Райгородская Мария Павловна. Влияние маркера стволовых опухолевых клеток CD24 и гипоксии на свойства клеток колоректального рака

Короткий опис

Райгородская Мария Павловна. Влияние маркера стволовых опухолевых клеток CD24 и гипоксии на свойства клеток колоректального рака;[Место защиты: ФГБУН Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук], 2021

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ
УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ
«НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ
«ВЫСШАЯ ШКОЛА ЭКОНОМИКИ»
На правах рукописи
Райгородская Мария Павловна
ВЛИЯНИЕ МАРКЕРА СТВОЛОВЫХ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК CD24
И ГИПОКСИИ НА СВОЙСТВА КЛЕТОК КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА
1.5.3 - Молекулярная биология
Диссертация
на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН Тоневицкий Александр Григорьевич
Москва - 2022
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1 Колоректальный рак 10
1.1.1 Эпидемиология колоректального рака 10
1.1.2 Молекулярно-генетические аспекты возникновения колоректального рака 11
1.2 Г ипоксия и её влияние на опухолевые клетки 14
1.3 Метастазирование опухоли 18
1.4 МикроРНК и белки-аргонавты 22
1.5 Изоформы микроРНК и их роль в онкогенезе 26
1.6 CD24 - маркер стволовых опухолевых клеток 29
1.7 Ламинины - ключевые компоненты базальной мембраны 34
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 39
2.1 Материалы 39
2.2 Методы 41
2.2.1 Выбор клеточной модели колоректального рака 41
2.2.2 Культивирование клеток HT-29 41
2.2.3 Индукция гипоксии 42
2.2.4 Лизирование клеток HT-29 42
2.2.5 Иммунопреципитация 43
2.2.6 Вестерн-блоттинг 44
2.2.7 Выделение РНК 46
2.2.8 Обратная транскрипция 46
2.2.9 Подбор праймеров и расчет их эффективности 47
2.2.10 Полимеразная цепная реакция в реальном времени 52
2.2.11 Секвенирование мРНК 53
2.2.12 Секвенирование микроРНК 53
2.2.13 Обработка результатов секвенирования 53
2.2.14 Нокдаун CD24 54
2.2.15 Проточная цитометрия 55
2.2.16 Иммуногистохимический анализ 55
2.2.17 Анализ клеточной миграции 56
2.2.18 Анализ клеточной пролиферации 57
2.2.19 Анализ инвазионных свойств клеток 57
2.2.20 Анализ уровня апоптоза 58
2.2.21 Анализ транскриптомных данных пациентов с колоректальным раком из
базы данных TCGA-COAD 58
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 59
3.1 Влияние различных видов гипоксии на свойства клеток колоректального
рака 59
3.1.1 Оценка эффективности гипоксии в клетках колоректального рака 59
3.1.2 Изменение транскриптома клеток колоректального рака под воздействием
гипоксии 60
3.1.3 Ламинин 332 индуцирует миграцию клеток колоректального рака 62
3.1.4 Изменение экспрессии микроРНК в клетках колоректального рака под
воздействием гипоксии 63
3.1.5 Изоформы микроРНК 67
3.1.6 Изменение экспрессии генов-маркеров стволовости в клетках
колоректального рака под воздействием гипоксии 71
3.2 Экспрессия CD24 в первичных опухолях и метастазах колоректального рака 72
3.3 Значимость экспрессии CD24 для прогноза общей выживаемости пациентов
с колоректальным раком 75
3.4 Влияние нокдауна CD24 на пролиферативную, инвазивную и
миграционную активность клеток колоректальной карциномы 79
3.5 Влияние нокдауна CD24 на экспрессию белков и микроРНК в клетках
колоректальной карциномы 84
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 88
ВЫВОДЫ 96
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 97
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 98

Список літератури

ВЫВОДЫ
1. В результате химически индуцируемого гипоксического воздействия в клетках колоректальной карциномы растет экспрессия таких групп генов, как гены рибосомальных и протеасомных белков, убиквитинов, а также белков главного комплекса гистосовместимости, что можно расценивать как активацию противоопухолевого иммунитета. Кроме того, в клетках HT-29 при гипоксии в 4,5-5,5 раза растет экспрессия генов всех цепей ламинина 332, а также более чем в два раза снижается экспрессия гена адгезии CD24, известного как маркер стволовых опухолевых клеток.
2. Нокдаун CD24 в клетках колоректального рака HT-29 приводит к усилению миграции клеток более чем в два раза, при этом пролиферационная активность и уровень апоптоза достоверно не изменяются. Кроме того, нокдаун CD24 снижает экспрессию генов фокальной адгезии, в частности ламининов, а также маркеров стволовых опухолевых клеток.
3. Уровень экспрессии как мРНК, так и белка CD24 имеет прогностическую значимость для пациентов с колоректальным раком, при этом низкая экспрессия CD24 во всех случаях является неблагоприятным прогностическим фактором. Впервые показано, что прогностической значимостью на уровне белка обладает только экспрессия CD24 в апикальной мембране клеток первичной опухоли и в цитоплазме клеток метастазов.
4. Нокдаун CD24 приводит к изменению профиля экспрессии микроРНК клеток колоректального рака в рамках ксенографтной модели, в том числе повышая экспрессию членов семейства микроРНК hsa-let-7 в 1,2-1,6 раза. Кроме того, впервые показана роль неканонических изоформ микроРНК в формировании клеточного ответа на гипоксическое воздействие.
5. Ламинин 332 является индуктором миграции клеток колоректальной аденокарциномы, и повышение его экспрессии может быть одним из вероятных механизмов, лежащих в основе усиления миграции клеток при нокдауне CD24.