Бурменская Ольга Владимировна. Молекулярно-генетические маркеры иммунного ответа при воспалительных заболеваниях органов женской репродуктивной системы : Бурменская Ольга Володимирівна. Молекулярно-генетичні маркери імунної відповіді при запальних захворюваннях органів жіночої репродуктивної системи Burmenskaya Olga Vladimirovna. Molecular genetic markers of the immune response in inflammatory diseases of the female reproductive system



  • Название:
  • Бурменская Ольга Владимировна. Молекулярно-генетические маркеры иммунного ответа при воспалительных заболеваниях органов женской репродуктивной системы
  • Альтернативное название:
  • Бурменская Ольга Володимирівна. Молекулярно-генетичні маркери імунної відповіді при запальних захворюваннях органів жіночої репродуктивної системи Burmenskaya Olga Vladimirovna. Molecular genetic markers of the immune response in inflammatory diseases of the female reproductive system
  • Кол-во страниц:
  • 249
  • ВУЗ:
  • Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства
  • Год защиты:
  • 2014
  • Краткое описание:
  • Бурменская Ольга Владимировна. Молекулярно-генетические маркеры иммунного ответа при воспалительных заболеваниях органов женской репродуктивной системы: диссертация ... доктора биологических наук: 03.03.03 / Бурменская Ольга Владимировна;[Место защиты: Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства].- Москва, 2014.- 249 с.




    Федеральное государственное бюджетное учреждение
    «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии
    имени академика В.И. Кулакова»
    Министерства здравоохранения Российской Федерации
    На правах рукописи
    Бурменская Ольга Владимировна
    МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ИММУННОГО
    ОТВЕТА ПРИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ОРГАНОВ
    ЖЕНСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ
    03.03.3 - иммунология
    Диссертация
    на соискание ученой степени
    доктора биологических наук
    Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор, академик РАН Сухих Геннадий Тихонович; доктор биологических наук Трофимов Дмитрий Юрьевич
    Москва - 2014
    ОГЛАВЛЕНИЕ
    СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 7
    ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 11
    1. ВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ ОРГАНОВ ЖЕНСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ В ДИАГНОСТИКЕ ВАГИНИТОВ И ХРОНИЧЕСКОГО ЭНДОМЕТРИТА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 21
    1.1 КЛИНИКО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ
    ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ СЛИЗИСТОЙ ВЛАГАЛИЩА И ЭНДОМЕТРИЯ 21
    1.1.1 Воспалительные заболевания слизистой влагалища: распространение,
    симптомы, этиология и факторы риска развития заболевания 21
    1.1.2 Современные представления о микробиоценозе влагалища у женщин
    репродуктивного возраста 24
    1.1.3 Хронический эндометрит: распространение, патогенез и факторы риска
    развития заболевания 29
    1.2 МЕХАНИЗМЫ ИММУННОЙ ЗАЩИТЫ ПОЛОВЫХ ПУТЕЙ ЖЕНЩИН 32
    1.3 КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВУЛЬВОВАГИНИТОВ
    И ХРОНИЧЕСКОГО ЭНДОМЕТРИТА 53
    1.3.1 Диагностика воспалительных заболеваний нижних отделов органов
    женской репродуктивной системы 53
    1.3.2 Клинико-лабораторная диагностика хронического эндометрита 60
    1.4 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МАРКЕРОВ ЛОКАЛЬНЫХ
    ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ 62
    1.4.1 Микроскопия мазков с подсчетом числа лейкоцитов 64
    1.4.2 Метод лазерной проточной цитометрии с применением
    моноклональных антител 65
    1.4.3 Метод иммуноферментного анализа 66
    1.4.4 Технология мультиплексного иммуноанализа для исследования
    цитокинового профиля генов иммунного ответа 68
    1.4.5 Методы иммуногистохимического исследования 69
    1.4.6 Определение транскрипционных профилей генов 70
    1.4.7 Полиморфизмы генов иммунной системы и современные методы их
    идентификации 72
    1.4.8 Ассоциация полиморфизмов генов иммунной системы с
    предрасположенностью к развитию инфекционно-воспалительных заболеваний нижних отделов органов женской репродуктивной системы .... 81 Резюме 84
    2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 85
    2.1 Материалы исследования 85
    2.2 Объем исследования 85
    2.3 Методы исследования 88
    2.3.1 Определение состава микрофлоры влагалища 88
    2.3.2 Определение транскрипционного профиля генов иммунного ответа .... 90
    2.3.3 Определение замен одиночных нуклеотидов 91
    2.3.4 Дополнительные клинико-лабораторные методы 91
    2.4 Параметры, используемые для описания ПЦР в реальном времени 92
    2.5 Нормировка 92
    2.6 Статистика 93
    2.7 Метод бинарной логистической регрессии 94
    2.8 ROC-анализ 95
    2.9 Характеристики диагностических тестов 95
    3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 97
    3.1 Разработка систем для оценки профиля экспрессии мРНК генов
    иммунной системы 97
    3.1.1 Подбор праймеров и флуоресцентно-меченных проб 97
    3.1.2 Проверка праймеров и зондов 101
    3.1.3 Выбор референсных генов и разработка алгоритмов нормировки,
    оптимальных для оценки уровней экспрессии мРНК генов человека в тканях эндометрия и влагалища 106
    3.1.4 Апробация метода исследования транскрипционных профилей на
    образцах тканей эндометрия двух стадий менструального цикла 107
    3.2 Прикладные аспекты идентификации молекулярно-генетических маркеров с использованием ПЦР в реальном времени 113
    3.2.1 Воспалительные заболевания нижних отделов половых путей 113
    3.2.1.1 Характеристика состава микробиоценоза влагалища небеременных
    женщин 114
    3.2.1.2 Характеристика состава микробиоценоза влагалища беременных
    женщин 116
    3.2.1.3 Типирование и количественная оценка лактобактерий 119
    3.2.1.4 Транскрипционные профили генов иммунного ответа в соскобах
    отделяемого слизистой влагалища 123
    3.2.1.5 Характеристика уровней представленности транскриптов генов
    иммунного ответа в соскобах отделяемого слизистой влагалища 123
    3.2.1.6 Зависимость транскрипционных профилей от стадии
    менструального цикла 125
    3.2.1.7 Сравнение транскрипционных профилей генов иммунной системы в
    клетках вагинальных соскобов у беременных и небеременных женщин 126
    3.2.1.8 Особенности экспрессии мРНК генов иммунной системы в клетках
    вагинальных соскобов в норме, при вагините и БВ 127
    3.2.1.9 Корреляция Lactobacilus iners с уровенем экспрессии генов 131
    3.2.1.10 Разработка способа оценки локальной воспалительной
    реакции 133
    3.2.1.11 Преимущества использования индексов и интегральной оценки
    локального воспаления 136
    3.2.1.12 Сравнение предложенного способа оценки локальной
    воспалительной реакции с клиническими данными 139
    3.2.1.13 Сравнение предложенного способа оценки локальной воспалительной реакции с методом подсчета числа лейкоцитов в мазке .... 143
    3.2.2 Осложнения родов и послеродового периода у пациенток с
    вагинитами и Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/мл 144
    3.2.3 Определение ассоциаций полимофизмов генов цитокинов с
    предрасположенностью к развитию вагинитов 146
    3.2.4 Хронический эндометрит 154
    3.2.4.1 Идентификация микроорганизмов в полости матки 154
    3.2.4.2 Локальный транскрипционный профиль при хроническом
    эндометрите 156
    4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 164
    4.1. Молекулярно-генетические маркеры при вагинитах 164
    4.1.1. Транскрипционный профиль генов иммунного ответа в норме и его
    зависимость от фазы менструального цикла в тканях эндометрия 164
    4.1.2. Зависимость транскрипционных профилей генов иммунного ответа в
    клетках соскобов из влагалища от беременности 167
    4.1.3. Доминирование в составе биоценозов влагалища лактобактерий -
    механизм защиты плода и новорожденного от условно-патогенных микроорганизмов 168
    4.1.4. Ассоциация L.iners и L.gasseri с дисбиотическими и воспалительными
    процессами во влагалище 170
    4.1.5. Транскрипционные профили в клетках соскобов слизистой влагалища
    при вагинитах 173
    4.1.6. TNF, TLR4, GATA3 и IL18 - маркеры объективной интегральной
    оценки локальной воспалительной реакции во влагалище 180
    4.1.7. Актуальность определения дисбиотических и воспалительных
    процессов во влагалище для прогнозирования и предупреждения акушерских осложнений 183
    4.1.8. Г енетически обусловленная пониженная экспрессия TNF -а и T GF -В1
    - фактор предрасположенности к развитию вагинитов 184
    4.2. Молекулярно-генетические маркеры при хроническом эндометрите 187
    4.2.1. Особенности транскрипционного профиля генов иммунного ответа при
    фиброзе стромы эндометрия 187
    4.2.2. Роль инфекционных агентов в патогенезе хронического
    эндометрита 189
    4.2.3. Особенности транскрипционных профилей при полном симптомокомплексе хронического эндометрита и лимфоидной инфильтрации
    стромы 190
    ВЫВОДЫ 193
    СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 204
    СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
    АГ - антиген
    АПК - антигенпрезентирующие клетки АТ - антитело
    БВ - бактериальный вагиноз
    ВАК - Высшая аттестационная комиссия
    ВИЧ - вирус иммунодефицита человека
    ВВК - вульвовагинальный кандидоз
    ВМС - внутриматочная спираль
    ГЭ - геном-эквивалент
    ДИ (СІ) - доверительный интервал (confidence interval)
    ДК - дендритные клетки
    ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
    ИППП - инфекции, передаваемые половым путем
    кДНК - комплементарная ДНК
    КОЕ - колониеобразующие единицы
    ЛВ - локальное воспаление
    ЛВР - локальная воспалительная реакция
    ЛРС (CLR) - лектиновые рецепторы С- типа (C-type lectin receptor)
    МКА - моноклональные антитела
    мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота
    МФ - макрофаг
    НВ - неспецифический вагинит НК - натуральные киллеры
    НЛР (NLR) - нод-лайк рецепторы (nucleotide oligomerization domain (NOD)- like receptor)
    ОБМ - общая бактериальная масса
    ОТ-ПЦР - обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция ПАМП (PAMP) - патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (pathogen-associated molecular patterns)
    ПРР (PRR) - паттерн-распознающие рецепторы (pathogen recognition receptors)
    ПЦОР (NPV)- прогностическая ценность отрицательного результата (negative predictive value)
    ПЦПР (PPV) - прогностическая ценность положительного результата (positive predictive value)
    ПЦР - полимеразная цепная реакция
    РВВК - рецидивирующий вульвовагинальный кандидоз
    РНК - рибонуклеиновая кислота
    РФ - Российская Федерация
    США - Соединенные Штаты Америки
    ТУ - технические условия
    УПМ - условно-патогенные микроорганизмы
    ФСГ - фолликулостимулирующий гормон
    ХЭ - хронический эндометрит
    ЭКО - экстракорпоральное оплодотворение
    CD - cluster of differentiation, дифференцировочные антигены
    cut off - порог отсечки положительного результата
    HLA - Human Leucocyte Antigens, группа антигенов гистосовместимости
    IgA - иммуноглобуллины класса А
    IgG - иммуноглобуллины класса G
    ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay, метод твердофазного иммуноферментного анализа
    IUSTI - International Union against Sexually Transmitted Infections (Европейский Международный союз по борьбе с инфекциями, передаваемыми половым путем)
    MHCI - major histocompatibility complex class I, главный комплекс гистосовместимости I класса
    MHCII - major histocompatibility complex class II, главный комплекс гистосовместимости II класса Me - медиана
    NCBI - National Center for Biotechnology Information OR - odds ratio, отношение шансов (ОШ)
    ROC - Receiver Operator Characteristic
    SNP - single-nucleotide polymorphism, замены одиночных нуклеотидов WHO (ВОЗ) - World Health Organization (Всемирная организация здравоохранения)
    Маркеры
    ACTB - референсный ген Р-актин
    B2M - референсный ген Р-2-микроглобулин
    CD45 (PTPRC) - ген кодирующий общий лейкоцитарный антиген
    CD68 - ген, кодирующий трансмембранный белок CD68
    CD69 - ген, кодирующий транмембранный белок CD69
    ESR - ген эстрогенового рецептора
    Foxp3 - ген, кодирующий транскрипционный фактор скурфин GAPDH - референсный ген глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа GATA3 - ген, кодирующий транскрипционный фактор GATA-связывающий протеин 3
    GNLY - ген гранулизина
    GUSB - референсный ген Р-глюкоронидаза
    HPRT1 - референсный ген гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансфераза IFNG - ген, кодирующий интерферон гамма (IFN-y)
    IL1A - ген интерлейкина 1 альфа (IL-1a)
    IL1B - ген интерлейкина 1 бета (IL-1B)
    IL1RN - ген, кодирующий антагонист рецептора интерлейкина-1 (IL-1RA)
    IL2 - ген интерлейкина 2 (IL-2)
    IL2Ra - ген, кодирующий a-цепь рецептора интерлейкина 2 (IL-2Ra)
    IL4 - ген интерлейкина 4 (IL-4)
    IL6 - ген интерлейкина 6 (IL-6)
    IL8 - ген интерлейкина 8 (IL-8)
    IL10 - ген интерлейкина 10 (IL-10)
    IL12A- ген, кодирующий субъединицу р35 интерлейкина 12 (IL-12)
    IL12B - ген, кодирующий субъединицу р40 IL-12 и IL-23 IL15- ген интерлейкина 15 (IL-15)
    IL18- ген интерлейкина 18 (IL-18)
    IL23- ген, кодирующий субъединицу р19 интерлейкина 23 (IL-23)
    LIF - ген, кодирующий лейкемия-ингибирующий фактор (LIF)
    PGR - ген прогестеронового рецептора
    RORC - ген, кодирующий транскрипционный фактор RORC
    ТВР - референсный ген TATA-связывающий протеин
    TBX21 - ген, кодирующий транскрипционный фактор TBX21
    TGFB1 - ген, кодирующий трансформирующий ростовой фактор бета 1
    (TGF-B1)
    TLR2 - ген, кодирующий толл-подобный рецептор (TLR-2)
    TLR4- ген, кодирующий толл-подобный рецептор (TLR-4)
    TLR9 - ген, кодирующий толл-подобный рецептор (TLR-9)
    TNF - ген фактора некроза опухоли альфа (TNF-a)
    VEGFA - ген, кодирующий сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF-A)
    18SrRNA - референсный ген 18S рибосомальной РНК
    ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
    Актуальность
    Открытие и внедрение в практику в конце 80 годов метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) внесло огромный вклад в развитие современной биологии и медицины. В течение следующих 20 лет были разработаны способы флуоресцентной детекции результатов амплификации. Помимо этого модификация и совершенствование методики шло по пути автоматизации процесса, уменьшения объема реакционных смесей и возможности амплификации в одной пробирке нескольких фрагментов ДНК (мультиплексирование), что способствовало широкому внедрению данного метода в рутинную практику.
    В настоящее время метод ПЦР широко используется для решения целого ряда фундаментальных и прикладных задач, включающих в себя определение генетических заболеваний, вариантов полиморфизма генов, функциональной активности генома, а также изучение воздействия на организм человека биотических факторов окружающей среды (бактерий, грибов, вирусов). Следует отметить, что каждая из выше перечисленных задач может решаться как самостоятельно, так и в составе комплексного исследования. В данной работе комплексный подход предложен для решения фундаментальных и прикладных задач современной иммунологии на примере исследования воспалительных процессов, сопровождающих заболевания органов женской репродуктивной системы.
    Воспалительные заболевания органов женской репродуктивной системы занимают лидирующие позиции в акушерско-гинекологической практике. Воспалительные заболевания нижних отделов половых путей (вульвиты, вагиниты) являются одной из наиболее распространенных причин обращения женщин к врачу акушеру-гинекологу [142]. От неспецифического вагинита (НВ) страдает почти каждая пятая пациентка гинекологической практики (19,2%), а среди пациенток с патологическими белями частота его выявления возрастает в 4 раза [4]. Известно, что в основе репродуктивных неудач (трубно-перитонеальный фактор бесплодия, самопроизвольные выкидыши), акушерских осложнений родов и послеродового периода, таких как преждевременное излитие околоплодных вод, внутриутробное и интранатальное инфицирование плода и новорожденного, мертворождение, хориоамнионит в родах, послеродовые гнойно-септические осложнения, также лежат те или иные воспалительные заболевания половых органов [21].
    Воспаление чаще всего вызвано действием патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, идентификация которых чрезвычайно важна при выборе терапии. Однако в значительной степени развитие инфекционного процесса определяется состоянием локального (мукозального) иммунитета и зависит от иммунологической реактивности макроорганизма. В патогенезе заболевания микробный фактор играет такую же роль, как и состояние макроорганизма, и те обстоятельства, которые изменяют его иммунобиологические свойства [48]. Поэтому изучение мукозального иммунитета представляет чрезвычайный интерес. В то же время, спектр методов исследования мукозального иммунитета остается весьма ограниченным из-за малого количества материала и наличия слизи в образцах. В ходе исследования возникают вопросы, связанные с нормировкой материала, способов его взятия и транспортировки. Вследствие этого существующие знания об изменении при вагинитах различных иммунологических показателей (цитокинов, дефензинов, иммуноглобулинов, рецепторов иммунокомпетентных клеток и др.) не получили должного применения в клинической практике. Основным, и зачастую, единственным методом оценки состояния локального иммунитета в настоящее время остается микроскопия мазка с подсчетом числа лейкоцитов. Альтернативой подсчету числа лейкоцитов может служить оценка иммунологических показателей (как пример, транскрипционный профиль генов цитокинов).
    В настоящее время накоплены многочисленные данные о зависимости экспрессии цитокинов не только от влияния патогенных факторов, но и от генетической вариабельности кодирующих их генов. В частности, получены данные об ассоциациях отдельных полиморфизмов генов цитокинов с такими нозологическими формами как вульвовагинальный кандидоз [166] и бактериальный вагиноз [93; 127; 132; 134; 257]. Оригинальность настоящего исследования состоит в том, что различные нозологические формы неспецифических вагинитов были исследованы в совокупности, включая случаи воспаления неустановленной этиологии. Использование такого подхода обосновано тем, что зачастую воспалительная реакция является неспецифической в отношении инициирующего патологического агента, поскольку иммунном ответе в первую очередь задействованы механизмы врожденного иммунитета.
    Кроме того, большое внимание исследователей привлечено к проблеме воспалительных заболеваний органов малого таза, среди которых хронический эндометрит (ХЭ) является наиболее распространенным. Он выявляется примерно у 10% женщин репродуктивного возраста, но у пациенток с нарушениями генеративной функции частота его обнаружения увеличивается до 23-57% [33]. Среди женщин с ХЭ 80-90% составляют женщины детородного возраста. ХЭ обуславливает у них нарушения менструальной и репродуктивной функций, приводя, в конечном итоге, к развитию бесплодия, неудачам в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), невынашиванию беременности и осложненному течению гестационного процесса и родов [55].
    Все предложенные в данной работе молекулярно-генетические маркеры (транскрипты генов иммунной системы, полиморфизмы генов, а также возбудители воспалительных заболеваний) могут быть идентифицированы в одном и том же образце с использованием одного универсального метода - полимеразной цепной реакцией, что сокращает время для проведения исследований. Учитывая преимущества метода ПЦР (его быстроту, высокую чувствительность и специфичность, объективность, возможность автоматизации и одновременного исследования большого количества образцов), можно прогнозировать широкое внедрение данного
    метода в систему диагностики воспалительных заболеваний органов женской репродуктивной системы. Помимо традиционного исследования инфекционных агентов чрезвычайно перспективными являются
    исследования факторов генетической предрасположенности к развитию заболевания и транскрипционных профилей маркеров воспаления.
    Цель и задачи работы
    Цель работы:
    Разработать комплексный подход к характеристике воспалительных процессов органов женской репродуктивной системы на основе молекулярно-генетических маркеров, включающих количественную
    идентификацию инфекционных агентов, определение транскрипционного профиля генов иммунной системы и генетических особенностей организма.
    Задачи:
    1. Для оценки профиля экспрессии генов иммунного ответа разработать тест-системы на основе метода количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени.
    2. Выявить особенности экспрессии мРНК генов иммунного ответа (цитокины, рецепторы, транскрипционные факторы и др.) при вагинитах и хроническом эндометрите.
    3. Установить распределение аллельных вариантов генов иммунного ответа, ассоциированных с предрасположенностью к развитию вагинитов у женщин репродуктивного возраста.
    4. Провести характеристику состава микроорганизмов, способствующих развитию воспалительных заболеваний органов женской репродуктивной системы (вагиниты, хронический эндометрит).
    5. Разработать способы идентификации локальной воспалительной реакции при вагинитах и хроническом эндометрите на основе интегральной оценки транскрипционных профилей генов иммунного ответа.
    6. Определить наиболее важные молекулярно-генетические маркеры воспалительного процесса, позволяющие одновременно получать информацию о полиморфизмах и активности генов иммунной системы, а также вирусологическом и бактериологическом фоне.
    Научная новизна исследования
    Впервые разработан и апробирован метод комплексной оценки клинического биоматериала на молекулярно-генетическом уровне при воспалительных заболеваниях органов женской репродуктивной системы, позволяющий одновременно получать информацию о вирусологическом и бактериологическом фоне, а также полиморфизмах и активности генов иммунной системы.
    Впервые при воспалительных заболеваниях органов женской репродуктивной системы на основе метода ОТ-ПЦР проведено исследование представленности транскриптов широкого спектра генов иммунного ответа (цитокины IL1B, IL2, IL4, IL6, IL8, IL10, IL12A, IL12B, IL15, IL18, IL23, TNF, TGFB1, IFNG, LIF, VEGFA изоформы 121, 165, 189), транскрипционные факторы (TBX21, GATA3, RORC, Foxp3), толл-подобные-рецепторы (TLR2, TLR4, TLR9), клеточные маркеры иммунной системы (IL2Ra, CD45, CD68, CD69), а также гранулизин GNLY). Выбраны наиболее информативные маркеры воспалительного процесса при вагините (TNF, IL18, TLR4, GATA3) и хроническом эндометрите (IL1B, IL2, IL10, Foxp3, TLR9, IL2Ra).
    Впервые применен способ интегральной оценки представленности транскриптов генов иммунного ответа при вагинитах и хроническом эндометрите, позволивший охарактеризовать состояние локального иммунитета и предложить новый молекулярно-генетический метод определения воспалительных процессов слизистой влагалища и эндометрия.
    Впервые при исследовании транскрипционных профилей использован метод определения индекса соотношения уровня экспрессии генов, позволяющий осуществлять анализ без нормировки на референсные гены, что существенно упрощает и снижает стоимость исследования, делает его доступным для рутинной диагностики.
    Впервые получены данные об ассоциации Lactobacillus iners с состоянием локального иммунитета: у условно здоровых женщин доминирование L. iners в составе лактофлоры приводит к повышению уровня экспрессии мРНК генов IL8, TLR4, IL10, CD69, CD45 и снижению уровня экспрессии мРНК IL18 по сравнению с образцами, в которых доминирует L. crispatus.
    Определены генетические предикторы предрасположенности к развитию вагинитов. Впервые установлено, что генетическая предрасположенность к пониженной экспрессии TNF-a и TGF-01, обусловленная генотипом GG локуса TNF -238 G>A и генотипом СС локуса TGFB1 -509 C>T, является фактором риска развития вагинита.
    Научно-практическая значимость
    Представленная работа является фундаментально-прикладным исследованием, результаты которого имеют важное значение для развития как фундаментальных, так и прикладных аспектов иммунологии, молекулярной биологи и медицины.
    Созданный в ходе работы методический подход позволяет получить более полную информацию об активности генов иммунной системы при воздействии на организм женщин биотических факторов (бактерий, грибов, вирусов) при вагинитах и хроническом эндометрите.
    Определены перспективы использования комплексного подхода к диагностике воспалительных заболеваний органов женской репродуктивной системы в гинекологической практике для объективной оценки локальных воспалительных реакций, индивидуального прогноза развития заболевания, для количественного определения микроорганизмов с целью выбора оптимальных схем терапии. В акушерской практике предлагаемый подход может быть использован для предупреждения и профилактики родовых и
    послеродовых осложнений.
    В работе использована отечественная приборная и технологическая база с целью импортозамещения в области инновационных прикладных молекулярно-генетических исследований.
    По результатам диссертационной работы поданы 2 заявки на патент и 1 на регистрационное удостоверение:
    • Патент на изобретение № 201147924 от 25.11.2011 г.: «Способ диагностики неспецифических вагинитов у беременных женщин по уровню экспрессии мРНК генов интерлейкинов во влагалищных мазках». Авторы: Бурменская О.В., Меджидова М.К., Непша О.С., Донников А.Е., Трофимов Д.Ю., Сухих Г.Т.
    • Патент на изобретение № 2013145241 от 9.10.2013 г.: «Способ
    определения локальной воспалительной реакции у женщин репродуктивного возраста по уровню экспрессии мРНК генов цитокинов во влагалищных мазках». Авторы: Бурменская О.В., Байрамова Г.Р., Непша О.С.,
    Тютюнник В.Л., Трофимов Д.Ю., Сухих Г.Т.
    • Регистрационное удостоверение № 3756 от 7.02.2014 г. на Набор реагентов для оценки локальной воспалительной реакции влагалища методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени (Экспрессия генов. Воспаление влагалища) по ТУ производства ООО «Научно-производственного объединение ДНК-Технология».
    Положения, выносимые на защиту
    1. Для исследования функциональной активности генов иммунного ответа при воспалительных заболеваниях органов женской репродуктивной системы разработаны 32 тест-системы на основе количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени.
    2. Воспалительные процессы слизистой влагалища сопровождаются
    изменением транскрипционного профиля иммунокомпетентных клеток:
    повышается экспрессия мРНК генов IL1B, IL8, IL10, CD45, CD69, TLR2,
    17
    TLR4, TNF, снижается экспрессия мРНК генов GATA3, CD68, IL12A, IL18, TGFB1, RORC.
    3. Установлена генетическая предрасположенность к развитию воспалительных заболеваний нижних отделов половых путей у носителей аллеля С локуса TGFB1 -509 C>T и протективная роль аллеля А локуса TNF -238 G>A в развитии вагинитов.
    4. Профиль экспрессии генов иммунного ответа в эндометрии зависит от фазы менструального цикла и наличия воспаления. При полном симптомокомплексе хронического эндометрита и лимфоидной инфильтрации стромы эндометрия повышена экспрессия мРНК генов IL1B, IL6, IL8, IL10, IL12A, TNF, TGFB1, Foxp3, IL2Ra, LIF, TLR9, VEGFA, TLR2. Склерозирование сосудов и фиброз стромы эндометрия сопровождаются более выраженным изменением цитокинового каскада: повышается экспрессия мРНК генов IL1B, IL6, IL8, IL12A, TGFB1, Foxp3, IL2Ra, LIF, TLR9, VEGFA, TLR2, IL18, IFNG и TLR4.
    5. Определены ассоциации различных видов лактобактерий с состоянием микробиоты влагалища и местного иммунитета: у условно здоровых женщин доминирование L. iners в составе лактофлоры приводит к повышению уровня экспрессии мРНК генов IL8, TLR4, IL10, CD69, CD45 и снижению IL18.
    6. При хроническом эндометрите в полости матки определена ведущая роль бактериального фона, обусловленного условно-патогенными микроорганизмами (Enterobacteriaceae, Gardnerella vaginalis/ Prevotella spp./ Porphyromonas spp., Ureaplasma spp).
    7. Предложены способы оценки функционального состояния местного иммунитета при вагинитах и хроническом эндометрите с фиброзом стромы эндометрия по транскрипционному профилю генов иммунного ответа, основанные на методах многофакторного анализа.
    Апробация работы
    Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на Всероссийских и Международных конгрессах, конференциях, съездах и симпозиумах: итоговая конференция по результатам выполнения
    мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2007 г.); XI и XII Всероссийские научные форумы «Мать и дитя» (Москва, 2010 г., 2011 г.); VI Региональный научный форум «Мать и дитя» (Ростов-на-Дону, 2012 г.); Всероссийский конгресс «Амбулаторно¬поликлиническая практика: проблемы и перспективы» (Москва, 2011 г.); III и IV междисциплинарные научно-практические конференции «Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клинико¬лабораторная диагностика и терапия» (Санкт-Петербург, 2010 г.; Москва,
    2011 г.); 54 научная конференция МФТИ «Проблемы фундаментальных и
    прикладных естественных и технических наук в современном
    информационном обществе. Молекулярная и биологическая физика». (Москва, 2011 г.); XXIV Международный Конгресс c курсом эндоскопии (Москва, 2011 г.); V и VI Международный конгресс по репродуктивной медицине «Репродуктивное здоровье семьи» (Москва, 2011 г., 2012 г.); V Российская конференция "Иммунология репродукции. Теоретические и клинические аспекты" (Иваново, 2012 г.); 7 и 8 Европейские конгрессы по иммунологии репродукции (Афины, Греция, 2009 г.; Мюнхен, Германия, 2010 г.); 14 Всемирный конгресс по репродукции человека Австрия, 2011 г.); 4 Международный конгресс IVI-клиник (Валенсия, Испания, 2011 г.); I Конференция по биомаркерам в репродуктивной медицине: возникновение нового направления исследования (Валенсия, Испания, 2012 г.); Всемирный конгресс по гинекологии, бесплодию и перинатологии (Барселона, Испания,
    2012 г.).
    Диссертация частично выполнена в рамках работ по Государственному контракту Министерства образования и науки РФ №16.522.12.2009 от 29 сентября 2011 года и Государственному контракту Министерства образования и науки РФ №16.512.11.2093 от 22 февраля 2011 года.
    Публикации
    По теме диссертации опубликованы 54 печатные работы, в том числе 30 статей в 11 рецензируемых научных изданиях, 3 патента, 21 публикация в материалах отечественных и международных конференций и конгрессов.
    Объем и структура диссертации
    Диссертация изложена на 249 страницах машинописного текста, содержит 32 таблицы, 46 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, описания результатов исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Библиография включает 336 источников, из них 60 - на русском, 276 - на иностранных языках.
    Личный вклад автора
    Личный вклад автора состоит во включенном участии на всех этапах процесса, непосредственном участии соискателя в получении исходных данных и научных экспериментах, личном участии в апробации результатов исследования, обработке и интерпретации экспериментальных данных, выполненных лично автором, подготовке основных публикаций по выполненной работе.
  • Список литературы:
  • ВЫВОДЫ
    1. Для оценки транскрипционных профилей генов иммунного ответа разработаны 32 тест-системы на основе метода ОТ-ПЦР в реальном времени (IL1B, IL2, IL4, IL6, IL8, IL10, IL12A, IL12B, IL15, IL18, IL23, TNF, TGFB1, IFNG, LIF, VEGFA изоформы 121, 165, 189, TBX21, GATA3, RORC, Foxp3, TLR2, TLR4, TLR9, IL2Ra, CD45, CD68, B2M, HPRT1, TBP и GUSB).
    2. Воспалительные процессы слизистой влагалища сопровождаются изменением транскрипционного профиля иммунокомпетентных клеток: повышается экспрессия мРНК генов IL1B, IL8, IL10, CD45, CD69, TLR2, TLR4, TNF от 1,5 до 9 раз (р<0,05), снижается экспрессия мРНК генов GATA3, CD68, IL12A, IL18, TGFB1, RORC от 2,2 до 10 раз (p<0,001).
    3. Установлена генетическая предрасположенность к развитию воспалительных заболеваний нижних отделов половых путей у носителей генотипа СС локуса TGFB1 -509 C>T (OR=2,3(1,2-4,4), p=0,016, аутосомно- рецессивная модель) и протективная роль аллеля А локуса TNF -238 G>A в развитии воспалительных заболеваний нижних отделов половых путей (OR=0,21 (0,07-0,68), p=0,004, аутосомно-доминантная модель).
    4. Профиль экспрессии генов иммунного ответа в эндометрии зависит от фазы менструального цикла и наличия воспаления. При полном симптомокомплексе хронического эндометрита и лимфоидной инфильтрации стромы эндометрия повышен уровень экспрессии мРНК генов IL1B, IL6, TNF, LIF, IL10, TLR9, TGFB1, IL12A, IL2Ra, VEGFA от 1,5 до 2,9 раз (р<0,05). Склерозирование сосудов и фиброз стромы эндометрия сопровождаются более выраженным изменением цитокинового каскада: повышается экспрессия мРНК генов IL1B, IL6, TNF, IL8, LIF, IL10, TLR9, TGFB1, IL12A, IL18, IFNG, TLR2, Foxp3, IL2Ra, VEGF121, TLR4 от 1,7 до 16,6 раз (р<0,05).
    5. Преобладание L. crispatus в составе лактофлоры ассоциировано с нормальным состоянием микробиоты влагалища. Доминирование в составе нормофлоры L. iners чаще отмечено при вагинитах (OR=4,4 (1,9-9,5), p=2,2x10-4), L. gasseri - при бактериальном вагинозе (OR=5,4 (3,1-13,6), p=1,3x10-4). У условно здоровых женщин при доминировании L. iners в составе лактофлоры повышены уровни экспрессии мРНК генов IL8, TLR4, IL10, CD69, CD45 от 1,7 до 3,8 раза (p<0,05) и снижен IL18 в 1,7 (p=0,005) раза по сравнению с образцами, в которых доминирует L. crispatus.
    6. При хроническом эндометрите общая бактериальная обсемененность полости матки составляет около 104 ГЭ/мл. Чаще всего флора представлена лактобактериями и условно-патогенными микроорганизмами, такими как Enterobacteriaceae (25,3%), Gardnerella vaginalis / Prevotellaspp / Porphyromonas spp. (17,7%), Ureaplasma spp. (15,2%).
    7. К практическому использованию предложен способ оценки вероятности наличия воспалительного процесса нижних отделов половых путей по двум индексам соотношения экспрессии мРНК 4 генов: [TNF]/[IL18] и [TLR4]/[GATA3]. Чувствительность и специфичность предложенного метода составляет 95,4% и 94,5% соответственно.
    8. К практическому использованию предложен способ оценки фиброза стромы эндометрия. Данная форма хронического эндометрита может быть определена по 3 индексам отношения экспрессии мРНК 6 генов: [IL1B]/[IL2], [IL10]/[Foxp3] и [TLR9]/[IL2Ra]. Чувствительность и специфичность предложенного метода составляет 93,3% и 100% соответственно.
    9. Разработан комплексный подход к диагностике вагинитов и хронического эндометрита, установлены наиболее показательные молекулярно-генетические маркеры воспалительного процесса, включающие количественную идентификацию широкого спектра микроорганизмов (30 маркеров), определение транскрипционного профиля генов иммунной системы (4 маркера при вагинитах и 6 маркеров при хроническом эндометрите) и генетические особенности организма (2 полиморфизма генов цитокинов).
  • Стоимость доставки:
  • 230.00 руб


ПОИСК ДИССЕРТАЦИИ, АВТОРЕФЕРАТА ИЛИ СТАТЬИ


Доставка любой диссертации из России и Украины