ВПЛИВ АУТОЛОГІЧНИХ МЕЗЕНХІМАЛЬНИХ СТОВБУРОВИХ КЛІТИН НА РЕГЕНЕРАЦІЮ СУГЛОБОВОГО ХРЯЩА (експериментальне дослідження)

Краткое содержание

Матеріали та методи дослідження. Експериментальні дослідження виконані на базі віварію Інституту проблем кріобіології та кріомедицини НАН України (м. Харків), відділу патоморфології з експериментально-біологічним відділенням та відділу спортивної та балетної травми ДУ “Інститут травматології та ортопедії” (м. Київ).

Робота виконана на 30 дорослих кролях-самцях масою 3000 ± 250 г. У всіх тварин під кетаміновим наркозом в умовах операційної парапателярно розтинали суглобову капсулу колінного суглоба та скальпелем у фронтальній площині по надколінковій поверхні стегнової кістки наносили, з використанням шаблону, стандартне, повношарове пошкодження суглобового хряща розміром 6 на 3 мм із збереженням цілісності підхрящової кісткової пластинки. Після цього рану промивали водним розчином хлоргексидину та пошарово зашивали м’які тканини. Усі маніпуляції з тваринами проводили згідно з міжнародними правилами про гуманне відношення до тварин (ETS 123, 1986).

Усі тварини до початку та в процесі дослідження знаходились в умовах віварію на звичайному харчовому раціоні. Утримання та харчування тварин здійснювали відповідно з "Санітарними правилами створення, обладнання та утримання експериментально-біологічних клінік (віваріїв)" від 06.04.1973 р. та доповнень від 04.12.1978 р. до Наказу МОЗ СРСР № 163 від 10.03.1966 р. "Про добові норми харчування тварин та продуценти". У період акліматизації (два тижні) і під час експерименту тварини знаходились у віварії при температурі 18 – 22 °С, вологості 50 – 60 %, природному світловому режимі "день - ніч". Підбір тварин та формування груп проводили за методом випадкових чисел.

На лабораторних тваринах проведено два дослідження. У першому дослідженні вивчали перебіг репаративного хондрогенезу у травматичному дефекті суглобового хряща після введення культури аутологічних МСК кісткового мозку з різним ступенем хондрогенного диференціювання. Тварин розділили на три серії по п’ять тварин у кожній серії.

Тваринам першої серії (5 тварин) на 3 день після травмування суглобового хряща в порожнину оперованого колінного суглоба вводили по 0,25 мл сольового фізіологічного розчину (плацебо).

Тваринам другої серії (5 тварин) на 3 день вводили по 10⁶ аутологічних МСК кісткового мозку.

Тваринам третьої серії (5 тварин) на 3 день вводили по 10⁶ аутологічних МСК кісткового мозку із попередньо спрямованим хондрогенним диференціюванням.

Джерелом мезенхімальних стовбурових клітин була кісткова спонгіозна тканина, яка механічним шляхом забиралася з клубової кістки у вигляді фрагментів діаметром 3 – 4 мм за допомогою кісткових кусачок. Культивування та хондрогенне диференціювання аутологічних МСК кісткового мозку здійснювали за загально прийнятою методикою.

Ядровмісні клітини виділяли в градієнті щільності фікола, ресуспендували в 20 мл культурального середовища. Ядерні клітини підраховували в камері Горяєва з використанням 3% оцтової кислоти та висівали в культуральний посуд площею 180 см². Використовували середовище наступного складу: альфа-МЕМ, доповненої 15% ембріональною сироваткою великої рогатої худоби, 2 мМ L-глутаміна, 50 од/мл пеніциліну та 50 мг/мл стрептоміцину. Після 24-годинної інкубації при температурі 37^○С с 5% СО₂ не прикріплені клітини видаляли, прикріплені двічі відмивали фосфатно-сольовим буфером та культивували на протязі 4-11 днів. Першу заміну середовища виконували через 48 год. культивування і далі – через кожні 3 доби. Після досягнення конфлюенту клітини знімали 0,25% розчином трипсину та 1 мМ розчином ЕДТА на протязі 5 хв при температурі 37^○С та знову висівали в культуральні флакони в концентрації 3–50 клітин/см² та здійснювали подальше культивування.

Для хондрогенного диференціювання використовували наступний метод: мезенхімальні стовбурові клітини у кількості до 200 000 поміщали в 15 мл пропіленову пробірку та осаджували за допомогою центрифугування при 450 g на протязі 10 хв. Осадженні клітини культивувалися 21 день в хондрогенному середовищі Дюльбекко МЕМ з високим вмістом (25 мМ) глюкози, 10 нг/мл трансформуючого ростового фактора beta (TGF-β), 10^{-7 М дексаметазона, 50 μг/мл аскорбат-2-фосфату, 40 μг/мл проліну, 100 μг/мл пірувату у безсироватковому середовищі.}

У другому дослідженні вивчали механізм впливу культури недиференційованих аутологічних мезенхімальних стовбурових клітин кісткового мозку на процеси регенерації суглобового хряща. Для цього проводили їх мічення червоним флюоресцентним зондом РКН-26 (Sigma, США) та вводили на 3-й день після нанесення дефекту в порожнину травмованого суглоба 15 тваринам.

Для цього мезенхімальні стовбурові клітини знімали 0,25% розчином трипсину та 1мМ розчином ЭДТА протягом 5 хвилин при температурі 37^○С, триразово відмивали у середовищі без сироватки та ресуспендували у середовищі у відношенні 1:2. Потім змішували з рівним об´ємом розчина РКН-26 (Sigma) та витримували 5 хвилин при кімнатній температурі. Для зупинки реакції застосовували середовище з вмістом сироватки. Після інгібіції реакції клітини знову відмивали від фарбника триразовим центрифугуванням. Відмиті та ресуспендовані клітини застосовували для введення у місце пошкодження.

За всіма тваринами проводили клінічне спостереження. Із досліду кролів першої – третьої серій виводили шляхом застосування летальних доз ефіру для наркозу в строки 45 діб після травми. Тварин, яким імплантували мічені мезенхімальні стовбурові клітини, виводили із досліду через 7, 14 та 21 добу після введення клітин.

 Для морфологічного дослідження брали колінний суглоб. Після фіксації в 10% розчині формаліну проводили декальцинацію препаратів у 8% розчині азотної кислоти, зневоднювали та знежирювали в ацетонах і спиртах наростаючої міцності. Шматочки заливали в целоїдин та отримували в горизонтальній площині гістологічні зрізи, які фарбували гематоксиліном та еозином, а також пікрофуксином за ван Гізоном.

Якість репаративних процесів в ділянці дефекту оцінювали, враховуючи поверхневу будову регенерату, морфологію новоутвореної тканини, структури її матриксу, характер та життєздатність хондроцитів, стан кальцифікованої зони хряща та підхрящевої кісткової пластинки, наявність зон вторинної осифікації та кровоносних судин.

Для оцінки використовували альтернативну OS шкалу (Roberts S., 2006) та ICRS шкалу (Mainil-Varlet Р., 2003).

Використовуючи альтернативну OS шкалу, якість регенерату вважали дуже поганою при отриманні сумарного балу – 0 та оптимальною при сумарно отриманому балі – 10. Чотирибальна ІCRS шкала використовується для оцінки кожного показника індивідуально.

Вираженість дегенеративно-дистрофічного процесу в колінному суглобі оцінювали за якістю та поширеністю прояву патологічних змін структури з боку суглобового хряща. За основу взята модифікована схема оцінки, яка запропонована методичними рекомендаціями з експериментальних досліджень та клінічного вивчення протиартрозних (хондромоделюючих) лікарських засобів, затверджених Фармкомітетом МОЗ України, та Yoshioka M. et al., а саме: зміна форми та зменшення кількості хондроцитів суглобового хряща (дистрофія, некроз); вогнищева проліферація хондроцитів; дезорганізація, ерозія, розволокнення та поява тріщин у суглобовому хрящі; оголення підхрящової кісткової пластинки та зміни з боку субхондріальної кістки; розповсюдженість патологічних змін з боку суглобового хряща.

Запропонована чотирибальна система оцінки ступеня ураження, в основу якої покладено розповсюдженість відносно місця травми (мм) та тяжкість проявлення (+, ++, +++, ++++) визначених критеріїв патологічних змін з боку суглобового хряща медіальніше та латеральніше від нанесеного пошкодження: І ступінь – розповсюдженість обмежена краями пошкодження (до 0,5 мм) та тяжкість проявлення +, II ступінь – від 0,6 до 1 мм та тяжкість проявлення ++, III ступінь – розповсюдженість від 1 до 2 мм та тяжкість проявлення +++ і IV ступінь – розповсюдженість патологічних змін понад 2 мм та тяжкість їх прояву ++++.

Для відслідковування мічених PKH-26 клітин готували зрізи на кріостаті та застосовували флюоресцентну мікроскопію.

Для вивчення впливу аутологічних мезенхімальних стовбурових клітин кісткового мозку при травматичних пошкодженнях суглобового хряща, в сироватці крові експериментальних тварин визначали наступні біохімічні показники: активність колагенази, фракції гідроксипроліну та глікозаміногліканів. При вивченні цих показників використовували наступні методи: активність колагенази визначали за методом Lindy S., Halme J. Вміст глікозаміногліканів (г/л) в сироватці крові визначали за методом Кляцкіна С.А. та Ліфшіц Р.І. Фракції гідроксипроліна, мкмоль/л, виділяли по Frey S., а гідроксипролін в них визначали за Stegemann H.

Для аналізу отриманих даних та виявлення вірогідних змін показників, що були отримані при застосуванні вищевказаних методів, застосовували статистичний аналіз за допомогою комп’ютерних програм “Microsoft Excel” та “Statistica 5” з використанням параметричних критеріїв. Результати представленні у вигляді середніх та їх помилок (M±m). Відмінності вважали вірогідними при t > 2 та р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

На сьогоднішній день відомі методи забору аспірату кісткового мозку та культивування в умовах, при яких МСК зберігають здатність до диференціювання в остеобласти, адіпоцити, хондроцити, міоцити та ранні прогенітори нервових клітин. Однак нерідко при культивуванні в стандартних умовах ці клітини втрачають свою проліферативну здатність. Раніше було замічено, що клітини проліферують швидше та максимально зберігають мультипотентність, якщо вони проходять через посів із низькою щільністю.

Із цих спостережень та даних попередніх досліджень випливає, що в експериментальних та практичних цілях необхідно враховувати велику кількість варіацій та параметрів. У наших експериментах ми досліджували деякі із цих факторів культивування та хондрогенного диференціювання аутологічних МСК кісткового мозку та визначили ряд умов отримання клітинних препаратів аутологічних МСК кісткового мозку.

Для визначення впливу щільності посіву на ріст аутологічних МСК кісткового мозку в культурі, вони були посіяні із щільністю 10, 50, 100 та 1000 клітин/см² на культуральний посуд площею 60 см². При цьому було виявлено, що первинна щільність посіву 50 клітин/см², є оптимальною для нарощування необхідної маси клітин в експерименті, та дозволяє зберегти максимальний колонієутворюючий потенціал (здатність формувати колонії із однієї клітини).

Також було доведено, що культура із 7-денною попередньою інкубацією МСК у стандартному середовищі з наступним культивуванням у хондрогенному середовищі має найбільший хондрогенний потенціал, який проявлявся формуванням агрегатів хрящових клітин із найбільшою масою. Хондрогенне диференціювання було підтверджено наявністю протеогліканів у матриксі конгломератів клітин шляхом фарбування толуідіновим блакитним (Fluka). Також виявили маркер хондрогенного диференціювання – колаген ІІ типу, для чого використовували непряму імунофлюоресценцію із застосуванням первинних антитіл (Chemicon MAB 6b3) у розведенні 1:200 та вторинних антитіл, кон’югованих з флюоресцентною міткою FITC (Dako, rabbit anti-mouse FITC-conjugated.

Експериментально-морфологічне дослідження впливу введення в порожнину колінного суглоба культури недиференційованих аутологічних МСК кісткового мозку на репаративний хондрогенез проведено на другій серії тварин. Вивчення впливу культури аутологічних МСК кісткового мозку з попередньо спрямованим хондрогенним диференціюванням проведено на третій серії тварин. Отримані дані порівнювали з даними контрольних спостережень за тваринами, яким внутрішньосуглобово вводили за такою самою схемою та кількістю сольовий фізіологічний розчин (перша серія тварин).

Морфологічні зміни у суглобі вивчали через 45 діб після нанесення механічної травми колінного суглоба.

У тварин першої серії у дефекті суглобового хряща виявили фіброзну тканину з ділянками дистрофії та некрозу. У навколишньому суглобовому хрящі спостерігали прояви дегенеративно-дистрофічного процесу.

         У тварин другої серії виявили формування в ділянці дефекту гіаліноподібної тканини, яка повністю заповнювала травматичний дефект, при обмежених або відсутніх дистрофічних і некротичних змінах у навколишньому суглобовому хрящі.

У тварин третьої серії в ділянці дефекту суглобового хряща спостерігали формування гіаліноподібної тканини з явищами її гіперплазії на фоні явищ дистрофії, некрозу та осередкової проліферації хондроцитів по краях дефекту;

Якість репаративних процесів у місці дефекту оцінювали враховуючи поверхневу будову регенерату, морфологію новоутвореної тканини, структури її матриксу, характер та життєздатність хондроцитів, стан кальцифікованої зони хряща та підхрящової кісткової пластинки, наявність зон вторинної осифікації та кровоносних судин.

Для оцінки використовували альтернативну OS та ICRS шкали.

Використовуючи альтернативну OS шкалу, якість регенерату вважали дуже поганою при отриманні сумарного балу – 0 та оптимальною при сумарно отриманому балі – 10.

За альтернативною OS шкалою якість регенерату в контрольній серії склала 1,2±0,12, при використанні культури недиференційованих аутологічних МСК кісткового мозку – 8.6±0,24, а в серії із застосуванням культури аутологічних МСК кісткового мозку із попередньо спрямованим хондрогенним диференціюванням – 7,6±0,24 (M±m). Отримані дані свідчать про позитивний вплив застосування культури аутологічних МСК кісткового мозку на процеси хондрорепарації, причому якість регенерату була кращою в другій серії тварин, яким вводили культуру недиференційованих аутологічних МСК кісткового мозку (t > 3, p < 0,01).