Бєляєва Аляксандра Вікторівна Цитогенетичні та морфофункціональні характеристики стовбурових клітин за дії кандесартану цилексетилу та ресвератролу

Краткое описание

Бєляєва Аляксандра Вікторівна, яка перебуває на науковому стажуванні як іноземна громадянка на умовах контракту в ННЦ «Інститут біології та медицини». Назва дисертації: «Цитогенетичні та морфофункціональні характеристики стовбурових клітин за дії кандесартану цилексетилу та ресвератролу». Шифр та назва спеціальності 03.00.11 цитологія, клітинна біологія, гістологія. Спецрада Д26.001.38 Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Київський національний університет імені Тараса Шевченка
Міністерство освіти і науки України
Київський національний університет імені Тараса Шевченка
Міністерство освіти і науки України
Кваліфікаційна наукова праця
на правах рукопису
БЄЛЯЄВА Аляксандра Вікторівна
УДК 576.08:576.53+615.017
ДИСЕРТАЦІЯ
ЦИТОГЕНЕТИЧНІ ТА МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ
СТОВБУРОВИХ КЛІТИН ЗА ДІЇ КАНДЕСАРТАНУ ЦИЛЕКСЕТИЛУ ТА
РЕСВЕРАТРОЛУ
03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія
Подається на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
Дисертація містить результати власних досліджень. Використання ідей,
результатів і текстів інших авторів мають посилання на відповідне джерело
________________А.В. Бєляєва
Науковий керівник: Гарманчук Людмила Василівна, д. б. н., проф.
Київ – 2021

ЗМІСТ
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ.......................................................................16
ВСТУП.........................................................................................................................18
РОЗДІЛ 1 .....................................................................................................................23
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ ...............................................................................................23
1.1 Основні уявлення про ангіогенез .......................................................................23
1.2 Особливості стовбурових клітин........................................................................27
1.2.1 Ембріональні і фетальні стовбурові клітини..........................................27
1.2.2 Стовбурові клітини пуповинної крові ....................................................29
1.2.3 Скелетні міобласти....................................................................................29
1.2.4 Клітини-сателіти серцевого м’язу ...........................................................31
1.2.5 Стовбурові клітини крові .........................................................................31
1.2.6 Стовбурові клітини кісткового мозку .....................................................32
1.2.7 Стобурові клітини жирової тканини .......................................................36
1.3. Фармакологічна регуляція стовбурових клітин ...........................................37
1.3.1 Гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор...................................37
1.3.2 Еритропоетин.............................................................................................38
1.3.3 Препарати класу тіазолідиндіонів (піоглітазон)....................................39
1.3.4 Гіпоглікемічні препарати (ситагліптин) .................................................41
1.3.5 Інгібітори 3-гідрокси-3-метилглутарил-коензим А-редуктази
(статини)..............................................................................................................42
1.3.6 Інгібітори ангіотензин-перетворюючого ферменту ..............................43
1.3.7 Антагоністи рецепторів ангіотензину II (cартани)................................45
1.4 Використання природних сполук для лікування серцево-судинних
захворювань ................................................................................................................50
1.4.1 Патринія .....................................................................................................50
1.4.2 Женьшень...................................................................................................51
1.4.3 Ресвератрол................................................................................................52
Висновки до розділу І................................................................................................54
РОЗДІЛ 2 .....................................................................................................................55
12
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ............................................................55
2.1 Реактиви та обладнання.......................................................................................55
2.2 Об’єкти дослідження ...........................................................................................56
2.2.1 Експериментальні тварини ......................................................................56
2.2.2 Культури клітин ........................................................................................56
2.3 Дослідження на експериментальних тваринах ................................................57
2.3.1 Вивчення ефектів кандесартану цилексетилу і ресвератролу на
цитогенетичні показники і параметри клітинної кінетики у мишей лінії
C57Bl/6 ................................................................................................................57
2.3.2 Вивчення ефектів кандесартану цилексетилу і ресвератролу на
цитогенетичні показники і параметри клітинної кінетики при фізичних
навантаженнях у мишей лінії Balb/C ...............................................................59
2.3.3 Вивчення показників токсичності кандесартану цилексетилу та
ресвератролу .......................................................................................................60
2.3.4 Методи введення досліджуваних речовин лабораторним
тваринам..............................................................................................................61
2.3.5 Методи забору крові у лабораторних тварин.........................................61
2.3.6 Оцінка рухливості мишей ........................................................................61
2.3.7 Оцінка маси тіла та внутрішніх органів лабораторних тварин............62
2.3.8 Дослідження кількості клітин з фенотипом CD117+ в кістковому
мозку та в крові тварин......................................................................................62
2.3.9. Оцінка цитогенетичних показників і параметрів клітинної
кінетики кісткового мозку і крові тварин за допомогою проточної
цитофлуориметрії...............................................................................................64
2.4 Дослідження in vitro.............................................................................................65
2.4.1 Дослідження впливу кандесартану цилексетилу, кандесартану і
ресвератролу на зміни кількості клітин-попередників ендотелію,
цитогенетичних показників і параметрів клітинної кінетики in vitro в
культурах клітин кісткового мозку мишей лінії C57Bl/6 і жирової
тканини людини .................................................................................................65
13
2.4.2 Дослідження впливу кандесартану цилексетилу, кандесартану та
ресвератролу на зміну кількості клітин з фенотипом CD117+, CD34+,
CD117+/CD34+ та CD31+ in vitro.....................................................................67
2.4.3 Аналіз впливу кандесартану цилексетилу, кандесартану та
ресвератолу на зміну цитогенетичних показників та параметрів
клітинної кінетики in vitro.................................................................................67
2.4.4 Метилтетразолієвий тест на визначення інгібуючих концентрацій
ресвератролу in vitro ..........................................................................................70
2.5 Статистична обробка отриманих результатів ...................................................71
РОЗДІЛ 3 .....................................................................................................................72
ДОСЛІДЖЕНН ВПЛИВУ КАНДЕСАРТАНУ ЦИЛЕКСЕТИЛУ,
КАНДЕСАРТАНУ І РЕСВЕРАТРОЛУ НА ЦИТОГЕНЕТИЧНІ
ПОКАЗНИКИ І ПАРАМЕТРИ КЛІТИННОЇ КІНЕТИКИ IN VITRO ...................72
3.1 Вивчення впливу кандесартану цилексетилу, кандесартану та
ресвератролу на зміни кількості клітин з CD117+ в культурі клітин
кісткового мозку мишей лінії C57Bl/6.....................................................................73
3.2 Вивчення впливу кандесартану цилексетилу, кандесартану і
ресвератролу на цитогенетичні показники і параметри клітинної кінетики в
культурі клітин кісткового мозку мишей лінії C57Bl/6 .........................................81
3.3 Вплив кандесартану цилексетилу, кандесартану і ресвератролу на число
клітин з CD117+, CD34+, CD117+/CD34+ і CD31+ в культурі клітин
жирової тканини людини ..........................................................................................90
3.4 Вплив кандесартану цилексетилу, кандесартану і ресвератролу на
цитогенетичні показники і параметри клітинної кінетики в культурі клітин
жирової тканини людини ..........................................................................................96
Висновки до Розділу 3 .............................................................................................105
РОЗДІЛ 4 ...................................................................................................................107
ВИВЧЕННЯ ЦИТОГЕНЕТИЧНИХ ПОКАЗНИКІВ І ПАРАМЕТРІВ
КЛІТИННОЇ КІНЕТИКИ КІСТКОВОГО МОЗКУ ТА КРОВІ ТВАРИН ПРИ
ЗАСТОСУВАННІ КАНДЕСАРТАНУ ЦИЛЕКСЕТИЛУ І РЕСВЕРАТРОЛУ ..107
14
4.1 Вивчення впливу кандесартану цилексетилу і ресвератролу на число
клітин з CD117+ в кістковому мозку і в крові мишей лінії C57Bl/6 ..................107
4.2 Дослідження цитогенетичних показників і параметрів клітинної
кінетики кісткового мозку мишей лінії C57Bl/6 при використанні
кандесартану цилексетилу і ресвератролу.............................................................111
4.3 Дослідження цитогенетичних показників і параметрів клітинної
кінетики крові мишей лінії C57Bl/6 при використанні кандесартану
цилексетилу і ресвератролу.....................................................................................120
4.4 Вплив кандесартану цилексетилу і ресвератролу на зміну відносної
маси серця мишей лінії C57Bl/6 .............................................................................126
4.5 Дослідження рухової активності мишей лінії C57Bl/6 при
короткочасному і тривалому введені кандесартану цилексетилу і
ресвератролу .............................................................................................................128
Висновки до розділу 4 .............................................................................................135
РОЗДІЛ 5 ...................................................................................................................137
ДОСЛІДЖЕННЯ ЦИТОГЕНЕТИЧНИХ ПОКАЗНИКІВ І ПАРАМЕТРІВ
КЛІТИННОЇ КІНЕТИКИ КІСТКОВОГО МОЗКУ ТА КРОВІ ТВАРИН ПРИ
ФІЗИЧНИХ НАВАНТАЖЕННЯХ, А ТАКОЖ ПРИ ПОДАЛЬШОМУ
ЗАСТОСУВАННІ КАНДЕСАРТАНУ ЦИЛЕКСЕТИЛУ І РЕСВЕРАТРОЛУ ..137
5.1 Вивчення впливу фізичних навантажень і подальше застосування
кандесартану цилексетилу і ресвератролу на число клітин з CD117+ в
кістковому мозку і в крові мишей лінії Balb/C .....................................................137
5.2 Вивчення впливу фізичних навантажень і подальшого застосування
кандесартану цилексетилу і ресвератролу на цитогенетичні показники і
параметри клітинної кінетики кісткового мозку мишей лінії Balb/C.................140
5.3 Вивчення впливу кандесартану цилексетилу і ресвератролу на
цитогенетичні показники і параметри клітинної кінетики крові мишей лінії
Balb/C при фізичних навантаженнях......................................................................146
5.4 Вплив кандесартану цилексетилу і ресвератролу на зміну маси серця
мишей лінії Balb/C при фізичних навантаженнях ................................................155
15
Висновки до розділу 5 .............................................................................................157
РОЗДІЛ 6 ...................................................................................................................159
ВИВЧЕННЯ ПОКАЗНИКІВ ТОКСИЧНОСТІ КАНДЕСАРТАНУ
ЦИЛЕКСЕТИЛУ І РЕСВЕРАТРОЛУ ....................................................................159
Висновки до розділу 6 .............................................................................................161
АНАЛІЗ ТА УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕННЯ....................162
ВИСНОВКИ..............................................................................................................170
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ................................................................172
Додаток 1...................................................................................................................203

Список литературы

ВИСНОВКИ
1. В дисертаційній роботі вперше виявлено, що кандесартану
цилексетил та кандесартан по-різному діють на вміст прогеніторних
ендотеліальних клітин in vitro: в концентраціях 1,5 мкг/мл і 3 мкг/мл
кандесартану цилексетил знижує вміст ендотеліальних прогеніторних клітин
з фенотипом CD117+ в культурі клітин кісткового мозку мишей лінії
C57Bl/6, тоді як кандесартан в цих концентраціях збільшує вміст клітин з
поверхневим клітинним маркером CD117 в культурах клітин кісткового
мозку мишей та жирової тканини людини, однак кандесартану цилексетил в
концентрації 3 мкг/мл, а кандесартан в концентраціях 1,5 мкг/мл і 3 мкг/мл
призводять до збільшення числа апоптичних клітин та клітин з мікроядрами.
2. Антиоксидант ресвератрол в концентраціях 30 мкг/мл і 50
мкг/мл стимулює утворення клітин з CD117+ в культурі кісткового мозку
мишей лінії C57Bl/6; а в концентраціях 10 мкг/мл, 30 мкг/мл і 50 мкг/мл
збільшує вміст клітин з фенотипом CD117+ в культурі жирової тканини
людини, і не є цитотоксичним.
3. Вперше показано, що застосування кандесартану цилексетилу
в концентрації 1,5 мкг/мл в комбінації з ресвератролом (30 мкг/мл і 50
мкг/мл), а кандесартану в концентрації 1,5 мкг/мл в комбінації з
ресвератролом (1 мкг/мл – 50 мкг/мл) призводить до суттєвого збільшення
популяції клітин з фенотипом CD117+ in vitro, а також зменшення числа
клітин з мікроядрами та ознаками апоптозу.
4. За введення кандесартану цилексетилу in vivo в дозі 3 мг/кг
ваги тварин зафіксовано в кістковому мозку мишей лінії C57Bl/6 збільшення
клітин з фенотипом CD117+, а в дозах 1,5 мг/кг і 3 мг/кг – збільшення
кількості останніх в крові тварин, однак в цих дозах кандесартану цилексетил
має цитотоксичні властивості, що виражаються в індукції апоптозу і
накопиченні клітин з мікроядрами в кістковому мозку тварин. Введення
ресвератролу в дозах 10 мг/кг і 50 мг/кг призводить до збільшення вмісту
171
клітин з фенотипом CD117+ в кістковому мозку і в крові мишей лінії
C57Bl/6, і не є цитотоксичним.
5. Вперше встановлено, що сумісне використання кандесартану
цилексетилу в дозі 1,5 мг/кг і ресвератролу в дозі 1 мг/кг призводить до
збільшення кількості клітин з фенотипом CD117+ в крові мишей лінії
C57Bl/6, а застосування кандесартану цилексетилу в дозі 1,5 мг/кг і
ресвератролу в дозах 10 мг/кг і 50 мг/кг – призводить до збільшення вмісту
зазначених клітин як в кістковому мозку, так і в крові тварин. Ефективність
комбінації кандесартану цилексетилу в дозі 1,5 мг/кг та ресвератролу в дозах
10 мг/кг та 50 мг/кг щодо мобілізації клітин з фенотипом CD117+ в
кістковому мозку та крові тварин суттєво вища в порівнянні із застосуванням
моноречовини кандесартану цилексатилу в дозі 1,5 мг/кг та співставна з
ефективністю кандесартану цилексатилу в дозі 3 мг/кг.
6. Вперше виявлено, що використання кандесартану цилексетилу
в дозі 3 мг/мл після фізичних навантажень у тварин призводить до
збільшення кількості клітин з фенотипом CD117+ в кістковому мозку та
крові мишей лінії Balb/C. Сумісне застосування кандесартану целексетилу в
дозі 1,5 мг/кг та ресвератролу в дозах 10 мг/кг, 30 мг/кг і 50 мг/кг після
фізичних навантажень у тварин призводить до збільшення кількості клітин з
фенотипом CD117+ в кістковому мозку і в крові мишей лінії Balb/C.
7. Встановлено, що тривалі та інтенсивні фізичні навантаження
збільшують число клітин з мікроядрами та апоптозом, введення кандесартану
цилексатилу в дозі 3 мг/кг збільшує число апоптичних клітин та клітин з
мікроядрами, тоді як за комбінації кандесартану цилексатилу з
ресвератролом в дозах 10 мг/кг, 30 мг/кг і 50 мг/кг негативний ефект
фізичних навантажень нівелюється, що проявляється в зменшенні кількості
апоптичних клітин і клітин з мікроядрами в крові мишей лінії Balb/C.