Осипчук Дарія Віталіївна Активація імунних клітин, опо­середкована Толл-подібними рецепторами, в оцінці функці­онального стану імунної системи : Осипчук Дария Витальевна Активация иммунных клеток, опосредованная Толл-подобными рецепторами, в оценке функционального состояния иммунной системы Osipchuk Dariya Vital'yevna Aktivatsiya immunnykh kletok, oposredovannaya Toll-podobnymi retseptorami, v otsenke funktsional'nogo sostoyaniya immunnoy sistemy

Краткое описание

Осипчук Дарія Віталіївна, молодший науковий співробіт­ник лабораторії імунології ДУ «Інститут педіатрії, акушерства і гінекології НАМН України»: «Активація імунних клітин, опо­середкована Толл-подібними рецепторами, в оцінці функці­онального стану імунної системи» (03.00.09 - імунологія). Спецрада Д 26.001.24 у Київському національному універси­теті імені Тараса Шевченка

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ
ДЕРЖАВНА УСТАНОВА
ІНСТИТУТ ПЕДІАТРІЇ, АКУШЕРСТВА І ГІНЕКОЛОГІЇ
На правах рукопису
ОСИПЧУК ДАРІЯ ВІТАЛІЇВНА
УДК 612.017.1+576.8.097.5+576.8.097.22.001.6
АКТИВАЦІЯ ІМУННИХ КЛІТИН, ОПОСЕРЕДКОВАНА ТОЛЛПОДІБНИМИ РЕЦЕПТОРАМИ, В ОЦІНЦІ ФУНКЦІОНАЛЬНОГО
СТАНУ ІМУННОЇ СИСТЕМИ
03.00.09 - імунологія
ДИСЕРТАЦІЯ
на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
Науковий керівник
Чернишов Віктор Павлович,
доктор медичних наук,
професор
Київ – 2017
2
ЗМІСТ
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ………………………………………. 5
ВСТУП………………………………………………………………….….… 6
РОЗДІЛ 1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА ТА КЛАСИФІКАЦІЯ
ТОЛЛ-ПОДІБНИХ РЕЦЕПТОРІВ…..……………………………………… 12
1.1. Експресія та ліганди толл - подібних рецепторів…………………….. 12
1.2. Класифікація толл-подібних рецепторів та їх механізм дії………….. 14
1.3. Роль толл-подібних рецепторів в активації окремих популяції
клітин імунної системи та їх координованій взаємодії………………. 18
1.4. Дефекти в системі толл-подібних рецепторів та методи їх
діагностики……………………………………………………………… 25
1.5. Поліморфізми толл-подібних рецепторів…………………………….. 30
РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ……………… 32
2.1. Дизайн дослідження та характеристика груп обстеження……….… 32
2.2. Приготування клітин-мішеней для дослідження цитотоксичності
NK-лімфоцитів з допомогою проточного цитометра ….……….……. 33
2.3. Виділення мононуклеарів периферійної крові………………………... 34
2.4. Визначення експресії поверхневих маркерів на лімфоцитах при
інкубації цільної крові з культурою клітин К562 та агоністом ТПР3
– poly(i:c)……………………………………………………………….... 34
2.5. Дослідження цитотоксичності та дегрануляції NK-лімфоцитів з
використанням проточної цитометрії…………………………….….... 35
2.6. Визначення рівня експресії молекул адгезії CD62L та CD11b на
гранулоцитах при інкубації цільної крові з агоністами толлподібних рецепторів…………………………………………………….. 37
2.7. Дослідження інтенсивності кисневого вибуху гранулоцитів при
активації з використанням дигідрородаміну-123…………………….. 37
3
2.8. Тест відновлення нітросинього тетразолію - НСТ-тест……………... 38
2.9. Визначення концентрації сироваткових імуноглобулінів в реакції
радіальної імунодифузії (РРІД) по Манчіні………………………… 39
2.10. Молекулярно-генетичні дослідження……………………………….. 39
2.11. Статистична обробка отриманих результатів ………………………. 39
РОЗДІЛ 3. ПІДБІР МАРКЕРІВ ДЛЯ ОЦІНКИ ФУНКЦІОНАЛЬНОГО
СТАНУ NK-КЛІТИН ТА ГРАНУЛОЦИТІВ ПРИ АКТИВАЦІЇ
ЛІГАНДАМИ ТОЛЛ-ПОДІБНИХ РЕЦЕПТОРІВ IN VITRO …………….. 41
3.1 Експресія поверхневих маркерів на NK-лімфоцитах після інкубації з
клітинною лінією еритромієлолейкозу людини К562……….………... 41
3.2. Експресія CD69 на NK-лімфоцитах після інкубації з лінією К562
при зміні співвідношення ефектор-мішень та тривалості терміну
інкубації….….…………………..………………………………………... 44
3.3. Кореляція між цитотоксичністю та CD69 експресією на NKлімфоцитах……………………………………………………………… 45
3.4. Експресія маркера ранньої активації CD69+ на NK-лімфоцитах при
інкубації з агоністом ТПР3 - poly (i:c)…………………………….……. 48
3.5. Дослідження експресії маркера дегрануляції CD107а на NKлімфоцитах при активації ………………………………………………. 49
3.6. Експресія молекули адгезії CD62L на гранулоцитах після інкубації з
агоністами толл-подібних рецепторів ..………………………………... 51
3.7. Експресія молекули адгезії CD11b на гранулоцитах після інкубації з
агоністами толл-подібних рецепторів ….……………………………… 53
3.8.Дослідження продукція реактивних кисневих сполук гранулоцитами
при активації з використанням дигідрородаміну – 123……………….. 55
РОЗДІЛ 4. IN VITRO АКТИВАЦІЯ ГРАНУЛОЦИТІВ ТА NKЛІМФОЦИТІВ У ДІТЕЙ З РЕКУРЕНТНИМИ ВІРУСНОБАКТЕРІАЛЬНИМИ ІНФЕКЦІЯМИ ТА ГОСТРИМИ ІНВАЗИВНИМИ
БАКТЕРІАЛЬНИМИ СТАНАМИ………………………………………….. 61
4
4.1. Концентрація сироваткових імуноглобулінів та дослідження
продукції активних форм кисню гранулоцитами периферійної крові
у групах обстеження……………………………………………………... 62
4.2. Дослідження продукції активних форм кисню гранулоцитами у
носіїв Х-зчепленої хронічної гранульоматозної хвороби……………... 64
4.3. Дослідження продукції активних форм кисню гранулоцитами в
тесті з ДГР-123 та НСТ-тест…………………………………….………. 66
4.4. Використання ліпополісахариду та змиозану в лабораторній
діагностиці хронічної гранульоматозної хвороби …………………….. 72
4.5. Експресія молекули адгезії CD11b на гранулоцитах при інкубації з
агоністами ТПР у групах обстеження …………..……………………… 73
4.6. Експресія CD62L на гранулоцитах при інкубації з агоністами ТПР
у групах обстеження……………………………………………………... 82
4.7. Дослідження кореляційного взаємозв`язку показників експресії
молекул адгезії при активації гранулоцитів з віком дітей. …………… 85
4.8 Експресія маркера ранньої активації CD69 на NK-лімфоцитах у
дітей з рекурентними вірусно-бактеріальними інфекціями та
гострими інвазивними бактеріальними станами…..…………………... 87
АНАЛІЗ І УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕННЯ….……... 91
ВИСНОВКИ………………………………………………………………….. 107
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ…………………………………… 109
5
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ
ДГР-123 – дигідрородамін 123
ЕДТА – етилендіамінтетраацетат
К562 – пухлинна клітинна лінія еритромієлолейкозу людини
ЛПС – ліпополісахарад
МПК – мононуклеари периферійної крові
НАДФ – нікотинамідаденіндинуклеотидфосфат
НСТ – тест – тест відновлення нітросиньоготетразолію
ПАМП – патоген - асоційованих молекулярних патернів
ПГН – пептидоглікан
ТПР – толл – подібні рецептори
СІФ – середня інтенсивність флуоресценції
ФМА – форбол-12-миристат-13-ацетат
IL – interleukin – інтерлейкін
poly(i:c) – polyinosinic:polycytidylic acid – поліінозінова: поліцітіділовая
кислота
IFN – interferon – інтерферон
МНС-І – major histocompatibility complex class I – головний комплекс
гістосумісності І-го типу
TNFα – tumor necrosis factor alpha- фактор некрозу пухлини
6
ВСТУП
Актуальність теми. Толл-подібні рецептори (ТПР) – еволюційноконсервативна система рецепторів, що відіграє виключну роль в активації
неспецифічної відповіді на патогени, забезпечуючи молекулярну
ідентифікацію патогену та подальшу активацію основних компонентів
вродженого імунітету. Ця система рецепторів відіграє вирішальну роль в
ініціюванні синтезу прозапальних цитокінів та запуску каскаду сигнальних
шляхів активації клітини [Medzhitov R., 2001; Leifer C.A., 2016]. Стимуляція
ТПР забезпечує функціональне дозрівання дендритних клітин та
диференціювання Т-лімфоцитів, таким чином започатковуючи та
контролюючи антиген-специфічну відповідь; ініціює процеси регенерації та
відновлення тканинної цілісності [Tu S., 2016]. З огляду на вищ мовлене стає
очевидна роль ТПР, як одних з основних регуляторів функціональної
активності імунної системи.
Змінена функціональна активність ТПР, обумовлена генетичними
дефектами та поліморфізмом як самих рецепторів, так і сигнальних
посередників, асоціюється з підвищеною чутливістю до інфекцій,
імунодефіцитними станами, алергічними та аутоімунними захворюваннями.
Все це свідчить про безпосередній взаємозв’язок між активністю ТПР та
функціональним станом імунних клітин.
Не зважаючи на активне дослідження ТПР, існує недостатньо
інформації щодо взаємозв’язку їх стимуляції зі здійсненням імунними
клітинами низки фізіологічно важливих функцій. Невідомими залишаються
також характеристики клітин, що могли б достовірно свідчити про
функціональну активність чи інертність цієї рецепторної системи. Відкритим
також залишається питання про те, як відображається поточний стан імунної
системи на активації толл-подібних рецепторів.
Дослідження та з`ясування цих питань дало б змогу оцінити повною
мірою взаємозв’язок між ліганд-опосередкованою активацією системи толлподібних рецепторів та функціональним станом клітин імунної системи.
7
Дозволило б вдосконалити підходи для оцінки імунного статусу в цілому та
своєчасної діагностики станів, пов`язаних з порушенням функціонування цієї
системи.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є
фрагментом наукових досліджень лабораторії імунології за темами
«Розробка методів профілактики та лікування ускладнень вагітності, пологів
та післяпологового періоду у жінок з великим інтервалом між пологами»
(№ д/р 01.08.U001052, 2013-2016рр.) та «Дослідження ролі вітамін Dзалежних механізмів розвитку адаптаційних можливостей організму в
критичні періоди дитинства та патогенезі хронічної соматичної патології у
дітей» (№ д/р 01.16.U001202, 2016-2018рр.)
Мета і завдання дослідження. Метою роботи було оцінити
функціональний стан імунної системи у дітей з інвазивними бактерільними
станами та рекурентними вірусно-бактеріальними інфекціями шляхом
визначення впливу лігандів толл-подібних рецепторів на експресію
активаційних маркерів імунних клітин in vitro.
Для досягнення поставленої мети сформульовано такі завдання:
1. Дослідити експресію поверхневих активаційних маркерів NK
лімфоцитів здорових донорів та її зв’язок з цитотоксичністю цих клітин при
взаємодії з пухлинною клітинною лінією К562 та агоністом ТПР3 – poly (i:c)
in vitro.
2. Дослідити експресію поверхневих активаційних маркерів гранулоцитів
здорових донорів та її зв’язок з киснезалежним метаболізмом цих клітин при
взаємодії з агоністами толл-подібних рецепторів in vitro.
3. Оптимізувати спосіб оцінки продукції реактивних кисневих сполук
(РКС) гранулоцитами здорових донорів
4. Розробити та оптимізувати спосіб оцінки функціонального стану
гранулоцитів за продукцією ними РКС та експресією молекул адгезії після
стимуляції лігандами толл-подібних рецепторів in vitro.
8
5. З використанням розроблених та оптимізованих методичних підходів
дослідити функціональних стан та кооперативну взаємодію NK-клітин та
гранулоцитів у дітей з інвазивними бактеріальними станами та рекурентними
вірусно-бактеріальними інфекціями.
6. Проаналізувати залежність активації імунних клітин при стимуляції
толл-подібних рецепторів від віку дітей.
Об’єкт дослідження: функціональна активність клітин імунної системи
у дітей з інвазивними бактеріальнми станами та рекурентними віруснобактеріальними інфекціями.
Предмет дослідження: експресія маркерів активації та продукція
реактивних кисневих сполук лейкоцитами, індукована стимуляцією толлподібних рецепторів, у дітей з інвазивними бактеріальними станами та
рекурентними вірусно-бактеріальними інфекціями.
Методи дослідження: проточна цитометрія (визначення
субпопуляційного складу лімфоцитів, дослідження експресії маркерів
активації та продукції реактивних кисневих сполук лейкоцитами, оцінка
загибелі клітин-мішеней при дослідження цитотоксичності NK-лімфоцитів),
метод радіальної імунодифузії (визначення концентрації сироваткових
імуноглобулінів), світлова мікроскопія (дослідження оксидативного
метаболізму нейтрофілів), культивування клітин та методи математичної
статистики.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше продемонстровано
діагностичну інформативність аналізу експресії маркера ранньої активації
CD69 на NK - клітинах для оцінки функціональної активності цих клітин.
Показано, що саме CD69+NK - клітини репрезентують цитотоксичний
потенціал цієї популяції, що дає підстави використовувати зазначений
маркер в діагностичних лабораторних тестах для більш швидкої та якісної
оцінки цитотоксичності природних кілерів.
Уперше в Україні продемонстровано переваги тесту з використанням
дигідрородаміну-123 для лабораторної діагностики хронічної
9
гранульоматозної хвороби у порівнянні з НСТ-тестом. Доведено
ефективність використання тесту з дигідрородаміном-123 для визначення
типу успадкування хронічної гранульоматозної хвороби. Розширено існуючі
уявлення щодо порушення механізмів активації гранулоцитів,
опосередкованих стимуляцією толл-подібних рецепторів, у дітей з
рекурентними вірусно-бактеріальними інфекціями та інвазивними
бактеріальними станами, котре полягає у дисбалансі експресії CD11b на
гранулоцитах у відповідь на стимуляцію толл-подібних рецепторів in vitro.
Отримано нові дані щодо розладу у дітей з рекурентними віруснобактеріальними інфекціями кооперативної взаємодії між NK-клітинами та
гранулоцитами, зумовленого порушенням експресії останніми молекули
адгезії CD11b у відповідь на стимуляцію ТПР7/8, що асоціюється зі
зниженням експресії маркера активації CD69 природними кілерами.
У роботі вперше продемонстровано відсутність залежності показників
активації гранулоцитів та NK-клітин при стимуляції толл-подібних
рецепторів від віку дітей.
Практичне значення одержаних результатів. Результатами
дисертаційного дослідження експериментально обгрунтовано доцільність
використання показників рівня експресії CD11b та CD69, індукованої
активацією толл-подібних рецепторів in vitro, у складі імунологічного
дослідження для оцінки функціонального стану імунної системи.
Встановлено, що обрані показники не залежать від віку, що дає можливість їх
застосування для оцінки активації клітин при стимуляції толл-подібних
рецепторів у осіб різного віку.
Шляхом порівняльної оцінки діагностичної інформативності двох
методів характеристики оксидативного метаболізму фагоцитів (НСТ-тест та
тест з дигідрородаміном-123) доведено, що тест з дигідрородаміном може
бути рекомендованим для диференційної діагностики та визначення типу
успадкування хронічної гранульоматозної хвороби, а також як тест
первинного скринінгу для виявлення дефектів фагоцитозу у дітей.
10
Особистий внесок здобувача. Протягом 2013-2016 років автором
проведено всі експериментальні роботи: емпіричним шляхом підібрано
активаційні маркери для оцінки функціонального стану гранулоцитів та
природних кілерних клітин; проведено порівняльну оцінку методів
характеристики оксидативного метаболізму гранулоцитів; з використанням
розроблених методичних підходів проведено порівняльну характеристику
функціонального стану імунної системи у дітей з інвазивними
бактеріальними станами та рекурентними вірусно-бактеріальними
інфекціями за ТПР-опосередкованою активацією гранулоцитів та природних
кілерних клітин. Автором самостійно було проаналізовано та узагальнено
літературні дані за проблемою, що вивчається. Дисертант особисто провела
систематизацію, статистичну обробку й наукову інтерпретацію одержаних
даних, аналіз та узагальнення результатів, сформулювала всі положення та
висновки та оформила дисертаційну роботу. Спільно з науковим керівником
д.м.н., професором В.П. Чернишовим розроблено концепцію дисертаційного
дослідження, сформульовано його мету і завдання та проведено підготовку
до друку наукових праць.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації заслухані та
обговорені на національних та міжнародних медичних конференціях і
форумах: «Мікробіологія та імунологія – перспективи розвитку в ХХІ
столітті» (м. Київ, 2014 р.); «Мікробіологія та імунологія – перспективи
розвитку в ХХІ столітті» (м. Київ, 2016 р.).
Публікації. Основні положення дисертаційної роботи опубліковані в 9
наукових працях, у тому числі в 6 статтях у фахових вітчизняних та
міжнародних періодичних виданнях, з яких 3 публікації у виданнях
включених до міжнародних наукометричних баз, 1 стаття у нефаховому
виданні та 2 тез у матеріалах конференцій. Отримано патент на корисну
модель.
Структура й обсяг дисертації. Дисертація викладена українською
мовою на 126 сторінках машинописного тексту. Рукопис складається зі
11
вступу, огляду літератури, розділу матеріалів і методів дослідження, 2
розділів результатів власних досліджень, розділу присвяченому аналізу та
узагальненню даних, висновків, списку літератури та додатків. Список
використаних літературних джерел містить 173 праці, з них кирилицею – 4,
латиницею – 169. Дисертація ілюстрована 8 таблицями та 33 рисунками.

Список литературы

ВИСНОВКИ
У дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення та нове
вирішення науково-практичної проблеми виявлення функціональних
порушень системи толл-подібних рецепторів. Визначено основні фенотипові
характеристики активації гранулоцитів та NK-клітин при стимуляції
агоністами толл-подібних рецепторів, на основі яких розроблено нові
методичні підходи до лабораторного виявлення функціональних дефектів
цієї рецепторної системи.
1. Взаємодія NK-лімфоцитів здорових донорів з К562 та лігандом ТПР3
poly (i:c) in vitro спричиняє підвищення кількості CD69+ клітин в
середньому в 14 разів. Посилення експресії CD69 в популяції NKклітин вірогідно корелює з їх цитотоксичністю (r=0,72), що вказує на
функціональний взаємозв’язок між цими показниками і дає підстави
використовувати показник експресії CD69 для характеристики
функціонального стану природних кілерів.
2. Інкубація гранулоцитів здорових донорів з агоністами ТПР 2, 7/8 та 4
(пептидогліканом, резиквімодом та ліпополісахаридом) викликає
зниження кількості CD62L
+ клітин в середньому у 9,5 разів одночасно
зі зростанням рівня експресії CD11b у 2,3 разів, що засвідчує
можливість застосування показників експресії зазначених молекул для
характеристики функціонального стану гранулоцитів.
3. Оптимізовано умови проведення тесту з дигідрородаміном-123 для
оцінки киснезалежного метаболізму гранулоцитів: встановлено
характер дозової залежності індукованої активацією продукції
реактивних кисневих сполук (РКС) та виявлено максимальну
стимулювальну концентрацію ФМА - 0,5 мкг/мл.
4. З використанням оптимізованого тесту з дигідрородаміном-123 у групі
дітей з інвазивними бактеріальними станами виявлено 9 осіб з