Сіромолот Андрій Андрійович Імунобіологічні властивості антигенів Mycobacterium spp. МРТ63 і МРТ83 та їх роль у діагностиці туберкульозу : Сиромолот Андрей Андреевич Иммунобиологические свойства антигенов Mycobacterium spp. МРТ63 и МРТ83 и их роль в диагностике туберкулеза

Краткое описание

Сіромолот Андрій Андрійович, аспірант 3-го року ден­ної форми навчання кафедри мікробіології та імунології ННЦ «Інститут біології та медицини» Київського національ­ного університету імені Тараса Шевченка: «Імунобіологічні властивості антигенів Mycobacterium spp. МРТ63 і МРТ83 та їх роль у діагностиці туберкульозу» (03.00.09 - імуно­логія). Спецрада Д 26.001.24 у Київському національному університеті імені Тараса Шевченка

Київський національний університет імені Тараса Шевченка
Міністерство освіти і науки України
Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна
Національної академії наук України
Київський національний університет імені Тараса Шевченка
Міністерство освіти і науки України
Кваліфікаційна наукова
праця на правах рукопису
СІРОМОЛОТ АНДРІЙ АНДРІЙОВИЧ
УДК 616-002.5+577.112+579.62
ДИСЕРТАЦІЯ
ІМУНОБІОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ АНТИГЕНІВ MYCOBACTERIUM
SPP. MPT63 І MPT83 ТА ЇХ РОЛЬ У ДІАГНОСТИЦІ ТУБЕРКУЛЬОЗУ
03.00.09 – імунологія
Подається на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
Дисертація містить результати власних досліджень. Використання ідей,
результатів і текстів інших авторів мають посилання на відповідне джерело
___________Сіромолот А.А.
Науковий керівник: Колибо Денис Володимирович, доктор біологічних наук,
професор
Київ – 2018

ЗМІСТ
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ.................................................................. 17
ВСТУП ................................................................................................................... 19
РОЗДІЛ 1 ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ ........................................................................ 25
1.1. Імунобіологія та епідеміологія туберкульозу........................................ 25
1.1.1. Деякі аспекти епідемії туберкульозу................................................ 25
1.1.2. Клітини чутливих до M.tuberculosis організмів, що залучені до
патогенезу та контролю перебігу мікобактеріальної інфекції................... 27
1.2. Характеристика окремих компонентів протеому мікобактерій та
патоген-асоційованих молекулярних патернів M.tuberculosis complex........ 30
1.2.1. Характеристика та властивості секреторного протеїну
M.tuberculosis MPT63 ..................................................................................... 30
1.2.2. Характеристика та властивості ліпопротеїну
M.tuberculosis MPT83 ..................................................................................... 32
1.2.3. Будова, імунобіологічні властивості та функції інших антигенів M.
tuberculosis....................................................................................................... 35
1.3. Підходи до розробки альтернативних діагностикумів туберкульозу
легень................................................................................................................... 40
1.3.1. Існуючі діагностичні методи обстеження хворих при
туберкульозі..................................................................................................... 40
1.3.2. Удосконалення компонентів імуноензимних тест-систем для
серологічної діагностики туберкульозу ....................................................... 43
РОЗДІЛ 2 ОБ’ЄКТИ, МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ ................ 47
2.1. Матеріали..................................................................................................... 47
2.1.1. Реактиви................................................................................................. 47
2.1.2. Обладнання............................................................................................ 48
2.1.3. Лабораторні тварини, культури клітин евкаріот, експресійні штами
бактерій та вектори......................................................................................... 49
2.1.4. Програмне забезпечення ...................................................................... 50
2.2. Методи.......................................................................................................... 50
2.2.1. Створення генетичної конструкції, що кодує повнорозмірний
антиген M.tuberculosis MPT83....................................................................... 50
13
2.2.2. Створення генетичних конструкцій, що кодують флуоресцентні
похідні MPT63 та MPT83, злитих з червоним флуоресцентним протеїном
mCherry ............................................................................................................ 51
2.2.3. Удосконалення генетичної конструкції, що кодує рекомбінантний
злитий протеїн MPT83-MPT63...................................................................... 52
2.2.4. Електрофоретичне розділення ДНК в поліакриламідному та
агарозному гелях............................................................................................. 52
2.2.5. Електрофоретичне розділення протеїнів у ДСН-ПААГ................... 53
2.2.6. Трансформація клітин E.coli та селекція позитивних клонів, що
експресують рекомбінантні антигени........................................................... 53
2.2.7. Індукція експресія рекомбінантних антигенів в прокаріотичній
системі експресії E.coli................................................................................... 54
2.2.8. Виділення та очищення рекомбінантних протеїнів методом металафінної хроматографії .................................................................................... 54
2.2.9. Вестерн-блот аналіз та хемілюмінесцентний аналіз......................... 55
2.2.10. Ковалентне мічення протеїнів флуорофором FITC ........................ 56
2.2.11. Одержання часток на основі фосфату кальцію та імобілізація на
них рекомбінантних антигенів M.tuberculosis ............................................. 57
2.2.12. Зимографія........................................................................................... 58
2.2.13. Одержання первинної культури перитонеальних макрофагів
миші.................................................................................................................. 58
2.2.14. Культивування культур евкаріотичних клітин................................ 59
2.2.15. Визначення цитотоксичної/цитостатичної активності
рекомбінантних протеїнів методом MTT-тесту .......................................... 59
2.2.16. Визначення пороутворюючих властивостей MPT63 та MPT83
методом спектрофлуориметрії ...................................................................... 60
2.2.17. Конструкція імунної фагової бібліотеки.......................................... 61
2.2.18. Одержання фагових частинок ........................................................... 61
2.2.19. Селекція MPT63 та MPT83 специфічних клонів-продуцентів scFv
антитіл.............................................................................................................. 62
2.2.20. Фільтр-аналіз (Lift Assay) колоній.................................................... 62
2.2.21. Імунізація лабораторних тварин та отримання
антисироваток до MPT63, MPT83 та MPT83-MPT63 ................................. 63
14
2.2.22. Прямий та непрямий імуноензимний аналіз.................................... 64
2.2.23. Протокова цитофлуориметрія .......................................................... 65
2.2.23.1. Оцінка впливу MPT63 і MPT83 на фагоцитарну активність
макрофагів ....................................................................................................... 65
2.2.23.2. Оцінка впливу мікобактеріальних антигенів на експресію
маркерів активації макрофагів....................................................................... 65
2.2.23.3. Пошук поверхневих та внутрішньоклітинних мішеней
рекомбінатних протеїнів MPT63 та MPT83 ................................................. 66
2.2.24. Підготовка та аналіз фіксованих препаратів для конфокальної
мікроскопії....................................................................................................... 67
2.2.25. Статистична обробка отриманих результатів.................................. 68
РОЗДІЛ 3 СТВОРЕННЯ РЕКОМБІНАНТНИХ АНТИГЕНІВ ТА ЇХ
ФЛУОРЕСЦЕНТНИХ ПОХІДНИХ .................................................................... 69
3.1. Конструювання та характеристика повнорозмірного антигену
M.tuberculosis MPT83......................................................................................... 69
3.2. Конструювання злитих протеїнів на основі антигенів M.tuberculosis
MPT63 та MPT83 та червоного флуоресцентного протеїну.......................... 71
3.3. Створення генетичної конструкції, що кодує химерний протеїн MPT83-
MPT63.................................................................................................................. 77
3.4. Висновки до розділу ................................................................................... 80
РОЗДІЛ 4 ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕНІВ M.TUBERCULOSIS MPT63 ТА MPT83
ІЗ КЛІТИНАМИ-МІШЕНЯМИ ........................................................................... 81
4.1. Дослідження взаємодії флуоресцентних похідних M.tuberculosis MPT63
та MPT83 з первинними культурами клітин ссавців...................................... 81
4.2. Дослідження взаємодії флуоресцентно-міченого MPT63 з поверхнею
малігнізованих клітин імунної системи........................................................... 83
4.3. Пошук внутрішньоклітинної мішені MPT63-FITC ................................. 86
4.4. Визначення спорідненості флуоресцентно-міченого MPT83 з клітинами
лінії U2149 .......................................................................................................... 88
4.5. Висновки до розділу ................................................................................... 91
РОЗДІЛ 5 ВПЛИВ MPT63 ТА MPT83 НА АКТИВАЦІЮ, ДОЗРІВАННЯ ТА
ЕНДОЦИТАРНУ АКТИВНІСТЬ ФАГОЦИТІВ................................................ 93
5.1. Дослідження впливу рекомбінантних антигенів M.tuberculosis MPT63
та MPT83 на фагоцитоз ..................................................................................... 93
15
5.1.1. Дослідження фагоцитозу кальцій-фосфатних наночасток
кон’югованих з MPT63 та МРТ83................................................................. 95
5.1.2. Дослідження впливу МРТ63 та МРТ83 на фагоцитоз клітин E.coli
………………………………………………………………………101
5.2. Дослідження впливу MPT63 та MPT83 на експресію маркерів
активації макрофагів CD11b та F4/80 ............................................................ 103
5.3. Оцінка впливу антигенів M.tuberculosis MPT63 та MPT83 на
життєздатність клітин імунної системи, сполучної та епітеліальної тканин
………………………………………………………………………….. 107
5.4. Дослідження апоптичного ефекту мікобактеріальних антигенів на
клітинах J774, A431 та 3T3 ............................................................................. 110
5.5. Оцінка пороутворювальної здатності рекомбінантних антигенів
MPT63 та MPT83.............................................................................................. 112
5.6. Активність матриксних металопротеїназ у кондиціонованому
середовищі J774 після стимуляції MPT63 та MPT83................................... 114
5.7. Вивчення впливу мікобактеріального антигену MPT63 на сигнальну
трансдукцію MAP кінази ERK1/2 та ядерного фактору κB ........................ 116
5.8. Висновки до розділу............................................................................... 118
РОЗДІЛ 6 ДОСЛІДЖЕННЯ ІМУНОГЕННИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ
МІКОБАКТЕРІАЛЬНИХ АНТИГЕНІВ ТА ОСОБЛИВОСТЕЙ
ГУМОРАЛЬНОЇ ВІДПОВІДІ ............................................................................ 119
6.1. Експресія та порівняльна характеристика отриманого злитого
рекомбінантного протеїну MPT63-MPT83 (повнорозмірний).................... 119
6.2. Варіабельність розпізнавання антигенів M.tuberculosis
поліклональними та scFv антитілами миші................................................... 122
6.3. Висновки до розділу ................................................................................. 128
РОЗДІЛ 7 РОЗРОБКА ТА ВИПРОБУВАННЯ ІМУНОЕНЗИМНИХ ТЕСТСИСТЕМ ДЛЯ СПЕЦИФІЧНОЇ ДІАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЬОЗУ ВРХ ТА
ЛЮДИНИ............................................................................................................. 130
7.1. Визначення чутливості та специфічності дослідного зразка тестсистеми «IB-Chem Anti-Mycobacterium tuberculosis» для діагностики
туберкульозу легень у населення ................................................................... 130
7.2. Порівняння діагностичної ефективності розробленого дослідного
зразка тест-системи та референтних тест-систем для діагностики
туберкульозу легень......................................................................................... 133
16
7.3. Випробування експериментальної тест-системи «IB-Chem AntiMycobacterium bovis» для специфічної діагностики туберкульозу ВРХ.... 135
7.4. Висновки до розділу ................................................................................. 140
АНАЛІЗ ТА УЗАГАЛЬНЕННЯ ОТРИМАНИХ РЕЗУЛЬТАТІВ................... 142
ВИСНОВКИ......................................................................................................... 150
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ........................................................... 152
ДОДАТОК 1……………………………………………..……………………….170

Список литературы

Висновки до розділу 3
На розвиток сюжету про Понтія Пілата в літературі другої половини
ХХ і на початку ХХІ ст., особливо на першому етапі даного періоду, тобто в
1950-1960 рр., значний вплив справила соціально-історична і культурноестетична ситуація в світі. Різноманітні авторські версії аналізованого
сюжету так чи інакше віддзеркалювали важкі повоєнні настрої європейської
інтелігенції, яка вважала попраними всі гуманістичні цінності і схилялася до
песимістичних оцінок здатності людини до добра та гуманізму. Особливо
212
наочно це демонструють твори Ф. Дюрренматта (оповідання "Пілат") і
П. Лаґерквіста (роман "Варавва"), в яких за допомогою умовно-символічних,
притчово-асоціативних форм (зокрема, через хронотоп зустрічі людини з
Богом) здійснюється оцінка сучасного богопокинутого стану людства крізь
призму позачасових, універсальних цінностей.
Специфічним вираженням даної тенденція стало звернення до
Понтієвого сюжету письменників із Радянського Союзу. Для них даний
сюжет мав перш за все соціально-історичну проекційність. Показово, що
твори В. Шаламова ("Прокуратор Іудеї") і Ю. Домбровського "Факультет
непотрібних речей", написані в перше повоєнне десятиліття, змогли побачити
світ лише в часи перебудови, і їх поява майже збіглася в часі з публікацією
роману Ч. Айтматова "Плаха", в якому також істотне місце зайняв епізод суду
Понтія Пілата над Ісусом Христом.
Поряд із соціально-історичним вектором переосмислення традиційного
сюжету про Понтія Пілата у творах, що належали до різних національних
літератур, істотною для даного сегменту літератури стала тенденція до
втілення авторського художньо-філософського світобачення на шляхах
"історичної реконструкції" євангельської історії. Вона по-різному проявилася
у творчості Р. Грейвза, Я. Добрачинського, Е. Берджеса, Л. Сухова та ін.
Якщо Р. Грейвз будує свою реконструкцію на основі власної наукової
концепції про позачасову значущість архетипу Білої Богині, а
Я. Добрачинський наближує євангельську добу до читача за допомогою
сповідальних інтонацій роману в листах, то Е. Берджес реміфологізує сюжет
про Понтія Пілата, наповнює його фікційними персонажами і значно
ускладнює образ прокуратора. Ще більшої екстенсивності набуває даний
сюжет у романі Л. Сухова, перетворюючись у фікційну біографію.
Своєрідною альтернативною версією євангельської історії є роман
Роже Кайюа "Понтій Пілат", в якому герой звільняється від мук сумління,
приймаючи рішення в суді над Ісусом його сторону і звільняючи з-під варти.
Це й альтернативний варіант, попри певні суперечності в сюжеті твору,
213
відкриває нові варіанти психологічного прочитання традиційного образу
світової літератури.
Філософською дискурсивністю відзначений роман Александра
Лернета-Холеньї "Пілат. Комплекс", в якому пропонується філософськи
узагальнений погляд на ситуацію суду Понтія Пілата над Ісусом Христом.
Оригінальне двопланове розгортання даного сюжету дає авторові змогу різко
зіткнути позиції всіх його учасників щодо фундаментальної проблеми "Що
таке істина", обговорення якої постає вічним дискурсом віри і сумніву, які
неминуче й нерозривно пов'язані між собою.
Нові тенденції трансформації Пілатового комплексу спостерігаються в
літературі межі ХХ і ХХІ століття. Для творів А. Берне, М.О. Сільва,
Ж. Сарамаґо, Е.-Е. Шмітта характерний суттєвий відхід як від подієвого
контенту євангельського протосюжету, так і його новаторство його
концептуального наповнення. Автори не лише олюднюють Спасителя й
Пілата, але й наділяють їх нетрадиційними біографіями, наповнюють їх
внутрішній світ сумнівами й напруженими пошуками істини, і тим самим
стверджують змістовну значущість дискурсивного взаємозв'язку центральних
образів цього традиційного сюжету, за допомогою оригінальних художніх
засобів акцентують закладені в ньому морально-філософські та духовноціннісні питання добра і зла, правди й істини, віри і сумніву.