Бєлінська Ірина Василівна Гематологічні ефекти ан- типухлинних і антианемічних сполук похідного малеіміду та гетерополіядерних комплексів : Белинская Ирина Васильевна Гематологические эффекты ан- типухлинних и антианемических соединений производного малеимида и гетерополиядерных комплексов Belinskaya Irina Vasil'yevna Gematologicheskiye effekty an- tipukhlinnikh i antianemicheskikh soyedineniy proizvodnogo maleimida i geteropoliyadernykh kompleksov

Краткое описание

Бєлінська Ірина Василівна, старший науковий співро­бітник НДС «Мембранологія і цитологія» ННЦ «Інститут біології та медицини» Київського національного універ­ситету імені Тараса Шевченка: «Гематологічні ефекти ан- типухлинних і антианемічних сполук похідного малеіміду та гетерополіядерних комплексів» (03.00.11 - цитологія, клітинна біологія, гістологія). Спецрада Д 26.001.38 у Київ­ському національному університеті імені Тараса Шевченка

Київський національний університет імені Тараса Шевченка
Міністерство освіти і науки України
Київський національний університет імені Тараса Шевченка
Міністерство освіти і науки України
Кваліфікаційна наукова
праця на правах рукопису
БЄЛІНСЬКА ІРИНА ВАСИЛІВНА
УДК 576.31+612.11+616.15+577.15
ДИСЕРТАЦІЯ
ГЕМАТОЛОГІЧНІ ЕФЕКТИ АНТИПУХЛИННИХ І АНТИАНЕМІЧНИХ
СПОЛУК ПОХІДНОГО МАЛЕІМІДУ ТА ГЕТЕРОПОЛІЯДЕРНИХ
КОМПЛЕКСІВ
03.00.11 - цитологія, клітинна біологія, гістологія
Біологія
Подається на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук
Дисертація містить результати власних досліджень. Використання ідей,
результатів і текстів інших авторів мають посилання на відповідне джерело
І.В. Бєлінська
Науковий консультант: Рибальченко Володимир Корнійович, доктор
біологічних наук, професор, Заслужений діяч науки і техніки України
Київ - 2017

ЗМІСТ
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРЕЧЕНЬ………………………………......... 19
ВСТУП……………………………….............................…………………. 21
РОЗДІЛ 1 ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ……………………………………….. 30
1.1 Пухлинно-асоційовані зміни гемопоезу за розвитку
неопластичного процесу в організмі на прикладі колоректального
канцерогенезу ............................................................................................ 30
1.2 Роль міді і заліза у функціонуванні кровотворної системи... 33
1.3 Роль протеїнкіназ у проліферації і диференціюванні
гемопоетичних клітин ................................................................................. 36
1.3.1 Інгібітори протеїнкіназ, як протипухлинні препарати….. 42
1.4 Лейкемії (лейкози), як мішень гетерополіядерних комплексів і
похідних малеіміду з протипухлинною активністю………...................... 45
1.5 Неопластичні клітини ліній U-937, K-562, L1210
гемопоетичного походження, як модель лейкемії..................................... 49
1.6 Гематотоксичність у дослідженні механізмів впливу різних
речовин на проліферацію і диференціювання гемопоетичних клітин…. 50
1.7 Кислотна і лужна резистентність еритроцитів у дослідженнях
взаємодії металів та гетерополіядерних комплексів з плазматичною
мембраною клітин........................................................................................ 54
РОЗДІЛ 2 МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ……………….... 61
2.1 Дослідження морфофункціонального стану клітин крові у
щурів.............................................................................................................. 63
2.2 Оцінка морфофункціонального стану клітин кісткового мозку
у щурів........................................................................................................... 65
2.3 Визначення прямого і непрямого білірубіну у сироватці крові.. 66
2.4 Визначення концентрації катіонів заліза і міді у сироватці
крові…............................................................................................................ 66
16
2.5 Характеристика експериментальних груп дослідження…....…. 66
2.5.1 Експериментальна модель колоректального
канцерогенезу (раку товстої кишки), індукованого 1,2-диметилгідразином у дослідженнях гематологічних ефектів похідного
малеіміду на його тлі.................................................................................. 66
2.5.2 Дослідження субхронічного впливу похідного малеіміду
МІ-1 на клітини крові щурів………......................……………….........…. 69
2.5.3 Дослідження гематотоксичного впливу похідного
малеіміду МІ-1 у дозах, які у 5 і 10 разів перевищують ефективну
протипухлинну і порівняння з ефектами традиційного цитостака
5-фторуацилу …............................................................................................ 70
2.5.4 Вивчення гематологічних ефектів похідного малеіміду
МІ-1 на тлі оксидативного стресу індукованого СоCl2 …..….................. 71
2.5.5 Дослідження впливу Cu/Fe-гетерополіядерного
комплексу [Cu(dmen)2][Fe(CN)5(NO)] (код KL447) на показники клітин
крові та концентрацію іонів заліза і міді у сироватці крові за
експериментальної анемії у щурів.......................................................…... 71
2.5.6 Визначення гематотоксичної дії Cu/Fe-гетерополіядерного комплексу [Cu(dmen)2][Fe(CN)5(NO)] (код KL447)........... 72
2.5.7 Дослідження гематотоксичної дії
Cu/Zn-гетерополіядерного комплексу [Cu(en)2ZnCl4]*dmso …………… 73
2.6 Дослідження впливу похідного малеіміду МІ-1 на неопластичні
клітини гемопоетичного походження ……………..............................….. 73
2.7 Аналіз морфофункціонального стану мегакаріоцитарного
ростка кровотворення за хронічної мієлоїдної лейкемії та
ідіопатичного мієлофіброзу…..………................................…………….. 74
2.8 Дослідження агрегації тромбоцитів крові за хронічної
мієлоїдної лейкемії і ідіопатичного мієлофіброзу........………….…….. 75
2.9 Визначення впливу похідного малеіміду МІ-1 на неопластичні
гемопоетичні клітини за ідіопатичного мієлофіброзу………………..... 76
17
2.10 Кислотна і лужна резистентність еритроцитів у дослідженні
взаємодії гетерополіядерного комплексу з мембранами клітин….…… 77
2.11 Методи статистичного аналізу результатів досліджень……… 78
РОЗДІЛ 3 МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНИЙ СТАН КЛІТИН КРОВІ І
КІСТКОВОГО МОЗКУ ТА НЕОПЛАСТИЧНИХ ГЕМОПОЕТИЧНИХ
КЛІТИН ЗА ДІЇ ПОХІДНОГО МАЛЕІМІДУ І ГЕТЕРОПОЛІЯДЕРНИХ КОМПЛЕСІВ............................................................................ 79
3.1. Морфофункціональна характеристика клітин крові щурів за
канцерогенезу товстої кишки, індукованого 1,2-диметилгідразином.… 79
3.2 Гематологічні ефекти похідного малеіміду за 1,2-диметилгідразин-індукованого канцерогенезу товстої кишки у щурів................. 88
3.3 Морфофункціональна характеристика клітин крові та
кісткового мозку за cубхронічного і хронічного впливу похідного
малеіміду МІ-1............................................................................................... 102
3.4 Характеристика гемопоезу щурів за впливу 5- і 10-кратних
від ефективної доз похідного малеіміду порівняно з цитостатиком
5-фторурацилом ………............................................................................... 112
3.5 Морфофункціональний стан клітин крові за впливу похідного
малеіміду МІ-1 на тлі оксидативного стресу індукованого хлоридом
кобальта ………............................................................................................. 133
3.6 Вплив похідного малеіміду МІ-1 на неопластичні клітини
гемопоетичного походження різних напрямків диференціювання в
культурі клітин………….............................................................................. 140
3.6.1 Вплив похідного малеіміду МІ-1 на
морфофункціональний стан неопластичних клітин лінії U-937
моноцитарного напрямку диференціювання і за індукції їх
диференціювання форбол-12-міристат-13-ацетатом................................. 140
3.6.2 Вплив похідного малеіміду МІ-1 на
морфофункціональний стан неопластичних клітин лінії L1210 Влімфоцитарного напрямку диференціювання……………..……………. 157
18
3.6.3 Вплив похідного малеіміду МІ-1 на морфофункціональний
стан клітин еритролейкемії людини лінії К-562 ………………...…...… 164
3.6.3.1 Морфофункціональна характеристика мегакаріоцитів
кісткового мозку і тромбоцитів крові за хронічної мієлоїдної лейкемії.. 165
3.6.3.2 Вплив похідного малеіміду МІ-1 на
морфофункціональний стан лейкемічних клітин лінії К-562 та його
сумісна дія з гетерополіядерним комплексом [Cu(en)2[CdAc6]………… 171
3.7 Дослідження впливу ацетатного комплексу Сu/Cd з
етилендіаміном ([Cu(en)2[CdAc6], код РО244) та його складових (іонів
Сu,Cd, етилендіаміну і ацетату натрію) на стійкість еритроцитів за дії
кислоти (кислотна резистентість)……………………......................…… 175
3.8 Лужна резистентність еритроцитів за впливу ацетатного
гетерополіядерного комплексу Сu/Cd з етилендіаміном (РО244) та
його складових – іонів Сu,Cd, етилендіаміну й ацетату натрію..……… 184
3.9 Остеомієлофіброз як модель неопластичної проліферації
грануло- і мегакаріоцитарного ростків кровотворення………...………. 189
3.9.1 Вплив похідного малеіміду МІ-1 на морфофункціональний стан неопластичних гемопоетичних клітин за ідіопатичного
мієлофіброзу….............................................................................................. 202
3.10 Дослідження антианемічних властивостей
гетерополіядерного Cu/Fe-комплексу [Cu(dmen)2][Fe(CN)5(NO),
dmenN,N´диметилетилендіамін] (код KL447) і вміст катіонів заліза і
міді у сироватці крові за експериментальної анемії у щурів….....……. 207
3.11 Гематотоксична дія гетерополіядерного Cu/Fe-комплексу
[Cu(dmen)2][Fe(CN)5(NO),dmenN,N´диметилетилендіамін](кодKL447) 223
АНАЛІЗ І УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ……….............................. 238
ВИСНОВКИ……………………..………………..……………………….. 267
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ………………………..……….. 270
Додатки.......................................................................................................... 333
19
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ
ДМГ – 1,2-диметилгідразин
IM – ідіопатичний мієлофіброз
ІЛ (ІL) – Інтерлейкіни
КФ – кисла фосфатаза (КФ 3.1.3.2)
Л:Е – лейко-еритробластичне співвідношення
МІ-1 – похідне малеіміду
МСН – сердній вміст гемоглобіну в еритроциті (Mean
Corpuscular Hemoglobin)
МСНС – сердня концентрація гемоглобіну в еритроциті (Mean
Corpuscular Hemoglobin Concentration)
МСV – сердній об’єм еритроциту (Mean Corpuscular Volume)
ПК – протеїнкіназа
ПКС – протеїнкіназа С
СІАТ – сумарний індекс агрегації тромбоцитів
СЦК – середній цитохімічний коефіцієнт
ХМЛ – хронічна мієлоїдна лейкемія (хронічний мієлоїдний
лейкоз)
ХЛЛ – хронічна лімфоцитарна лейкемія (хронічний
лімфоцитарний лейкоз)
ФМА – форбол-12-мірістат-13-ацетат (індуктор
диференціювання, активатор протеїнкінази С)
dmen – N,N´диметилетилендіамін
en – етилендіамін
EGF (EGFR) – Епідермальний фактор росту (рецептор
епідермального фактору росту)
FGF (FGFR) – Фактор росту фібробластів (рецептор фактора росту
фібробластів)
GM-CSF – Гранулоцитарно-макрофагальний фактор росту
20
HER2 – рецептор епідермального фактору росту людини
(human epidermal growth factor receptor 2)
KL447 – гетерополіядерний Cu/Fe-комплекс
[Cu(dmen)2][Fe(CN)5(NO)]
L1210 – лейкемічні В-клітини миші
PAS – Periodic Acid Shiff reaction-позитивні продукти (до
яких належать глікоген)
PDGF – тромбоцитарний ростовий фактор (platelet derived
growth factor)
PDK1 – 3-фосфоінозитид-залежна протеїнкіназа-1
(3-phosphoinositide-dependent kinase 1)
PO244 – Cu/Cd гетерополіядерний комплекс [Cu(en)2[CdAc6]
SCF – Фактор Стила (фактор росту стовбурових клітин)
Src(h) – гомолог онкогену саркоми Рауса (Rous sarcoma
oncogene cellular homolog)
Syk(h) – тирозинкіназа селезінки людини (Spleen tyrosine kinase
human)
TNF – фактор некрозу пухлин (tumor necrosis factor)
TPO – тромбопоетин
VEGF (VEGFR) – Васкулярно-ендотеліальний фактор росту (рецептор
васкулярно-ендотеліального фактору росту)
YES – Гомолог 1 онкогену саркоми Ямагучі (Yamaguchi
sarcoma viral oncogene homolog 1)
ZAP70 – зета-ланцюг-асоційована протеїнкіназа 70 (Zeta-chainassociated protein kinase 70)
К-562 – клітини еритролейкемії людини, містять
філадельфійську хромосому (Ph+) і химерний ген
BCR/ABL
21
ВСТУП
Актуальність теми. Зростання тривалості життя населення Землі
збільшує частоту онкологічних та серцево-судинних захворювань [280, 341,
511]. Серед причин смертності від онкологічних захворювань рак товстої
кишки посідає друге місце, а лейкемії (лейкози) – восьме [128, 148, 405, 544].
Існуючі методи лікування цих патологій включають медикаментозну терапію,
яка не є органоспецифічною і характеризується високою токсичністю [30, 47,
305, 410]. Це стимулює пошук нових речовин, здатних пригнічувати ріст
пухлин, істотно не впливаючи на інші тканини організму [242, 465, 506, 547].
Однією з причин розвитку онкологічних хвороб людини є порушення
функції протеїнкіназ (ПК), зазвичай це надмірна їх активація [122, 173, 203,
398, 412, 452, 578]. Тому актуальним є вивчення протипухлинних сполук,
спрямованих на процеси злоякісної трансформації клітин, тобто дослідження в
галузі молекулярно-спрямованої (таргетної) терапії [144, 145, 202, 205, ].
Потенційними мішенями такої терапії є злоякісний ангіогенез, процеси
апоптозу, гени-супресори пухлин, диференціювання пухлинних клітин і контроль клітинного циклу [189, 204, 339, 546, 586, 548]. Особливістю препаратів
цієї групи є переважно цитостатична, а не цитотоксична дія [180, 287, 313].
Розвиток пухлин в організмі супроводжується комплексними змінами у
багатьох тканинах, які безпосередньо не залучені до пухлинного процесу. До
них належить і кровотворна тканина, клітини якої мають високий рівень
проліферації. Зміни показників крові є першими ознаками патологічних
процесів в організмі і прогностичним фактором перебігу та лікування захворювання [41, 43, 166, 178, 255, 316, 552]. Використання експериментальних
моделей пухлин забезпечує можливість вивчати механізми канцерогенезу, а
також пухлинно-асоційовані зміни гемопоезу, і розробляти заходи їх
профілактики та лікування. Однією з таких моделей є канцерогенез товстої
кишки у гризунів під впливом диметилгідразину (ДМГ) [87, 466, 467, 573]. На
всіх стадіях виникнення і розвитку пухлин (ініціації, активації і злоякісного
22
переродження) відбувається підсилення вільнорадикального окиснення і
порушення антиоксидантних захисних систем, що призводить до
оксидативного стресу [32, 46, 122, 314, 455, 468]. Тому для більш адекватної
оцінки дії нових сполук доцільно вивчати їх за моделювання системного
ушкодження організму та оксидативного стресу [149, 377].
Похідні малеіміду (дигідропіролу) і гетерополіядерні комплекси, які
мають антипухлинні та бактерицидні властивості, були синтезовані
співробітниками хімічного факультету Київського національного університету
імені Тараса Шевченка [54, 55, 78]. Похідні малеіміду створювались in silico як
конкурентні інгібітори АТФ-зв’язуючого сайту протеїнкіназ [263, 575]. Максимальну антинеопластичну активність in vitro і in vivo виявила сполука 1-(4-Clбензил)-3-Cl-4-(CF3-феніламіно)-1Н-пірол-2,5-діон (далі МІ-1) [54, 55; роботи
групи під керівництвом Рибальченка В.К.: 39, 87, 80, 576], основним механізмом дії якої є інгібування мембранозв’язаних (FGF-R1, EGF-R(h), VEGF-R1,2,3
та ін.) та цитоплазматичних (Yes, Src(h), Syk(h), PDK1, ZAP70 та ін.)
протеїнкіназ [262]. Антипухлинну активність виявляв також гетерополіядерний
комплекс РО244 [Cu(en)2][Cd2(CH3COO)6] [37, 78, 448]. Розвиток пухлин в
організмі призводить до порушень функціонування кровотворної тканини,
наслідком чого є розвиток анемії, зміни складу і вмісту лейкоцитів і
тромбоцитів, що ускладнюють перебіг онкологічних захворювать, залучаються
до прогресії пухлин і зменшують ефективність протипухлинної терапії [36, 94,
172, 178, 196, 403, 478]. Ці стани також пов’язані із зсувом ендогенного фону
металів в організмі, залучених до функціонування як нормальних тканин, так і
неопластичних клітин [32, 226, 406, 545].
Виходячи із вищевикладеного, інгібітори протеїнкіназ (наприклад, МІ-1) і
гетерополіядерні (різнометалічні) комплекси можуть відігравати важливу роль
у регуляції проліферації, диференціюванні та функціонуванні нормальних
клітин та трансформованих, у тому числі гемопоетичних [180, 193, 197, 199,
420, 234, 480, 584]. Надзвичайно висока вартість існуючих інгібіторів протеїнкіназ іноземного походження обмежує доступ до них населення України. Тому
23
актуальність створення препаратів таргетної дії вітчизняного походження та
дослідження їх гематологічних ефектів не викликає сумнівів.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота
виконана у рамках науково-дослідних тем: Київського національного
університету імені Тараса Шевченка «Прямий синтез та біологічні властивості
гетерополіядерних комплексів перехідних металів» (№ держреєстрації
0106U006627, 2006-2010 р.), «Дослідження механізмів функціонування органів
травного тракту та розробка методів їх корекції» (№ держреєстрації
0106U005755, 2006-2010 р.), «Механізми реалізації адаптаційнокомпенсаторних реакцій організму за умов розвитку різних патологій»
(№ держреєстрації 0111U004648, 2011-2015 р.), «Похідні піролу як
протизапальні та протипухлинні сполуки нового покоління» (№ держреєстрації
0116U002639, 2016-2017) та договору про наукове співробітництво між
Київським національним університетом імені Тараса Шевченка та ДУ
«Національний науковий центр радіаційної медицини» НАМН України (2007-
2010, 2016-2021). Тема дисертаційної роботи затверджена на засіданні вченої
ради ННЦ «Інститут біології» Київського національного університету імені
Тараса Шевченка, протокол № 5 від 12 листопада 2012 року. Редакційні зміни
затверджені на засіданні вченої ради ННЦ «Інститут біології та медицини»
Київського національного університету імені Тараса Шевченка, протокол № 9
від 28 лютого 2017 року.
Мета і завдання дослідження. Метою роботи було встановити
особливості розвитку гематологічної відповіді на вплив сполук з
антипроліферативною та антианемічною активностями (похідного малеіміду і
гетерополіядерних комплексів) in vivo і дослідити їх вплив in vitro на
проліферативну активність і морфофункціональний стан неопластичних клітин
гемопоетичного походження із різними напрямками диференціювання.
Відповідно до мети були поставлені такі завдання дослідження:
1. Дослідити субхронічний і хронічний вплив похідного малеіміду МІ-1
на якісні і кількісні показники клітин крові та кісткового мозку.
24
2. Надати морфофункціональну характеристику клітин крові та
кісткового мозку за раку товстої кишки, індукованого диметилгідразином.
3. Дослідити вплив похідного малеіміду на морфофункціональні
особливості клітин крові та кісткового мозку за розвитку раку товстої кишки,
індукованого диметилгідразином.
4. З’ясувати вплив високих концентрацій похідного малеіміду (які у п’ять
та десять разів перевищують ефективну дозу) на морфофункціональний стан
клітин крові і кісткового мозку і порівняти його дію з ефектами традиційного
протипухлинного препарату 5-фторурацилу.
5. Встановити гематологічні ефекти похідного малеіміду МІ-1 за
оксидативного стресу, викликаного введенням СоСl2.
6. З’ясувати мембранотропні властивості Cu/Cd-гетерополіядерного
комплексу [Cu(en)2][Cd2(CH3COO)6] і його складових за результатами кислотної
і лужної резистентності еритроцитів.
7. Дослідити антипроліферативну активність похідного малеіміду МІ-1 і
Cu/Cd-гетерополіядерного комплексу на неопластичних клітинах
гемопоетичного походження із різними напрямками диференціювання.
8. Встановити зміни показників клітин крові та вміст катіонів міді і заліза
у сироватці крові за застосування Cu/Fe-гетерополіядерного комплексу
[Cu(dmen)2][Fe(CN)5(NO)] за експериментальної анемії у щурів.
9. Оцінити побічну негативну дію гетерополіядерних комплексів і
похідного малеіміду як біологічно активних антипроліферативних і
антианемічних сполук на кровотворну систему.
Об’єкт дослідження  ефекти похідного малеіміду і гетерополіядерних
комплексів на клітини крові та кісткового мозку щурів за умов підгострого і
хронічного введень та диметилгідразинового канцерогенезу товстої кишки;
ефекти цих сполук на неопластичні клітини гемопоетичного походження із
різними напрямками диференціювання.
Предмет дослідження  морфофункціональний стан клітин крові і
кісткового мозку щурів при дії гетерополіядерних комплексів і похідного
25
малеіміду та за застосування МІ-1 на тлі диметилгідразинового канцерогенезу
товстої кишки й оксидативного стресу; проліферативна активність і
морфофункціональний стан неопластичних клітин гемопоетичного походження
із різними напрямками диференціювання за дії гетерополіядерного комплексу і
похідного малеіміду.
Методи дослідження. У роботі використані цитологічні і цитохімічні
методи дослідження клітин крові і кісткового мозку, культури гемопоетичних
клітин; проточну флюорометрію для оцінки клітинного циклу; біохімічні
методи визначення концентрації гемоглобіну, катіонів заліза і міді, агрегації
тромбоцитів, кислотної і лужної резистентності еритроцитів крові; статистичні
методи аналізу результатів дослідження.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано, що похідне
малеіміду МІ-1 (1-(4-Cl-бензил)-3-Cl-4-(CF3-феніламіно)-1Н-пірол-2,5-діон) і
гетерополіядерні комплекси Cu/Cd [Cu(en)2[CdAc6] та Cu/Fe
[Cu(dmen)2][Fe(CN)5(NO)] окрім антипухлинних і антианемічних властивостей,
мають низьку гематотоксичність.
МІ-1 у ефективній протипухлинній дозі 2,7 мг/кг за диметилгідразинового канцерогенезу товстої кишки у щурів запобігає розвитку анемії, яка
ускладнює перебіг онкологічних захворювань, і нормалізує кількість моноцитів
і тромбоцитів у крові, зменшуючи залучення цих клітин до прогресії розвитку
пухлин. Зниження моноцитозу і тромбоцитозу може бути опосередковане як
зменшенням кількості і розміру пухлин та площі ураження товстої кишки, так і
пригніченням проліферації та диференціювання гемопоетичних клітин
кісткового мозку через інгібування активності протеїнкіназ. Гематотоксичний
вплив МІ-1 за хронічного застосування у дозах, які пригнічують канцерогенез
товстої кишки, відсутній.
На відміну від 5-фторурацилу, збільшені у 5- та 10-разів (від ефективної
протипухлинної) дози МІ-1 викликають активацію еритропоезу (ретикулоцитоз
та збільшення еритроїдних гемопоетичних клітин) без змін об’єму, вмісту і
концентрації гемоглобіну в еритроцитах. Це може бути компенсаторною
26
реакцією на зниження життєздатності еритроцитів. Активуючий вплив МІ-1 на
еритропоез виявлено і за сумісного впливу з хлоридом кобальту. МІ-1 знижує
кількість лейкоцитів і моноцитів у крові (що пов’язано з їх активним виходом
у тканини), а також пригнічує тромбоцитопоез.
Вперше встановлено, що МІ-1 пригнічує проліферативну активність і
життєздатність неопластичних гемопоетичних клітин ліній U-937 (монобластні
лейкемічні клітини людини), L1210 (лейкемічні B-клітини миші), К-562
(клітини еритролейкемії людини), бластних клітин за ідіопатичного мієлофіброзу та індукує їх апоптоз. Поєднання МІ-1 з гетерополіядерним комплексом Сu/Cd з етилендіаміном [Cu(en)2[CdAc6] призводить до посилення антипроліферативного ефекту у чотири рази за дії на клітини лінії К-562 людини.
Вперше встановлено, взаємодія Сu/Cd-комплексу з мембраною
еритроцитів є результатом дії самого комплексу, а не продуктів його
дисоціації, що проявляється зменшенням стійкості еритроцитів до дії кислоти
або лугу і відрізняється від впливу його складових (катіонів Сu(ІІ) і Cd (ІІ),
етилендіаміну і ацетату натрію). Гетерополіядерний Cu/Fe-комплекс
([Cu(dmen)2][Fe(CN)5(NO)]) підвищує концентрацію міді у сироватці крові і
відновлює вміст сироваткового заліза за його дефіциту та еритроцитарні
показники за експериментальної анемії, що свідчить про антианемічні
властивості даної сполуки.
Практичне значення одержаних результатів. Відсутність токсичного
впливу похідного малеіміду на гемопоез за пригнічення проліферації
неопластичних клітин гемопоетичного похоження і канцерогенезу товстої
кишки, і посилення протипухлинного ефекту за поєднання з
гетерополіядерним Сu/Cd-комплексом є підгрунтям для створення нових
антиракових препаратів. Вартість такого лікування із застосуванням сполуки
МІ-1, за попередніми оцінками, буде у рази меншою порівняно із
закордонними аналогами, що дозволяє рекомендувати його для доклінічних
досліджень.
27
Результати досліджень впроваджені у навчальний процес кафедри
цитології, гістології та біології розвитку ННЦ «Інститут біології» Київського
університету імені Тараса Шевченка (2010 р., акт впровадження додається) та
увійшли до навчального посібника «Цитобіохімія крові» [97].
Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійним
науковим дослідженням, виконаним протягом 2003-2017 років на базі НДС
«Мембранології і цитології» ННЦ «Інститут біології та медицини» Київського
національного університету імені Тараса Шевченка та відділення радіаційної
онкогематології та трансплантації стовбурових клітин Інституту клінічної
радіології ДУ «Національний науковий центр радіаційної медицини» НАМН
України.
Автором особисто підібрана і проаналізована наукова література за
темою дисертації. За участю наукового консультата Рибальченка В.К.
дисертантом визначено напрямки дослідження, обгрунтовано мету і завдання
роботи. Автором особисто спланованні та виконанні (спільно зі співавторами
публікацій) експериментальні дослідження, проведена статистична обробка
результатів дослідження, їх аналіз і інтерпретація.
Вивчення ефектів МІ-1 на тлі ДМГ-індукованого канцерогенезу товстої
кишки проведені спільно з к.б.н. Линчак О.В. Дослідження морфофункціональних особливостей мегакаріоцитів кісткового мозку та тромбоцитів крові
хворих на хронічну мієлоїдну лейкемію та ідіопатичний мієлофіброз виконані
за сприяння д.м.н. Дягіль І.С. (завідувач відділення радіаційної онкогематології
та трансплантації стовбурових клітин ДУ «Національний науковий центр
радіаційної медицини НАМН України»). Дослідження культури клітин
виконані за методичною допомогою д.б.н. Гарманчук Л.В. Дослідження
клітинного циклу виконані спільно з д.б.н. Храновською Н.М. (завідувач НДЛ
Експериментальної онкології та лабораторії молекулярно-генетичної
діагностики Національного інституту раку). Узагальнення результатів
досліджень, а також формулювання основних положень та висновків проведені
спільно із науковим консультатом.
28
Апробація результатів дисертації. Основні наукові положення
дисертаційної роботи доповідались та обговорювались на наукових форумах:
Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, Україна,
2004); Всеукраїнській науково-практичній конференції „Анемічний синдром в
клініці внутрішніх хвороб” (Івано-Франківськ, Україна, 2008); 5-му Міжнародному науковому симпозіумі з клітинного/тканинного ураження та цитопротекції/органопротекції (Ялта, Україна, 2008); XIV Kонгресі Європейської
Асоціації Гематологів (Берлін, Німеччина, 2009); Міжнародній конференції
„Биоантиоксидант” (Москва, Россия, 2010); Міжнародній науковій конференції
“Cell Technology Week 2013” (Київ, Україна, 2013); 7 Львівсько-Люблінській
Конференції Експериментальної і клінічної біохімії (Львів, Україна, 2013); XII
Міжнародній науково-практичній конференції студентів, аспірантів та молодих
вчених «Шевченківська весна» (Київ, Україна, 2014); XIX Конгресі
Європейської Асоціації Гематологів (Мілан, Італія, 2014); IV З’їзді
Українського Товариства Клітинної біології із міжнародним представництвом
(Ужгород, Україна, 2014); XIX з’їзді Українського фізіологічного товариства
імені П.Г. Костюка з міжнародною участю, присвяченому 90-річчю від дня
народження академіка П.Г. Костюка (Львів, Україна, 2015); ХІ Українському
біохімічному конгресі (Київ, Україна, 2014); XX Конгресі Європейської
Асоціації Гематологів (Відень, Австрія, 2015); Науково-практичній
конференції «Мінімальна залишкова хвороба при солідних пухлинах» (Київ,
Україна, 2015); V З’їзді Українського Товариства Клітинної біології з
міжнародним представництвом (Одеса, Україна, 2016).
Публікації. За результатами дисертації опубліковано 40 наукових праць,
із них 25 статей, з яких 20 статей у фахових наукових виданнях України, 5 в
іноземних виданнях (11 належать до міжнародних наукометричних баз даних, з
них 5 у SCOPUS), та 15 тез доповідей у матеріалах вітчизняних та
міжнародних наукових конференцій і з’їздів.
Структура дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу,
огляду літератури, розділу з описом матеріалів і методів досліджень, розділу
29
власних досліджень, узагальнення результатів, висновків і списку
використаних джерел (містить 587 найменувань, у тому числі 155 –
кирилицею, 423 – латиницею та 2 додатки). Дисертація викладена на 332
сторінках, ілюстрована 103 рисунками і 16 таблицями.
Висновок біоетичної експертизи. Згідно висновку комісії з питань
біоетики Навчально-наукового центру «Інститут біології та медицини»
Київського національного університету імені Тараса Шевченка (протоколу № 1
від 20 лютого 2017 року) експериментальні дослідження не суперечать
загально прийнятим біоетичним нормам з дотриманням відповідних
міжнародних положень стосовно проведення експериментальних робіт та
клінічних досліджень. Дослідження виконано у відповідності вимогам
Хельсінської декларації (Всесвітня медична асамблея, 1964), Міжнародних
принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що
використовуються для дослідних та інших наукових цілей (Страсбург, 1986),
Декларації принципів толерантності (28 сесія ЮНЕСКО, 1995), Універсальної
декларації по біоетиці та правах людини (ООН, 1997), норм Конвенції про
захист прав людини у зв’язку з впровадженням нових біомедичних технологій,
прийнятою у 1997 році у м. Ов’єдо (Іспанія) та у відповідності до Закону
України № 3447 ІV “Про захист тварин від жорстокого поводження” [61, 495]

Список литературы

ВИСНОВКИ
У дисертаційній роботі встановлені особливості формування гематологічної
відповіді на вплив сполук з протипухлинною й антианемічною активностями.
Результати досліджень показали, що інгібітор протеїнкіназ похідне малеіміду
(МІ-1) знижує проліферативну активність та індукує апоптоз неопластичних
клітин і не впливає на клітини системи гемопоезу з високою проліферативною
активністю. Спільний вплив МІ-1 і Cu/Cd-гетерополіядерного комплексу
підсилює їх антипроліферативну дію. Cu/Fe-гетерополіядерному комплексу
притаманні антианемічні властивості і менша загальна токсичність порівняно з
солями металів, які входять до його складу.
1. Антипухлинна сполука похідне малеіміду МІ-1 у дозі 2,7 мг/кг
(ефективна протипухлинна) за диметилгідразинового колоректального
канцерогенезу у щурів запобігає розвитку анемії та нормалізує кількість
моноцитів і тромбоцитів у крові, зменшуючи залучення цих клітин до розвитку
пухлин. Зменшення моноцитозу і тромбоцитозу за впливу МІ-1 при канцерогенезі
товстої кишки опосередковане зменшенням кількості і розміру пухлин та площі
ураження товстої кишки.
2. Субхронічний вплив МІ-1 у дозах пригнічення колоректального
канцерогенезу (2,7 мг/кг) зменшує кількість лейкоцитів (за рахунок
нейтрофільних і еозинофільних гранулоцитів та моноцитів) у крові щурів і не
впливає на морфофункціональний стан еритроцитів (їх кількість, об’єм, середній
вміст і концентрацію гемоглобіну в еритроциті) і тромбоцитів. Хронічний вплив
МІ-1 у зазначених дозах не змінює кількості та морфофункціонального стану
клітин крові і кісткового мозку щурів.
3. Збільшення дози МІ-1 у п’ять і десять разів активує еритропоез
(ретикулоцитоз і збільшення еритроїдних гемопоетичних клітин) без змін об’єму
еритроцитів, вмісту і концентрації гемоглобіну в них на відміну від дії
5-фторурацилу, який зменшує кількість еритроцитів і ретикулоцитів у крові та
пригнічує еритропоез у кістковому мозку. Зменшення кількості тромбоцитів у
268
крові після впливу МІ-1 у вказаних дозах пов’язане зі зростанням кількості
незрілих мегакаріоцитів із одночасним збільшенням кількості гіпосегментованих і
мікромегакаріоцитів.
4. Похідне малеіміду МІ-1 у 5- і 10-кратних (від ефективної) дозах знижує
кількість лейкоцитів і моноцитів, що пов’язано з їх активним виходом у тканини.
Лейкопоез у кістковому мозку представлений усіма стадіями диференціювання
лейкоцитів, а їх вміст не відрізняється від контрольних значень, на відміну від
5-фторурацилу, який у дозі 8,6 мг/кг (ефективна протипухлинна) зменшує
кількість лейкоцитів (за рахунок лімфоцитів, моноцитів і нейтрофільних
гранулоцитів) у крові та пригнічує лейкопоез у кістковому мозку, а у п’ятикратній
від ефективної дозі (45 мг/кг) спричинює 100%-ву загибель щурів після першого
тижня введення на тлі глибокої супресії мієлопоезу.
5. Похідне малеіміду МІ-1 у дозі 5 мг/кг (1/100 ЛД50) за сумісного впливу з
хлоридом кобальту посилює активацію еритропоезу (зростає концентрація
гемоглобіну, кількість еритроцитів, гематокрит та кількість ретикулоцитів у крові
порівняно з контрольною групою, впливом лише одного МІ-1 та кількість
еритроцитів порівняно з ефектами хлориду кобальта); зменшує кількість лейкоцитів за рахунок моноцитів порівняно з контролем та ефектами хлориду кобальта.
6. Похідне малеіміду МІ-1 пригнічує проліферативну активність
монобластних лейкемічних клітин U-937 людини шляхом зростанням кількості
клітин у фазі проліферативного спокою Go/G1 і зменшення мітотичної активності
та індукції апоптозу. Сумісний вплив МІ-1 з індуктором диференціювання
форбол-12-мірістат-13-ацетатом (ФМА) посилює пригнічення проліферативної і
мітотичної активності U-937 із активацією апотозу клітин порівняно з дією самого
МІ-1 або ФМА. Тобто, антипроліферативний ефект МІ-1 зберігається під час
диференціювання U-937, індукованого ФМА.
7. МІ-1 пригнічує проліферативну активність і життєздатність мишачих
лейкемічних B-клітин лінії L1210 (IC50 – 0,016 мМ МІ-1 після 72 год дії), мієло- та
мегакаріобластних клітин за остеомієлофіброзу (IC50 – 0,012 мМ), а також
еритробластних Ph-позитивних лейкемічних клітин лінії К-562 людини
269
(IC50  0,002 мМ МІ-1 після 48 год дії), зменшує їх мітотичну активність та
індукує апоптоз. Сумісний вплив МІ-1 із гетерополіядерним Cu/Cd-комплексом
призводить до посилення антипроліферативного ефекту в цих клітинах у чотири
рази.
8. Взаємодіючи з мембранами еритроцитів, Сu/Cd-гетерополіядерний
ацетатний комплекс [Cu(en)2[CdAc6] зменшує стійкість цих клітин до дії кислоти і
лугу та пригнічує проліферативну активність еритробластних лейкемічних клітин
лінії К-562 людини (сумісний вплив з МІ-1 посилює пригнічення). Взаємодія з
еритроцитами є наслідком дії вихідної речовини, а не продуктів її дисоціації, що
підтверджується відмінним впливом даного комплексу і його складових (іонів
Сu(ІІ) і Cd (ІІ), етилендіаміну й ацетату натрію) на стійкість еритроцитів.
9. На моделі експериментальної анемії у щурів гетерополіядерний
Сu/Fe-комплекс [Cu(dmen)2][Fe(CN)5(NO)] у дозі 25 мг/кг відновлює вміст заліза
за його дефіциту і підвищує вміст міді у сироватці крові й відновлює такі
еритроцитарні показники, як концентрацію гемоглобіну в крові, середній вміст
гемоглобіну в еритроциті, кількість ретикулоцитів у крові.
10. Гематотоксична дія Сu/Fe-комплексу у дозі 100 мг/кг, яка перевищує за
вмістом заліза терапевтичну дозу у 4 рази, а міді – майже у 200 разів, після
субхронічного застосування проявляється зменшенням концентрації гемоглобіну,
кількості еритроцитів у крові, концентрації гемоглобіну в еритроцитах, а також
збільшенням об’єму еритроцитів і кількості ретикулоцитів, що свідчить про
розвиток гемолітичної анемії.
11. Протипухлинна (на моделі ДМГ-індукованого канцерогенезу товстої
кишки), антинеопластична (на моделях in vitro лейкемічних клітин людини і
тварин) дія похідного малеіміду МІ-1 і Сu/Cd- та Сu/Fe-гетерополіядерних
комплексів у поєднанні з їх антианемічною активністю і низькою токсичністю
може слугувати підгрунтям для їх доклінічних досліджень як антипухлинних
сполук нового покоління.