Кукліна Тетяна Олександрівна Імуногенні влас­тивості іммобілізованого на мікро- та наночастках дифте­рійного токсоїду за умов пероральної імунізації : Куклина Татьяна Александровна Иммуногенные свойства иммобилизованного на микро- и наночастицы дифтерийного токсоиды в условиях пероральной иммунизации

Краткое описание

Кукліна Тетяна Олександрівна, молодший науковий співробітник відділу молекулярної імунології Інституту біо­хімії імені О. В. Палладіна НАН України: «Імуногенні влас­тивості іммобілізованого на мікро- та наночастках дифте­рійного токсоїду за умов пероральної імунізації» (03.00.09 - імунологія). Спецрада Д 26.001.24 у Київському національ­ному університеті імені Тараса Шевченка

Київський національний університет імені Тараса Шевченка
Міністерство освіти і науки України
Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна
Національна академія наук України
Київський національний університет імені Тараса Шевченка
Міністерство освіти і науки України
Кваліфікаційна наукова
праця на правах рукопису
КУКЛІНА ТЕТЯНА ОЛЕКСАНДРІВНА
УДК 612.017.12:615.375: 616-097:57.021
ДИСЕРТАЦІЯ
ІМУНОГЕННІ ВЛАСТИВОСТІ ІММОБІЛІЗОВАНОГО НА МІКРО- ТА
НАНОЧАСТКАХ ДИФТЕРІЙНОГО ТОКСОЇДУ ЗА УМОВ ПЕРОРАЛЬНОЇ
ІМУНІЗАЦІЇ
03.00.09 – імунологія
Подається на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
Дисертація містить результати власних досліджень. Використання ідей,
результатів і текстів інших авторів мають посилання на відповідне джерело
__________ Кукліна Т.О.
Науковий керівник Колибо Денис Володимирович доктор біологічних наук,
професор.
Київ – 2019

ЗМІСТ
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ................................................................ 12
ВСТУП ................................................................................................................. 14
РОЗДІЛ 1 .............................................................................................................. 22
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ ........................................................................................ 22
1.1 Імунна відповідь слизових оболонок ..................................................... 22
1.1.1 Особливості імунної відповіді слизових оболонок ........................ 22
1.1.2 Захисні функції слизових оболонок шлунково-кишкового тракту...
.............................................................................................................. 23
1.1.3 Імунна система слизових оболонок шлунково-кишкового тракту25
1.2 Вакцинація через слизові оболонки ....................................................... 29
1.2.1 Основні шляхи імунізації слизових оболонок ................................ 29
1.2.2 Пероральна імунізація слизових оболонок...................................... 30
1.3 Ад'ювантні сполуки та їхнє використання............................................. 31
1.3.1 Ад’ювант і система доставки, як засіб індукції імунітету слизових
оболонок........................................................................................................... 32
1.3.2 Ад'юванти на основі золота............................................................... 33
1.3.3 Ад'юванти на основі фосфату кальцію ............................................ 34
1.3.4 Ад'юванти на основі полімерних сполук......................................... 35
1.3.5 Ад'юванти на основі хітозану ........................................................... 37
1.4 Дифтерійний токсин як цільовий антиген .......................................... 37
РОЗДІЛ 2 .............................................................................................................. 41
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ........................................................ 41
2.1 Матеріали та обладнання......................................................................... 41
2.1.1 Матеріали та реактиви ....................................................................... 41
2.1.2 Обладнання ......................................................................................... 42
2.1.3 Лабораторні тварини, культури клітин евкаріот, експресійні
штами бактерій та вектори, що були використані у дослідженні.............. 42
2.1.4 Програмне забезпечення.................................................................... 44
2.2 Методи ....................................................................................................... 44
8
2.2.1. Експресія рекомбінантних антигенів в прокаріотичній системі
експресії E.coli................................................................................................. 44
2.2.2. Виділення та очищення рекомбінантних протеїнів методом металафінної хроматографії .................................................................................... 45
2.2.3. Методи отримання часток різного розміру та хімічної природи.. 46
2.2.4. Покриття часток на основі полі(D,L лактид-ко-гліколіду)
хітозаном.......................................................................................................... 50
2.2.5. Оцінка ефективності навантаження антигеном .............................. 50
2.2.6. Дослідження морфології отриманих часток.................................... 51
2.2.7. Дослідження розподілу отриманих часток за розміром методом
лазерної кореляційної спектрометрії ............................................................ 52
2.2.8. Дослідження розподілу отриманих часток за розміром методом
аналізу траєкторії часток................................................................................ 52
2.2.9. Визначення швидкості вивільнення протеїнів з часток ................. 53
2.2.10. Культивування еукаріотичних клітин в умовах in vitro.............. 53
2.2.11. Визначення життєздатності клітин з використанням МТТ тесту..
........................................................................................................... 53
2.2.12. Визначення шляху загибелі клітин з використанням Анексину V
та етидію броміду............................................................................................ 55
2.2.13. Аналіз ефективності фагоцитозу отриманих часток методом
протокової цитометрії .................................................................................... 55
2.2.14. Мічення часток флуоресцентною міткою FITC........................... 56
2.2.15. Аналіз ефективності фагоцитозу отриманих часток методом
конфокальної мікроскопії. ............................................................................. 57
2.2.16. Імунізація мишей отриманими кон’югатами часток з антигеном
та забір проб крові .......................................................................................... 58
2.2.17. Визначення рівня антитіл до досліджуваного антигену в
сироватці крові імунізованих мишей............................................................ 58
2.2.18. Статистична обробка отриманих результатів .............................. 60
РОЗДІЛ 3 .............................................................................................................. 61
ХАРАКТЕРИСТИКА ФІЗИЧНИХ, МОРФОЛОГІЧНИХ,
ЦИТОТОКСИЧНИХ ТА АД'ЮВАНТНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ ЧАСТОК
9
РІЗНОГО ПОХОДЖЕННЯ З ІММОБІЛІЗОВАНИМ ФРАГМЕНТОМ
ДИФТЕРІЙНОГО ТОКСОЇДУ .......................................................................... 61
3.1 Отримання рекомбінантного антигену................................................... 61
3.2 Характеристика комплексів часток різної хімічної природи та розміру
з іммобілізованим рекомбінантним похідним субодиниці В дифтерійного
токсоїду. .............................................................................................................. 62
3.2.1 Визначення ефективності навантаження часток рекомбінантним
похідним субодиниці В дифтерійного токсоїду .......................................... 63
3.2.2 Характеристика морфології отриманих часток різної хімічної
природи та розміру ......................................................................................... 65
3.3 Дослідження цитотоксичних властивостей одержаних часток різної
хімічної природи in vitro.................................................................................... 67
3.3.1 Визначення концентрацій напівмаксимального інгібування (IC50)
для часток з встановленим цитотоксичним ефектом.................................. 71
3.3.2 Визначення шляху загибелі клітин ліній L929 та U937 при дії
токсичних доз часток Gold 1, Gold 2, CaP.................................................... 73
3.4 Дослідження процесів взаємодії одержаних часток різної хімічної
природи та розміру з антиген-презентувальними клітинами in vitro........... 76
3.4.1 Дослідження ефективності взаємодії одержаних часток різної
хімічної природи з клітинами лінії J774 методом протокової цитометрії.76
3.4.2 Дослідження динаміки поглинання клітинами лінії J774
одержаних часток різної хімічної природи методом протокової цитометрії
.............................................................................................................. 78
3.4.3 Дослідження ефективності взаємодії одержаних часток різної
хімічної природи з клітинами лінії J774 методом конфокальної
мікроскопії....................................................................................................... 80
3.5 Дослідження імуногенних властивостей одержаних часток різної
хімічної природи та розміру in vivo.................................................................. 82
3.6 Висновки до розділу................................................................................. 87
РОЗДІЛ 4 .............................................................................................................. 90
ХАРАКТЕРИСТИКА ЧАСТОК НА ОСНОВІ ПОЛІ(D,L-ЛАКТИД-КОГЛІКОЛІДУ) З ІММОБІЛІЗОВАНИМ ФРАГМЕНТОМ ДИФТЕРІЙНОГО
ТОКСОЇДУ........................................................................................................... 90
10
4.1 Характеристика часток на основі полі(D,L-лактид-ко-гліколіду) з
іммобілізованим фрагментом дифтерійного токсоїду ................................... 90
4.1.1 Визначення ефективності навантаження модифікованих часток на
основі полі(D,L-лактид-ко-гліколіду) рекомбінантним похідним
субодиниці В дифтерійного токсоїду ........................................................... 91
4.1.2 Характеристика розмірів PLGA часток, синтезованих за різними
методиками...................................................................................................... 93
4.1.3 Характеристика морфології PLGA часток, синтезованих за
різними методиками ....................................................................................... 95
4.1.4 Порівняння PLGA часток після модифікації схем синтезу ........... 96
4.1.5 Характеристика швидкості вивільнення антигену з PLGA часток,
синтезованих за різними методиками, та визначення впливу рН
середовища на процеси вивільнення антигену............................................ 97
4.2 Оцінка ефективності прояву імуногенних властивостей
кон’югованого з частками PLGA антигену в залежності від дози введення98
4.2.1 Визначення титрів антитіл класу G у сироватці крові тварин,
імунізованих різними дозами антигену, іммобілізованого на частках
PLGA. ............................................................................................................ 100
4.2.2 Визначення титрів антитіл класу А у сироватці крові тварин
імунізованих різними дозами антигену, іммобілізованого на частках
PLGA. ............................................................................................................ 103
4.3 Висновки до розділу............................................................................... 107
РОЗДІЛ 5 ............................................................................................................ 110
ФУНКЦІОНАЛІЗАЦІЯ ЧАСТОК НА ОСНОВІ ПОЛІ(D,L-ЛАКТИД-КОГЛІКОЛІДУ) З ІММОБІЛІЗОВАНИМ ФРАГМЕНТОМ ДИФТЕРІЙНОГО
ТОКСОЇДУ......................................................................................................... 110
5.1 Навантаження часток PLGA 2* ад’ювантними молекулами убіквітину
або стафілококового протеїну А..................................................................... 110
5.2 Покриття часток PLGA 2* захисним шаром на основі хітозану ....... 112
5.3 Визначення перспективних ад’ювантних молекул для
функціоналізації часток................................................................................... 114
5.3.1 Дослідження змін в експресії proHB-EGF, як цільової молекули
для зв’язуванням з ДТ .................................................................................. 115
11
5.3.2 Отримання рекомбінантних scFv-антитіл злитих із фрагментом
SpA 119
5.4 Висновки до розділу............................................................................... 123
АНАЛІЗ ТА УЗАГАЛЬНЕННЯ ОТРИМАНИХ РЕЗУЛЬТАТІВ................. 125
ВИСНОВКИ....................................................................................................... 136
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ......................................................... 138

Список литературы

ВИСНОВКИ
Таким чином, в ході дисертаційної роботи було досліджено здатність
рекомбінантного фрагменту дифтерійного токсоїду, іммобілізованого на
частках різного розміру та хімічної природи, індукувати антитілоутворення
при введенні per os та визначено, що кон'югати на основі PLGA-часток
продемонстрували найкращі результати за здатністю до взаємодії з антигенпрезентувальними клітинами, їхнім цитотоксичним впливом та антигенними
властивостями.
1. Синтезовано частки різної хімічної природи на основі золота, фосфату
кальцію та полі(D,L-лактид-ко-глюколіду) та розроблено метод
отримання їхніх кон'югатів з іммобілізованим рекомбінантним похідним
дифтерійного токсину – субодиницею В міченою флуоресцентним
протеїном EGFP (EGFP-SubB);
2. Визначено основні характеристики комплексів часток з рекомбінантним
фрагментом дифтерійного токсоїду, такі як форма, розмір та параметри
навантаження антигеном. Показано, що найменшими за розміром були
частки Gold 1, а найбільшими - PLGA 2. (Gold 1≈9нм, Gold 2≈16нм,
CaP≈35нм, PLGA 1≈35нм, PLGA 2≈100нм). При цьому найбільшу
ефективність іммобілізації антигену продемонстрували частки CaP, що
сорбували на собі практично 90% доданого протеїну, а от найнижчу
ефективність включення антигену продемонстрували частки Gold 1 та
Gold 2 (24% та 27% відповідно) ;
3. Досліджено особливості взаємодії отриманих часток різного розміру та
хімічної природи з антиген-презентувальними клітинами та встановлено,
що клітинами лінії J774 найкраще фагоцитуються частки на основі PLGA
обох типів. До того ж, при дослідженні in vitro, продемонстрований
дозозалежний цитотоксичний вплив часток CaP, Gold 1 та Gold 2 по
відношенню до клітин лінії U937 (константи напівмаксимального
інгібування для яких становлять 6,93 мг/мл, 1,51 мг/мл та 1,55 мг/мл
137
відповідно), та часток Gold 1 та Gold 2 по відношенню до клітин лінії
U937 (константи напівмаксимального інгібування для яких становлять
1,97 мг/мл та 0,76 мг/мл відповідно).
4. Досліджено особливості динаміки розвитку гуморальної ланки імунної
відповіді у мишей при пероральній імунізації комплексами часток з
рекомбінантним фрагментом дифтерійного токсоїду та показано, що
частки на основі PLGA 1 та PLGA 2 з іммобілізованим антигеном
найкраще стимулюють продукцію специфічних сироваткових антитіл
класів G (титр яких вже після першої імунізації виріс у 10 та 12 разів,
відповідно, у порівнянні з контрольною групою) та антитіл класу А (титр
яких збільшився у 5 та 6 разів, відповідно, після другої імунізації).
Встановлено також дозування для найбільш ефективної стимуляції
гуморальної імунної відповіді до антигену, що становило 250 мкг на 1кг
маси тіла тварини.
5. Проведено підбір методик оптимізації конструкції часток на основі
PLGA, які могли б підсилити індукцію імунної відповіді до цільового
антигену - дифтерійного токсоїду, а саме використання додаткового
покриття полімерних часток захисним шаром хітозану, що сповільнює
вивільнення цільового антигену, при цьому час виходу 65 % антигену
збільшується з 5 діб до 22 діб. Продемонстровано, що полімерні частки
вкриті захисною оболонкою у 1,5 разів краще стимулюють продукцію
специфічних сироваткових антитіл класів G у порівнятті з частками
невкритими хітозаном.