспрессией, которые потенциально могут быть онкомаркерами широкого профиля. Часть полученных результатов была подтверждена экспериментально методом ПЦР на панелях кДНК из различных нормальных и опухолевых тканей (Krukovskaja et al., 2005; Palena et al., 2007; Круковская и др., 2008).
Среди последовательностей с выраженной опухолевой экспрессией был локус, соответствующий кластеру Hs. 104073 по классификации базы данных UniGene. Данный кластер содержал 6 EST (от англ. Expressed Sequence Tag - ярлык экспрессирующейся последовательности), полученных из опухолевых клеток. Он был описан в базе как «транскрибируемый локус», поскольку входящие в него последовательности не кодируют белки, а их роль в организме не описана. Впоследствии, в ходе реструктуризации базы данных, кластер был расформирован, а основная часть составляющих его EST была перенесена в кластер Ils.633957. Далее под локусом Hs.633957 мы будем понимать участок 7 хромосомы человека, с которым выравниваются нуклеотидные последовательности EST, входящие в кластер Hs.633957 базы данных UniGene. Основной, представительной, последовательностью кластера мы считаем EST
ВХ119057, имеющую идентификационные номера ВХ119057.1 и 01:27841546 в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=nucleotide). Под транскриитом (РНК) Hs.633957 мы будем понимать РНК-продукт локуса Hs.633957.
Характер экспрессии локуса Hs.633957 вызывает к нему практический и теоретический интерес. Перед нами встали следующие вопросы: действительно ли локус экспрессируется только в опухолях и может быть использован как онкомаркер, за счёт чего это происходит, какова структура транскриптов локуса, кодирует ли он белок и может ли он иметь какую-то функцию в организме?
Целью данной работы является молекулярно-генетическая характеристика локуса человека, соответствующего кластеру Hs.633957 базы данных UniGene.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1. Определить полную нуклеотидную последовательность РНК- продукта локуса Hs.633957
2. Выявить возможные альтернативные РНК-продукты данного локуса
3. Описать регуляторную область локуса Hs.633957
4. Определить, в каких органах и тканях экспрессируется локус Hs.633957
5. Провести филогенетический анализ последовательности локуса Hs.633957
6. Определить функцию локуса IIs.633957

Список литературы

Выводы
1. Транскрибируемый локус Hs.633957 является геном, кодирующим миРНК и характеризующимся повышенной экспрессией в опухолях.
2. Ген Hs.633957 имеет четыре точки старта транскрипции, а его РНК- продукт - четыре варианта сплайсинга и две возможных точки полиаденилирования.
3. Доминирующим РНК-продуктом данного гена является ВХ119057- подобная форма РНК со сплайсингом по третьему З’-сплайс- акцепторному сайту первого интрона. с сохранением второго интрона и дистальной точкой полиаденилирования.
4. Экспрессия гена Hs.633957 регулируется GC-бокс-содержащим коровым промотором и проксимальным с-Мус-зависнмым промоторным элементом.
5. Ген Hs.633957 впервые появился до расхождения приматов и тупайеобразных, а его регуляторные и функциональные элементы сформировались у общего предка человека и мартышки, т.е. до расхождения обезьян Старого и Нового света.
Благодарности
В заключение я выражаю благодарность своему научному руководителю А.П.Козлову за предоставленную возможность выполнить данную работу, за оказанное содействие и руководство. Я благодарю Круковскую JI.JI. и Носову Ю.К. за содействие и поддержку при выполнении работы, Машарского А.Э. за помощь в секвенировании, Мурашёва Б.В. за ценные советы, а также весь коллектив «Биомедицинского центра» за создание дружеской атмосферы в лаборатории. Отдельно выражаю признательность доктору Чуди (С. Tchudi) из Йельского университета за предоставленную возможность выполнить часть работы в его лаборатории. Часть работы была выполнена при финансовой поддержке гранта Международного центра Фогарти (Fogarty International Center) (грант №D43TW1028).
но
Список литературы
1. Заридзе Д. Канцерогенез. Москва: Научный Мир, 2000. 420 с.
2. Киселева Н., Киселёв Ф. Деметилироваипе ДНК и канцерогенез. //
Биохимия. 2005. Т. 70, № 7. С. 900-911.
3. Козлов А. Г енная конкуренция и возможная эволюционная роль опухолей
и клеточных онкогенов // Теоретические и математические аспекты
морфогенеза. Москва: Наука, 1987.
4. Козлов А. Опухоли и эволюция // Вопросы онкологии. 2008. Т. 54, № 6. С. 695-705.
5. Козлов А. Принципы многоуровневого развития организмов // Проблемы анализа биологических систем. Москва: МГУ, 1983.
6. Козлов А. Регуляторные механизмы как выражение и результат эволюции конкурентных отношений между генами // Солёностные адаптации водных организмов. Ленинград: АН СССР, 1976. С. 237-248.